מימון לפיתוח פיפטה החילוץ נמסר בחלקו על ידי מחקר פנימי מענק פיתוח הוענק DRP.

1. לדוגמא תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות צריך להיות במצב נוזלי. אם המדגם הוא מוצק, מזון למשל, או שרפרף, המדגם צריך להיות תלוי מדיה נוזל כמו מים או פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 500 μL המדגם עם μL 500 של Thiocyanate Guanidine 6M (pH 6.5) בצינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדכא את הנורה של פיפטה חילוץ, לגרש את האוויר הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המדגם כל 1 מ&quot;ל לתוך פיפטה חילוץ, על החומר הסופג, בכך שהוא מאפשר הנורה לאט להרחיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את כלי החילוץ כך את החרוזים sorbent ומסננים מדגם לתוך הנורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את החרוזים sorbent עם מדגם של הנורה נזהרים שלא לגרש את המדגם מתוך פיפטה החילוץ. </li></ol> 2. חומצה הפקת גרעין (איור 1, לוח) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פיפטה חילוץ (פתיחה כלפי מטה) ולגרש את המדגם לתוך הצינור המקורי 1.5 מ&quot;ל. </li> &lt;li&gt; משוך את המדגם כל 1 מ&quot;ל לתוך פיפטה חילוץ, חולפת על פני sorbent, בשיעור מתון, נזהרת לשמור sorbent בצוואר של פיפטה החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את המדגם כולו לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל מדכא את הנורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2 ו -2.3, עובר את המדגם על פי ארבעה sorbent יותר עבור סכום כולל של 5 כרטיסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המעבר על פני 5 sorbent, לגרש את המדגם כל 1 מ&quot;ל לתוך 4mL מאגר חלבון החילוץ (בצינור מ&quot;ל 15 חרוטית), לסגור את הצינור, ומניחים בצד לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את חומצות גרעין מבודדים על ידי העברת 1 מ&quot;ל של אתנול 95% במהלך שלוש פעמים sorbent, חוזר אתנול לצינור המקורי על המעבר הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.6 באמצעות מ&quot;ל 2 1, לשטוף אתנול 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ושחרר את הנורה במשך 5 דקות, עובר באוויר הסביבה ברחבי פיפטה החילוץ לייבש את חומצות גרעין / מיטה sorbent. נגב אתנול שיורית מקצה פיפטה החילוץ uלשיר Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את חומצות גרעין על ידי העברת 250 μL של 10 mM Tris (pH 6.8) במהלך חמש פעמים sorbent. מאגר טריס יכול להיות מוחלף על ידי פתרון אחר כל מימית מתאים כגון PBS. הפתרון שהתקבל מכיל את חומצות גרעין שחולצו. </li></ol> 3. הפקת חלבון (תרשים 1, לוח ב &#39;) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדגם והפקת חלבון צינור המאגר משלב 2.5 ידי היפוך ולהעביר כ 2-3 מ&quot;ל של מדגם זה 5 מ&quot;ל מעל sorbent של טפטפת החילוץ החדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש את המדגם כולו לתוך הצינור אותו חרוטי 15 מ&quot;ל נזהר לשמור sorbent בצוואר של פיפטה החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 ו -3.2, עובר את המדגם על פי 15 sorbent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף sorbent ואת החלבון מחויב להעביר 1 מ&quot;ל של אתנול 95% מעל המיטה sorbent שלוש פעמים, אתנול ולהוציא לתוך הצינור המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.4 באמצעות מ&quot;ל 2 1, לשטוף אתנול 95%. </li><html><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ושחרר את הנורה במשך 5 דקות, עובר באוויר הסביבה ברחבי פיפטה החילוץ לייבש את החלבון / המיטה sorbent. נגב אתנול שיורית מקצה פיפטה החילוץ באמצעות kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את החלבון על ידי העברת 250 μL של PBS על פי חמישה sorbent. מאגר PBS יכול להיות מוחלף על ידי פתרון אחר כל מימית מתאים כגון 10 mM Tris (pH 6.8). הפתרון שהתקבל מכיל את תכולת החלבון של המדגם. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="איור 1 א" /> באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="איור 4" /> באיור 4. תוכן &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

, הכלי chemistries והפרוטוקול המתוארים בדוח זה מייצגים את הדוגמה הידועה הראשונה של מערכת החשמל ללא רב מקרומולקולה, חילוץ, כי יכול להיות מנוצל בתחום מבוססות, הצבע של טיפול יישומים. שני הסוגים מקרומולקולה ניתן ליישם במספר מכשירי אבחון אנליטי או במורד הזרם. כך, למשל, חומצות גרעין בודדים הם בעלי איכות PCR (תרשים 2 ו - 3) ואילו מרכיב החלבון של המדגם הוא immunoreactive (איור 4). ניצול של מערכת זו החילוץ באזורים מוגבלים צנועים או משאב של העולם יכול להפחית באופן דרסטי את נטל המחלה על אוכלוסיות המתגוררות שם. מערכת השאיבה יכולה גם לסייע מעקב תוכניות מחלות ברחבי העולם על ידי מתן השיטה היעילה חזקים עדיין מהיר עלות עיבוד המדגם במקומות צנועים או מרוחק. היבט אחד חשוב שיטת החילוץ שתואר לעיל הוא כיזה יכול להיות שונה על ידי המשתמש. לדוגמה, במקרים שבהם גודל מדגם גדול יותר או פחות מ -500 μLs הראשונים (שלב 1.2), המשתמש יכול להתאים את כמויות של חומרים כימיים בהתאם. כלומר, היחס בין נפח של ריאגנטים את גודל המדגם צריך להישאר קבוע, בעוד כמויות מוחלטות ניתן לשנות. כמו כן, התאמות במספר קטעים מ sorbent יכול להיות גם על פי שיקול דעתו של המשתמש. לדוגמה, אם נפח דגימה גדול יותר משמש, להעביר את המדגם על פני יותר פעמים מאשר sorbent הרשומים (שלבים 2.4 &amp; 3.3) יגדיל את הסיכוי של סוג מקרומולקולה (חומצת גרעין או חלבון) קשר sorbent. הגידול קטעים צריך להגדיל את יעילות ללכוד עד רוויה sorbent הוא הגיע. מצאנו כי הכלי כריה chemistries הקשורים יש מספר מגבלות, המשמעותי ביותר מהם הוא כי כימיה מיצוי החלבון אינה יעילה להחלמה של glycosylated ביותרחלבונים. במקרה של אבחון במורד מטרות חלבון glycosylated, מערכת זו לא יכול להיות אידיאלי עבור זיהוי. בנוסף, הגבולות העליונים והתחתונים של יעילות מיצוי לאף חומצות גרעין או חלבונים עדיין נקבע, ואופטימיזציה מתנהלת על מנת למקסם את יעילות השיקום. פיתוח נוסף של הכלי יהיה להתגבר על פערי ידע הנוכחיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Guanidine Thiocyanate </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109827-1 ליטר </td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

פתוגנים מסורתיים ומתפתחים כגון Escherichia coli Enterohemorrhagic (EHEC), pestis Yersinia, או הפריון מבוססי מחלות הם דאגה משמעותית עבור ממשלות, תעשיות ואנשי מקצוע רפואיים ברחבי העולם. לדוגמה, EHECs, בשילוב עם Shigella, אחראים למותם של כ 325,000 ילדים בכל שנה, והם נפוצים במיוחד בעולם המתפתח בו מעבדה מבוססי זיהוי, נפוץ בארצות הברית, אינו זמין 1. פיתוח והפצה של עלות נמוכה, בתחום מבוססות, הצבע של טיפול כלים כדי לסייע בזיהוי מהיר ו / או אבחון של פתוגנים או סמני המחלה יכולים לשנות באופן משמעותי את התקדמות המחלה ואת הפרוגנוזה לחולה. פיתחנו כלי לבודד חומצות גרעין וחלבונים ממדגם על ידי מיצוי מוצק שלב (SPE) ללא חשמל או הקשורים ציוד מעבדה 2. מקרומולקולות את מבודדות יכול לשמש diagnoSIS או במעבדה קדימה או באמצעות מבוססי בשדה נקודות של טיפול פלטפורמות. חשוב לציין כי שיטה זו מספקת לצורך השוואה ישירה של חומצות גרעין חלבון נתונים ממדגם בלתי מפוצלת, מציע ביטחון דרך אישורו של ניתוח גנטי ו proteomic. כלי הבידוד שלנו מנצל את תקן התעשייה עבור בידוד מוצק בשלב חומצות גרעין, הטכנולוגיה בום, המבודד חומצות גרעין מפתרון מלח chaotropic, בדרך כלל isothiocyanate guanidine, באמצעות קשירה סיליקה מבוססי חלקיקים או מסננים 3. מוצק בשלב כימיה הקניינית של CUBRC החילוץ משמש לטיהור חלבונים מפתרונות מלח chaotropic, במקרה זה, מפסולת או זרימת-thru בעקבות בידוד חומצות גרעין 4. לפי האריזה היטב מאופיין chemistries לפלטפורמה קטן, זול ופשוט, אנו יצרו מערכת ניידת של חומצות גרעין להפקת חלבון זה יכול להתבצע תחת variety של תנאים. חומצות גרעין מבודדים יציבים יכול להיות מועבר למצב שבו הכוח זמין עבור הגברה PCR בעוד תכולת החלבון יכול להיות מנותח באופן מיידי על ידי כף יד או אחרים של מערכת החיסון מבוסס מבחני. זיהוי מהיר של סמני המחלה בתחום יכול לשנות באופן משמעותי את התוצאה של המטופל על ידי הפניית כמובן נכון של הטיפול בשלב מוקדם יותר של התקדמות המחלה. כלי בשיטה המתוארת מתאימים לשימוש עם כל גורם כמעט זיהומיות ולהציע למשתמש יתירות של רב מקרומולקולה ניתוחים מסוג תוך צמצום הנטל הלוגיסטי שלהם.

בידוד חומצות גרעין: חומצות גרעין הן מבודדות PCR amplifiable וללא זיהום חלבון. דוגמה 1: חומצות גרעין שנמצאו מתאימים לשימוש ב PCR יישומים מבוססי. לדוגמה, תרשים 2 מציג הגברה של גנים Shiga הרעלן הקשורים Enterohemorrhagic א &#39; coli O157: H7 המתח אדי-933 (ATCC # 35150) מההליך חומצה / חלבון גרעין החילוץ באמצעות פיפטה החילוץ. גנים את הרעלן Shiga stx 1 ו 2 stx נמצאים על bacteriophage למבדה כמו ממוזג ופגום bacteriophage זו ואחרות Enterohemorrhagic א &#39; קולי זנים הנתון לשליטתו של היזם P R 5 6 7 8. ההפעלה של התגובה SOS ב א coli גורם prophage ואינדוקציה / או ייצור הרעלן 9. שמנו מנוצל גירסה שונה של assay PCR מרובב על ידי פנג et al. 11 לזהות stx 1 ו - 2 גנים stx בתרבות והן דגימות שפכים חדים. מסלולים A ו-B באיור 2 מראים את התוצאות של הגברה PCR מדגם תרבות מעובד (מסלול) ו מדגם תרבות מעובד (מסלול ב &#39;). תוצאות אלו משמעות זהה כמעט אין אובדן הנאמנות של חומצות גרעין מעובדים או מבודד. אנו מוגבר הבא ביוב גולמי המחודד (נתיב ד &#39;) או חומצות גרעין מבודדים מן הביוב המחודד (נתיבי E &amp; F). נתונים אלו מעידים כי חומצות גרעין בודדים הביא הגברה גדולה יותר לעומת הלא מבודדים חומצות גרעין מ דגימות שפכים חדים. לפיכך, אנו מסיקים כי בין אם מעכבי ה-PCR נמצא באופן טבעי הביוב הוסרו על בידוד או חומצות גרעין רוכזו על הבידוד. השילוב של שני אלה השערות הוא גם אפשרי. ספקטרוסקופיה אולטרה סגול שימש הבא כדי להראות את חומצות גרעין בודדים היו חופשיים יחסית Oחלבון ו מזהם. איור 3 מציג את ספקטרום UV של 2 א ​​&#39; coli O157: H7 גרעין חומצה עקירות, בידוד שכותרתו א &#39;וב&#39; בידוד, לעומת הספקטרום מנורמל של התרבות חיידקים, שכותרתו בידוד מראש. ספקטרום UV של חומצות גרעין מבודדים דומה את הספקטרום של חומצות גרעין טהור, בעל היחס מחושב של ספיגת בין 260 ננומטר ו -280 ננומטר המתקרבים 1.8 10. נתונים אלו מראים כי יש מעט מאוד חלבון זיהום בשבריר חומצות גרעין התאושש תוך שימוש בטכניקה המתוארת. בידוד חלבון: חלבון התאושש הניסוי חומצה / חלבון גרעין הבידוד הוא immunoreactive וזהה electrophoretically לחלבון טהור. דוגמא 2: חלק החלבון המבודד היה מוחל על ה RapidChek קולי O157 לרוחב תזרים assay רצועות (SDIX, Inc). בקרת להראות הזדהות חיובית בכל דגימות מחסה א &#39; coli<html> O157, עם או בלי אינדוקציה STX (איור 4, נתיבי B ו-C, בהתאמה). הנתונים גם מראים איור 4 תוצאות חיוביות עבור אותם דגימות מחסה א &#39; coli O157 שעובדו על חומצות גרעין ולאחר מכן חלבון בעזרת פיפטה החילוץ. נתונים אלו מראים כי חלבון מבודד מכל מדגם הוא immunoreactive ובכך מפעילה תגובה חיובית. הגברה PCR (כמתואר דוגמה 1) בוצע על דגימות חלבון להראות כי חלק החלבון המבודד היה נטול זיהום חומצות גרעין. את התוצאות של ניסויים אלה היו שליליות על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה. לכן, אנו מגיעים למסקנה כי תכולת החלבון המדגם הופרד זיהום חומצות גרעין. תוצאות אלו, נלקח עם כל אלה תיאר את המופע צעד בידוד גרעין חומצה כי חומצות גרעין ותוכן חלבון מבודדים צעדים שהכינו. t &quot;&gt; דוגמה 3:. חלבון מבודד מתאים אלקטרופורזה 10 איור 5 מתאר coomassie מוכתם ג&#39;ל acrylamide 8% עמוסה BSA (איור 5, נתיבי &amp; C) BSA מבודד isothiocyanate guanidine 6M באמצעות מיצוי פיפטה הקשורים פרוטוקול. ניידות electrophoretic של חלבון מבודד זהה לזה של דגימות בקרה. כך אנו מסיקים כי תהליך החילוץ אינו משנה את מבנה קוולנטי של חלבון מבודד. <img alt="איור 1 א" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> איור 1, פאנל: תיאור של הליך מיצוי טיפוסי גרעין חומצה המדגם הוא מעורבב עם thiocyanate guanidine 6M בצינור המדגם עברו במהלך חמש פעמים sorbent.. לאחר המעבר האחרון, מדגם מתווסף למאגר מיצוי חלבון. חומצות גרעין sorbent ואת כפות נשטפים פעמיים עם אתנול. המדגם הוא אז באוויר DRied ו eluted מ sorbent. <img alt="איור 1 ב" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> תרשים 1, לוח ב &#39;: תיאור של הליך חלבון אופייני החילוץ מדגם מעורבב עם מאגר חלבון במנותק שלב 1, איור 1, פאנל הוא חלף על פני sorbent של טפטפת ממוצא 2 15 פעמים.. המשך התהליך זהה לזה של פרוטוקול חומצות גרעין החילוץ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> איור 2:. תמונה שלילית של ברומיד צבעונית ethidium agarose ג&#39;ל מרובב Shiga רעלן 1 ו 2 הגברה ניסוי גנטי בוצע באמצעות דגימות תרבות נתיבים (A ו-B) או דוגמאות שפכים גולמיים מעוטרות א &#39; coli O157: H7 (נתיבי D, E ו-F). הדגימות היו או להוסיף ישירות לצינור התגובה PCR (נתיבי A ו-D) או את הדוגמאות עובדו באמצעות proces בידודs ואת חומצות גרעין שחולצו נוספו צינור התגובה PCR (דוגמאות B, E ו-F). פרוטוקול ה-PCR היא שינוי של 1 תיאר פנג ואח&#39; 11. שינוי שלנו ממוקד רק אלה מוגבר על ידי stx 1 (הלהקה התחתון) ו stx 2 (הלהקה העליון) זוגות פריימר, שומטת את כל זוגות פריימר אחרים. ליין C הוא סולם מ 1KB BioRad. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> איור 3: תוצאות ספקטרוסקופיה UV של א &#39; coli O157: H7 חומצות גרעין בודד באמצעות פיפטה החילוץ דיווחו על חומצות גרעין בודדים מסומנים בידוד A ו-B בידוד.. ספקטרום UV של המדגם נבדק גם לפני מיצוי חומצות גרעין מתויג מראש בידוד. ספקטרום התקבלו באמצעות U3010 Hitachi ספקטרופוטומטר חבילת הקשורים תוכנה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; איור 4:. צילום צבע של רצועות הבדיקה RapidChek תוכן החלבון של דגימות בשימוש בתרשים 2 היה מבודד באמצעות פיפטה החילוץ ונבדקו על תגובתיות-חיסונית על ידי assay הזרימה לרוחב. נתיבי AC הם פקדים לא מעובדים, כלומר, תרבית תאים זה התווסף פס הבדיקה ללא חומצות גרעין או מיצוי חלבון. ליין הוא ה קולי BL21 DE3 pLysS כביקורת שלילית, Lanes B ו-C הצג E. coli O157: H7, כי היה מטופל (ב), או שטופלו mitomycin C למשך 4 שעות (C). מסלולים ד עד h להראות את התוצאות של הוספת חלבון המופק על מקלוני הבדיקה לרוחב הזרימה. נתיבי D ו-E נבדקו באמצעות תמצית חלבון מן ה coli BL21 DE3 pLysS או בלי (ד &#39;) או עם mitomycin C טיפול (ה) לצורך ביקורת שלילית. נתיבי FH להציג את התוצאות כאשר חלבון המופק מן ה coli O157: H7 היה בשימוש. חלבון היה שחולצו מן מטופל (F), או משעה 2 (ג) או 4 שעות (H) mitomycin תרבויות ג שטופלו.תוצאות חיוביות לייצר קו אדום כפול. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> איור 5:. צילום צבעונית Coomassie SDS-PAGE BSA היה מבודד מן הפתרון באמצעות פיפטה החילוץ ופרוטוקולים המתוארים. מסלולים A ו-C הם נתיבים שליטה של ​​250 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 500 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בהתאמה. נתיבי B ו-D מתארים BSA התאושש פתרונות המכילים ריכוז זהה בקרות בהתאמה.

Watch this Scientific Journal Video about Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation at JoVE.com

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  CUBRC, Inc.. כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.

Video: Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...