The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Ethik-Anweisung: Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren beinhalten ausschließlich mit Drosophila melanogaster arbeiten und unterliegen nicht der Tierschutzgesetze in Deutschland. 1. Herstellung der Medien, Tools und Fliegen <ol><li> Bereiten modifizierten handelsüblichen pulverförmigen M3-Wachstums-Medium ohne Kaliumbicarbonat 17. ACHTUNG: Reizt die Augen und die Haut. Ergänzung des Mediums mit 10% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Verwenden Sie hitzeinaktiviert und insekten Kultur-geprüft fetales Rinderserum für beste Ergebnisse. Filtern des Vollmedium (nachstehend als Medium bezeichnet), durch ein 0,2 um-Flaschenaufsatz-Filter-Einheit und Speicher in Aliquots bei -20 ° C. Vor Gebrauch Filter (0,2 um Spritzenfilter Spitze) das Medium erneut auf Niederschläge zu entfernen. </li><li> Bereiten Inhibitor-Stammlösungen für die pharmakologischen Tests. DISSOLve die Chemikalien in dem entsprechenden Lösungsmittel und Speicher in Teilmengen. Zum Beispiel wird eine Stammlösung von 28,69 mM Anacardsäure (ACHTUNG: Reizt die Augen und die Haut) in Dimethylsulfoxid. </li><li> Werkzeuge vorzubereiten für die Störung der Puppen seziert Hoden und Präparation der einzelnen Zysten. Verwenden Sie zwei scharfe und steife Nadeln, anstatt einer Pinzette. Die Kapillare Kraft, die zwischen den beiden Armen einer Zange entwickelt macht die Präparation der einzelnen Zysten in kleinen Mengen Medium sehr schwierig. Verwenden Sie zum Beispiel die Spitze eines Edelstahl Insektenstift in einer Impföse Halter eingesetzt. </li><li> Um angemessene Alter Puppen, Samen ca. 10 große Kulturfläschchen (Rohre mit 4 cm Durchmesser) mit einer ausreichenden Anzahl von erwachsenen Fliegen (ca. 40-60 Linie) zu erhalten. Um die HP Switch analysieren, verwenden Fliegen H2AvD-RFP und ProtamineB-eGFP exprimieren in ihrer endogenen Muster 12,16,22. Die Fläschchen unter Standardbedingungen bei 25 inkubieren; ° C für ca. 4-5 Tage bis dritten Larvenstadium kriechen und starten Verpuppung an den Wänden der Fläschchen 25. </li></ol> 2. Kennzeichnung oder Sammel Weiß Pre-Puppen für Dissection Erhalten 24 h alten Puppen <ol><li> Um den Einfluss von bestimmten Chemikalien auf der HP-Schalter zu testen, Puppen sezieren Hoden bei ca. 24 h APF 12. Inszeniert Puppen zu erhalten, nehmen die vorbereiteten Flugkulturfläschchen mit Verpuppung Larven (siehe Abschnitt 1.4) und zu identifizieren, wie viele weiße Pre-Puppen wie möglich. Pre-Puppen während der erste Schritt in der Verpuppung erscheinen als unbeweglich, nicht-Fütterung, sondern verkürzt Larven mit umgestülpten Luftlöcher und weiß gefärbte Puppenhülle. Die Puppenhülle wird tan-braun innerhalb von 30 bis 60 min, die die nächste Stufe der Puppenentwicklung 26 zeigt. </li><li> Markieren die Positionen der Pre-Puppen mit einer dauerhaften Markierung auf der Außenseite der Phiolen. Die Fläschchen Inkubation bei 25 ° C für ca. 24 h. <ol><li> Alternativwählen Sie die Pre-Puppen von der Seite der Fläschchen mit einem kleinen Pinsel mit PBS-Puffer befeuchtet. Dann überweisen Sie den Pre-Puppen an der Seite ein frisches 50 ml Reaktionsgefäß und Inkubation bei 25 ° C für ca. 24 h. </li></ol></li></ol> 3. Präparation Pupal Hoden bei ca. 24 Stunden nach der Pupariumbildung <ol><li> Verteilen Sie einige Tropfen (ca. 80 ul jeder) des Mediums auf einem 10 cm Kunststoffzellkultur oder eine Petrischale. Mit einer breiten Pinzette oder einem Pinsel mit mittlerer befeuchtet, nehmen die Puppen an der 24-Stunden-APF Bühne aus den Fläschchen inkubiert (siehe Abschnitt 2). Übertragen einer Puppe zu jedem Mediumtropfen auf dem Teller. </li><li> Für die Präparation, verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop mit einer Faseroptik-Lichtquelle ausgestattet. Die Hoden oben RT während der Präparation nicht erhitzen, da dies die richtige Entwicklung in der Kultur zu verhindern. <ol><li> Sezieren Puppen mit zwei Paaren von Nr. 5 Pinzette. Mit einem Paar, greifen die Puppe an seinem hinterstenTeil (die hinteren Luftlöcher) und halten sie in Position. </li><li> Besorgen Sie sich die vorderen Luftlöcher mit der anderen Pinzette und öffnen Sie das Puppenkiemendeckel an seinem vorderen Ende. Ziehen Sie die Puppenhülle, bis zumindest ein Teil des Brustkorbs ausgesetzt ist. </li><li> Weiterhin die Puppe in Position durch seine hintersten Ende zu halten. Um den Innendruck der Puppe zu lösen, legen Sie beide Arme einer Zange in den Kopfbereich der Puppe. </li><li> Rippen der Puppe durch Öffnen der Zange und Bewegen der Zange in der vorderen Richtung offen. Stellen Sie sicher, dass die mit dieser Bewegung erzeugt Öffnung so groß wie möglich im ersten Versuch ist. Um eine Beschädigung der Puppe an ihrem hinteren Ende, bevor der Druck freigegeben worden, da dies in die Hoden, die direkt durch die kleine Öffnung geschoben und am häufigsten gestört führen. </li><li> Beachten Sie, dass, sobald die Puppe geöffnet wird, drückt die freiInnenDruck der Puppe aus Agglomeraten von Fettkörperzellen und Gewebe durch die large Öffnung in der Kopfregion. Prüfen, ob die Puppen Hoden haben bereits von der Puppe mit diesem Material geschoben worden; Dies erfolgt in einigen Fällen. Die Hoden sind nicht auf andere Gewebe nach 24 Stunden APF verbunden sind und deshalb leicht von der Puppe 23 ausgestoßen werden. </li><li> Vermeiden Sie drückte die Puppe mit der Zange, da dies die Hoden beschädigen, wenn sie in der Puppe bleiben. Erhöhen Sie die Größe der Öffnung mit einer Pinzette. </li><li> Halten Sie dann die Puppe an seinem hintersten Ende. Schließen Sie die anderen Pinzette und sanft Strähne aus dem Inhalt der Puppe von posterior nach anterior der Hoden aus der Puppe zu lösen. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die Hoden, indem Sie sie in eine vorgeschnitten 200 ul Pipettenspitze. Versuchen, nur eine sehr kleine Menge des Mediums zu übertragen, um die Anzahl der Fettkörperzellen mit den Hoden übertragen verringern. Legen Sie die Hoden in das Medium in einer frischen Kulturschale. Mehrmals mit Medium waschen die Hoden, bis nur noch wenige Fettkörperzelles bleiben. </li><li> Für Live-Bildgebung, übertragen Hoden zu einem Glasbodenkulturschale mit mittleren und verwenden eine umgekehrte Imaging Mikroskop. Für pharmakologische Tests, mit Schritt 5 fortfahren. </li></ol> 4. Präparation der männlichen Keim Online-Zysten und Live-Imaging <ol><li> Übertragen eine oder mehrere Puppen Hoden auf einem Glasbodenkulturschale. </li><li> Verwenden Sie ein Stereo-Mikroskop mit Glasfaserbeleuchtung und zwei Edelstahl-Nadeln (siehe Abschnitt 1.3) für die Dissektion der männlichen Keimbahn-Zysten. <ol><li> Mit einer Nadel vorsichtig versuchen zu fassen ein Hoden an seinem vorderen oder hinteren Ende. Halten Sie es in Position. Stecken Sie das andere Nadel in den Hoden und stören die Hoden Mantel durch Bewegen der Nadel seitwärts. Viele der Zysten aus dem Hoden durch diese Bewegung freigegeben werden. </li><li> Weiterhin die Hoden in der Position mit einer Nadel zu halten. Sanft Serie aus den verbleibenden Zysten aus dem Hoden mit der anderen Nadel. </li><li> Separate aggregiert Zysten entweder durch Gently Verschieben einer Nadel seitlich durch die Cluster von Zysten oder durch die Übertragung der Zysten in ein frisches Kulturschale mit Medium mit einer 200 ul Pipettenspitze. </li></ol></li><li> Bewegen Sie die Kulturschale mit einem invertierten Mikroskop für Live-Imaging-Abbildung einzelner Zysten. Dispergieren Zysten wieder mit einer Nadel, falls erforderlich. <ol><li> Identifizieren Sie die Stufe der Zysten durch Verwendung Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf eine Zyste der gewünschten Bühne. Ausrichtung und Lage der Zyste bestätigen häufig während längerer Abbildungsexperimente, wie die Zysten nicht auf dem Boden der Kulturschale anhaften, und neigen daher dazu, unscharf zu schweben. HINWEIS: Die Beschichtung der Schale mit Poly-L-Lysin zur Immobilisierung ist nachteilig für die Entwicklung der frühen Keimbahn-Zysten. Stattdessen können einzelne Zysten isoliert werden. Mit etwas Übung ist es möglich, einzelne aus einer bestimmten Zyste durch sehr sanftes Drücken Sie es mit der Nadel. Dadurch wird die Übertragung einzelner Zysten separate Kult erlaubenUre Gerichte mit einem Glas Pasteur-Pipette mit einer gezogenen Spitze, die in das Sichtfeld des Mikroskops passt. Die isolierten Zysten dann leicht in den Kulturschalen auch nach langfristiger Inkubation verlegt werden. </li></ol></li></ol> 5. Pharmakologische Assay mit intakten Pupal Hoden <ol><li> Füllen Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte mit 500 ul Medium für einen Versuch von 12 Wiederholungen. Transfer eines Puppen Hoden in jede Vertiefung, mit einem vorgeschnitten 200 ul Pipettenspitze. <ol><li> Erfragen Gegenwart Protamine in den isolierten Hoden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop. Die Hoden sollten frei von ProtamineB-eGFP-Signal, das anzeigt, dass die HP Schalter nicht in einem der Zysten getroffen werden. Ersetzen Hoden, die bereits ProtamineB-eGFP-positive Zysten zeigen. </li><li> Auf die ersten 12 Wells, 500 ul Medium, das verdünnt Inhibitorverbindung (Anacardinsäure), um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen(150 uM) in 1 ml Medium pro Well. Verwenden Sie die restlichen Brunnen als unbehandelte Kontrollen; Add 500 ul Medium mit der gleichen Menge des Lösungsmittels so mit dem Inhibitor-Verbindungen verwendet. Hinweis: Wenn viele Verbindungen und Lösemittel verwendet werden, kann es effizienter sein, Medium alleine als Kontrolle verwendet und um den Einfluss der Erhöhung der Lösungsmittelkonzentrationen in getrennten Experimenten getestet. </li></ol></li><li> Inkubieren der Platte bei 25 ° C für 24 Stunden im Dunkeln. </li><li> Überprüfen erneut auf die Gegenwart von Protamine in den Hoden inkubiert, wie oben beschrieben. Die Steuer Hoden sollte nun eine oder mehrere ProtamineB-eGFP-positive Zysten, die durch den Übergang HP Schalter zeigt. </li><li> Mit einer Pipette mit einer 200 ul Spitze, übertragen Sie die Hoden zu Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger, stellen Squash Vorbereitungen und Fleck mit geeigneten fluoreszierenden Antikörpern wie anderswo 12,27,28 beschrieben. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt zwei verschiedene Anwendungen sowohl auf der Basis der Fähigkeit, Drosophila Hoden und Einzelkeimbahn-Zysten bei einer gegebenen Entwicklungsstufe und auf die ex-vivo-Entwicklung der Zellen und Gewebe in der Kulturschale zu sezieren. Eine Anwendung ist die pharmakologische Manipulation der Lebensvorgänge während Spermienentwicklung. Wichtig ist, ermöglicht dies den Zugang zu postmeiotischen Spermatogenese, die nicht einfach mit Hilfe der funktionellen Analysen auf der Basis Fliegengenetik gewonnen wird. Die andere Anwendung ist die mikroskopische Beobachtung lebender und Entwicklung von Keimzellen und Hoden. Gerade diese Anwendung profitiert von der Fähigkeit der Drosophila-Zellen und Organe in Kultur, um zu überleben und zu entwickeln, bei RT und unter normaler Atmosphäre. Daher ist eine invertierte Abbildungsmikroskop mit einem Heiztisch (Erhitzen auf Standardzüchtungstemperatur von 25 ° C) ausgestattet ist ausreichend, um sinnvolle Ergebnisse in Live-Imaging Experimente erhalten. Weitermehr, viele transgenen Fliegen Stämme, fluoreszierende Protein-markierte Proteine ​​für die Live-Darstellung vorhanden oder kann leicht festgestellt werden. Um Puppen Hoden oder Keimbahn-Zysten von einer bestimmten Entwicklungsstufe zu erhalten, ist es wichtig, dass man mit dem Timing der Drosophila-Entwicklung vertraut ist. Der genaue Zeitpunkt für jede Stufe kann zwischen den Laboratorien, Kulturbedingungen variieren und fliegen Stämme und muss empirisch ermittelt werden. Wie oben dargelegt, ist dies besonders wichtig für pharmakologische Tests, die beispielsweise gezielt die HP-Schalter. Für solche Experimente, ist es ratsam, immer überprüfen, für Spermatiden mit einem ProtamineB-eGFP-Signal vor der eigentlichen Hemmstofftest, da der Zeitpunkt kann etwas auch innerhalb einer Population variieren. Nach dem Protokoll über den Experimentator sollte ermöglichen, Hoden vom frühen Puppenstadien als intakte Organe frei von Fett angebracht Körpergewebe zu sezieren. Diese Hoden und, mehr noch, isoliert germ-line Zysten sind sehr zerbrechlich. Daher ist es entscheidend, die manuelle Geschicklichkeit und Erfahrung für den Umgang mit und die Übertragung Hoden und Zysten mit einer Pinzette, Nadeln, und Pipetten notwendig zu entwickeln. Insbesondere Studien Targeting meiotischen und frühen post-meiotischen Keimzellentwicklung würde davon profitieren. Zwar ist es vergleichsweise einfach, Zysten späten Spermatiden mit langen Geisseln von erwachsenen Hoden zerlegen, ist es schwierig zu früheren Stadien zu erhalten. Sezieren diese Zysten von der frühen Puppen Hoden nach diesem Protokoll ist viel effizienter. Beachten Sie, dass in einer üblichen Fliegenstamm, nur ca. 50% der Puppen wird männlich. Daher herzustellen, mindestens doppelt so viele Puppen wie die Anzahl der Hoden erforderlich sezieren. Alternativ ist es möglich, männlich L3 Larven zu identifizieren unter Verwendung eines Stereomikroskops, wie die Hoden kann als durchscheinende runde Organe in den seitlichen Fettkörpergewebe des intakten Larve 23,34 eingebettet identifiziert werden, und sie in frisches Kulturflaschen sammeln, könnenverwendet werden, um vor-Puppen für die Inszenierung und Dissektionen holen werden. Es ist auch möglich, männliche vorge Puppen 35 identifizieren. Wir haben festgestellt, dass sowohl die isolierten Keimbahn-Zysten und die intakten Puppen Hoden in Kultur sind lichtempfindlich, was auch schon zuvor 18 berichtet. Diese Lichtempfindlichkeit könnte auch für einige in der pharmakologischen Tests verwendeten chemischen Verbindungen halten. Daher ist es am besten, die Kulturschalen eines Tests in der Dunkelheit während der Inkubation zu halten. Ebenso bei der Planung Zeitraffer-Imaging Experimente mit der Entwicklung der Hoden und vor allem, isoliert Zysten, bedenken Sie, dass zu lange Belichtungszeiten und / oder zu hohe Abtastraten können ex vivo Entwicklung hemmen. Die entsprechende Abtastrate sollte experimentell ermittelt werden. Bakterien und / oder Pilzinfektionen und Überwachstum in den Kulturschalen stellt ein schwerwiegendes Problem. Infizierte Kulturschalen mit zu vielen Bakterien nicht unterstützt ex vivo devewicklung der Hoden und Zysten. Daher enthält das beschriebene Kulturmedium Penicillin und Streptomycin (siehe Schritt 1.1), aber während der Langzeit-Inkubation, können diese Antibiotika abgebaut werden und ihre Aktivität kann abnehmen. Dies könnte einer der Gründe für die begrenzte Zeit des Überlebens (max. 72 h) bei Verwendung des obigen Protokolls beobachtet kultiviert Zysten. Doch dieses Zeitrahmens nicht durch regelmäßige Erneuerung des Kulturmediums in den Schalen verlängert. Wir schließen, dass andere Faktoren das Überleben in Kultur beeinflussen, wie beispielsweise einen Mangel an Wachstumssignale aus anderen Geweben des Genitaltraktes. Auf der anderen Seite, ist postmeiotischen Entwicklung in Drosophila schneller als bei Säugetieren. Bei Drosophila nimmt Spermiogenese etwa 90 Stunden, und der HP-Schalter zwischen 50 und 60 Stunden nach der Meiose stattfindet 9,12. Somit ist die übliche Überlebenszeit von etwa 48 Stunden mit diesem Protokoll erreicht gut geeignet, um die Schwenkentwicklungsprozesse in spe folgenrmatogenesis wie meiotischen Teilungen oder der HP-Schalter. Obwohl bakterielle oder Pilzbefall kann mit sauberem Werkzeug und Medien vermieden werden kann, hat das vorgestellte Protokoll nicht strikt Verwendung von sterilen Arbeitsbedingungen, weil Fliegen machen und fliegen Hoden enthalten bereits Bakterien, wenn sie unter Standardbedingungen erhöht. Dennoch könnten einige Anwendungen dieser Kulturtechnik von Fliegen seziert profitieren oder sogar unter aseptischen Bedingungen erhöht (für Protokolle, siehe 17,36,37). Pharmakologische Tests hängen von der Verwendung von chemischen Verbindungen, die als Inhibitoren oder Aktivatoren von verschiedenen Enzymen wirkt. Die üblicherweise in solchen Experimenten verwendeten Verbindungen oft sehr unterschiedlich in ihrer Zielspezifität. Als Vorteil bietet diese das Potenzial, ganze Enzymklassen zielen, zum Beispiel mit Anacardsäure Hemmung p300 / CBP, PCAF und MYST Familienmitglieder von HATs 38. Die Kehrseite der Medaille könnten mögliche Off-Target-oder zytotoxische Effekte INDUC seinvon solchen Verbindungen hrsg. Daher sollte jede Verbindung in einem Assay mit Puppen Hoden oder Zysten verwendet für seine Zytotoxizität und spezifische Wirkung bei verschiedenen Konzentrationen getestet werden. Darüber hinaus können leichte Abweichungen in den Kulturbedingungen, die Konzentration der Verbindung oder Aktivität, und Variationen in der Zelldurchlässigkeit, um die Variabilität der induzierten Effekten führen. Daher ist es notwendig, den Erfolg der Behandlung in jedem Experiment überwacht. Zum Beispiel, wenn wir verwendet Anacardinsäure bei 150 uM, beobachteten wir geringe Variabilität in der Festigkeit der Chromatin-Kondensation zwischen Phänotyp und manchmal innerhalb einiger Hoden, während die Acetylierung von Histon H4 konsequent verringert. Pharmakologische Tests mit Drosophila Hoden in Kultur wurden verwendet, um vor und nach der Meiose Mechanismen der Spermatogenese 4,12,14,21 analysieren. Da es schwierig ist, postmeiotischen Spermatogenese mit genetischen Werkzeuge zugreifen, um Spieler mit Essentia Ziell Vor-und Reife meiotischen Funktionen, stellt diese ex vivo Ansatz eine Alternative. Weiterhin Im Prinzip könnte das Verfahren angepasst ist, um Experimente-Chase-Impuls, um die Entwicklung von behandeltem Keimzellen über die Zeit zu verfolgen. Allerdings haben wir noch nicht diese Möglichkeit geprüft. Die Nutzung der frühen Puppen Hoden ist ein Vorteil in der pharmakologischen Tests. Erstens könnte die dünne Außenhülle der jungen Puppen Hoden (ca. 24 h APF) verbesserte Durchlässigkeit von chemischen Verbindungen zu ermöglichen. Zweitens, wenn die Untersuchung der postmeiotischen HP-Schalter, die Puppen Hoden bei 24 Stunden von der APF Protamin-GFP-exprimierenden Fliegenschnur seziert ermöglichen einen direkten Auslesen, ob der HP-Schalter betroffen war oder nicht. Bis heute mehrere Protokolle für die Ex-vivo-Kultivierung von Drosophila Organen und Geweben einschließlich Hoden und Keimbahn-Zysten sind entwickelt worden (siehe zB 4,14,17,20,39,40). Die Kultivierungsmedium und die allgemeinen Bedingungenin der hier vorgestellten wurden im Jahr 1979 gegründet Protokoll 17. das Kultursystem wurde später auf in vivo-Bildgebung des Mechanismus Individualisierung im Spät postmeiotischen Zysten aus adulten Hoden isoliert 4 angepasst. Bisher haben wir berichtet, dass diese Bedingungen Überleben und die Differenzierung der meiotischen und frühen post-meiotischen Keimzellen unterstützt auch in ihrer Zysten für rund 48 HR 12. Im Gegensatz zu anderen Kultursystemen 19 war der beobachtete Entwicklungszeitpunkt in diesen Kulturen etwa im Einklang mit der von Festproben bestimmt (für Details siehe 12) Timing. H2AvD-RFP und Protamin-GFP-Fluoreszenz-Signale können verwendet werden, um die Kernmorphologie und Chromatin Zusammensetzung der Keimzellen in Kultur zu visualisieren. Wir fanden, dass zur eindeutigen Identifizierung von Entwicklungsstufen in der Kultur, das ist gegenüber anderen Kriterien wie Wickeln von Zysten vorteilhaft. Wichtig ist, dass das vorgestellte Protokoll nicht Zusatz von Flug ext beinhaltenract oder anderen als fetales Rinderserum Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus zeigen wir hier, dass die Bedingungen mit der Fluoreszenzmikroskopie Bildgebung von meiotischen Teilungen ex vivo in Kultur kompatibel sind. Bilder können mit hinreichender Auflösung in einem einfach zu bedienenden Medium, das langfristige Entwicklung unterstützt, erhalten werden. Dies steht im Gegensatz zu Protokollen ermöglicht kurzfristig (ca. 3 h) Beobachtungen in Voltalef Öl 41,42. Die oben für den Anbau und pharmakologische Behandlung von Hoden und Puppen einzigen männlichen Keimbahn-Zysten beschriebenen Verfahren sind leicht an den vielen genetischen, epigenetischen und zellbiologischen, oder Entwicklungs Fragen, die in Drosophila Spermatogenese erforscht werden kann. Dies umfasst insbesondere die Forschung mit Schwerpunkt auf Keimbahn-Stammzellen. Es hat sich gezeigt, dass Stammzellen Entwicklung kann durch die Bildgebung von kultivierten adulten folgen Hoden 20,43. Allerdings ist die peristaltische Bewegung der reifen Hoden sheath stört Bildaufnahme. Daher wird entweder Bildgebung mit fragmentierten Hoden 43 oder die Anzahl der Bilderzeugungsversuche durchgeführt, muss erhöht werden, um die verlorene Datensätzen 20 Konto erfolgen. Frühe Puppen Hoden (24 h APF) sind noch nicht mit Muskelzellen umgeben. Auch etwas ältere Hoden (36-45 h APF) scheinen einige Peristaltik zeigen (vergleiche Abbildung 3 und Supplemental Video 1). Daher könnte Anbau von jungen Puppen Hoden als intakte Organe als Alternative dienen. Darüber hinaus einmal gemeistert, die Fähigkeit, Puppen Hoden sezieren und schließlich isoliert Keimbahn-Zysten weitere Anwendungen mit einzelnen Zysten als Quelle von einer homogenen, wenn auch klein, Zellpopulation zu ermöglichen. Zum Beispiel ist es somit möglich, RT-qPCR durchführen, um die transkriptionelle Regulation spezifischer Gene in definierten Stufen der Spermatogenese zu analysieren, wie bereits gezeigt, <sup&gt; 15.

Die Entwicklung der männlichen Keimzellen vieler Arten ist eine sequentielle Verfahren. Es wird von einer Reihe von entscheidenden Ereignisse, die in der Bildung von morphologisch und epigenetically hoch spezialisierte Spermatozoen gipfelt gekennzeichnet. In Drosophila melanogaster, Keimbahn-Stammzellen an der Spitze des Hodens Kluft asymmetrisch zu einer neuen Stammzelle und der Spermatogonie, dh die Tochterzelle, die Differenzierung verpflichtet ist (siehe Abbildung 1 für eine Übersicht) geben 1,2 . Die Spermatogonie erfährt vier Runden mitotische Teilungen und mit dem Beginn der Meiose, eine Phase des Wachstums und der eindrucksvollen Transkriptionsaktivität genannt Spermatozyten Bühne. Die Zellen aus einer Ursprungs Spermatogonie bleiben miteinander verbunden und zu entwickeln als Synchronbündel durch zwei somatische Zellen-Struktur als eine Zyste bezeichnet gewickelt. Nach Beendigung der Meiose ist die Morphologie der männlichen Keimzellen völligreorganisiert (schematisch in 1 gezeigt). Zunächst runden Spermatiden länglich, um die hydrodynamische Kopfstruktur bilden, und die Geißel entwickelt. 5 - schließlich werden die Spermazellen, die voneinander durch einen Komplex, der Apoptose-verwandten Mechanismus genannt Individualisierung 3 getrennt. In vielen Spezies, einschließlich Drosophila melanogaster und Säugerspezies, die morphologischen Veränderungen der Keimzellen sind durch eine bemerkenswerte epigenetische Umlagerung des haploiden männlichen Keimbahn-Chromatin begleitet, genannt die Histon-zu-Protamin Schalter (Druckschalter) 6 - 9. Eventuell fast alle kanonischen Histon und viele Histon-Variante Moleküle aus der DNA abgezogen und durch kleine basische Proteine, Protamine, was zu der sehr kompakten nucleoprotamine spezifische Struktur des Chromatins von reifem Sperma ersetzt. Allgemeine Eigenschaften der HP-Schalter sind Ter Ersatz von kanonischen Histone zuerst Histonvarianten, dann durch Übergangs Proteine ​​und schließlich durch Protamine. 12 - all das wird durch mehrere Änderungen an epigenetischen Markierungen, wie zB ein Anstieg der Acetylierung von Histon H4 Ebenen kurz vor Histon Entfernung 7,10 begleitet. Die meisten, wenn nicht alle der oben genannten Verfahren sind für die Entwicklung von reifen, vollständig fruchtbare Samen. Dies gilt nicht nur in Drosophila, sondern auch bei Menschen, wie Säuger Spermatogenese teilt eine beträchtliche Ähnlichkeit mit dem wirbellosen System 1,8,9. Studium männlichen Keimzellentwicklung wird stark in der Drosophila-Modellsystem erleichtert. Fliegen sind genetisch sehr gut zugänglich. Der Erzeugung von Mutanten sowie die Einrichtung von Flug Stämme, die Fusionsgene oder RNA-Interferenz-Konstrukte nimmt wenig Aufwand. Jedoch in der Studie von postmeiotischen Spermatogenese, die Verwendung von Mutanten einesd einfachen genetischen Werkzeuge könnte eine Grenze zu erreichen. In Drosophila Spermatogenese, hört Transkription fast vollständig mit dem Eintritt in meiotischen Teilungen. 16 - So wird postmeiotischen Spermatogenese vor allem auf translational drückt und gespeichert mRNAs in einer erweiterten meiotischen Prophase 13 synthetisiert basiert. Daher Tools wie RNA-Interferenz oder die Verwendung von nicht-bedingte Mutanten sind nicht geeignet für die Untersuchung speziell auf die post-meiotischen Rollen von Gen-Produkte, die auch wesentliche Funktionen in der Vor-oder meiotischen Reifekeimzellentwicklung zu erfüllen. Ein Vorteil von Drosophila, die in solchen Fällen ausgenutzt werden kann, ist die Fähigkeit des intakten Hoden seziert und sogar Zysten von Keimzellen ex vivo in einem Kulturmedium zu entwickeln 4,12,17 - 20. Die Präparation und Kultivierung von Hoden oder Keimbahn-Zysten lassen sich nicht nur mikroskopische Beobachtung der Keimzellentwicklung in lebenden Zellen, sondern einelso die Verwendung pharmakologischer Tests mit beispielsweise Inhibitoren der Enzymkomplexe, wie Histonacetyltransferasen (Hut), Histon-Deacetylasen (HDACs), Topoisomerasen, oder das Proteasom. So ist es möglich, während der enzymatischen Funktionen postmeiotischen Spermatogenese zu manipulieren und die Entwicklungsergebnisse unabhängig von embryonalen, Pre-meiotischen oder meiotischen Funktionen 4,12 überwachen. In pharmakologischen Tests, die wir zuvor analysierten die Acetylierung abhängige Lokalisation eines Proteins während der Meiose Bromodomäne Prophase sowie die Relevanz der Histon-Acetylierung Stufen für die epigenetischen Schalter in HP postmeiotischen Spermatogenese durch spezifische Inhibitoren Targeting Hüte und HDACs 12,21. Zur Förderung der Druckschalter in diesen Assays wurde unter Verwendung eines Flug Stamm, der das Fusionsgene histone2AvD-RFP und protamineB-eGFP 12,22 in den endogenen Muster ausdrückt möglich gemacht, und die Beobachtung, dassdie ersten Spermatiden in Puppen Hoden passieren die HP-Schalter zwischen 24 und 48 h APF 12. Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Präparation der Hoden und Zysten von Drosophila Puppen, den Kulturbedingungen und pharmakologischer Test mit intakten Puppen Hoden. Zu diesem Zweck Puppen Hoden bei rund 24 Stunden nach der Pupariumbildung (APF) seziert werden (siehe Abbildungen 1 und 2). Zu diesem Zeitpunkt wurden die Hoden nicht Verbindungen zu anderen Geweben und sind nur von einer dünnen äußeren Hülle, die eine bessere Penetration durch die Inhibitorverbindungen ermöglicht 23,24 umgeben. Die Hoden Bohnen- oder birnenförmige Organe, die leicht in Kultur genommen werden kann. Diese Hoden seziert, kultiviert und mit spezifischen Inhibitoren behandelt. Anschließend werden die Wirkungen der Inhibitoren mittels Immunfluoreszenz analysiert und Fluoreszenzmikroskopie von Fusionsproteinexpressions überwacht, und durch Vergleich der Kern Morphollogie der behandelten Keimzellen, um die von unbehandelten Keimzellen. Die in diesem Protokoll vorgeBedingungen erlauben auch die Live-Darstellung der Entwicklung von Hoden und Keimbahn-Zysten in der Kultur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Während der Spermatogenese bei Säugetieren und in Drosophila melanogaster, entwickeln männlichen Keimzellen in einer Reihe von grundlegenden Entwicklungsprozessen. Dazu gehört die Differenzierung von einer Stammzellpopulation, mitotische Verstärkung, und Meiose. Darüber hinaus postmeiotischen Keimzellen durchlaufen eine dramatische morphologische Umformung sowie eine globale epigenetische Rekonfiguration der Keimbahn Chromatin-Histon-zu-Protamin-Schalter. Untersuchung der Rolle von einem Protein in postmeiotischen Spermatogenese Mutagenese oder andere genetische Werkzeuge oft von wesentlicher embryonalen, vorge meiotischen oder meiotischen Funktionen des untersuchten Proteins behindert. Die postmeiotischen Phänotyp einer Mutante eines solchen Proteins kann durch einen früheren Entwicklungs Block verdeckt werden oder die Interpretation des Phänotyps kompliziert werden könnte. Der Modellorganismus Drosophila melanogaster bietet einen Bypass für dieses Problem: intakte Hoden undsogar Zysten von Keimzellen von der frühen Puppen seziert der Lage sind, ex vivo in Kulturmedium zu entwickeln. Die Nutzung von solchen Kulturen ermöglicht mikroskopische Abbildung von lebenden Keimzellen in den Hoden und der Keimbahn-Zysten. Wichtig ist, dass die kultivierten Hoden und Keimzellen auch zugänglich pharmakologische Inhibitoren werden, wodurch Manipulation der enzymatischen Funktionen erlauben während der Spermatogenese, einschließlich postmeiotischen Stufen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie man sezieren und zu pflegen Puppen Hoden und Keimbahn-Zysten. Informationen über die Entwicklung des Puppen Hoden und Kulturbedingungen werden neben Mikroskop-Bilddaten des lebenden Hoden und Keimbahn-Zysten in Kultur bereitgestellt. Wir beschreiben auch eine pharmakologische Assays zu postmeiotischen Spermatogenese, durch einen Test zur Förderung der Histon-zu-Protamin-Schalter mit dem Histon-Acetyltransferase-Inhibitor Anacardsäure beispielhaft zu studieren. Im Prinzip könnte diese Kultivierungsmethode angepasst werden, um viele O-Adressether Forschungsfragen in Pre-und Post-meiotischen Spermatogenese.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K Aufrufe.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.