The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

倫理声明： このプロトコルに記載された実験手順は排他的にキイロショウジョウバエと協力し、ドイツの動物福祉法の対象ではありませんことを含む。 メディア、ツール、ハエの作製<ol><li>重炭酸カリウム17なしに変更された市販の粉末のM3成長培地を準備します。注意：目や皮膚に刺激を与えます。 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン及び100μg/ mlストレプトマイシンを含む培地を補う。最良の結果を得るための熱不活性化し、昆虫培養テスト済みウシ胎児血清を使用してください。 -20℃で一定分量が0.2μmボトルトップフィルターユニットと店舗を通じて（中と呼ぶ）完全培地をフィルタリングします。使用前に、フィルター（0.2μmのシリンジフィルターチップ）培地は再び沈殿物を除去した。 </li><li>薬理学的アッセイのための阻害剤ストック溶液を準備します。 Dissol一定分量の適切な溶媒およびストア内の化学物質をVEの。 （：目や皮膚を刺激する。注意）のジメチルスルホキシド例えば、28.69 mMのアナカルド酸の原液を調製。 </li><li>解剖し蛹精巣および単一の嚢胞の切開の破壊のためのツールを準備します。 2シャープで硬い針ではなく、ピンセットを使用してください。一対の鉗子の2つのアームの間に発症する毛管力は、媒体の少量の単一の嚢胞の切開を非常に困難にする。例えば、接種ループホルダーに挿入されたステンレス製の虫ピンの先端を使用しています。 </li><li>成虫（ 約 40〜60ハエ）の十分な数の適切に熟成蛹、種子の約 10大型培養バイアル（4cmの直径を有するチューブ）を得るために。 HPのスイッチを分析するには、それらの内因性パターン12,16,22にH2AvD-RFPとProtamineB-EGFPを発現しているハエを使用しています。 25で標準条件下でバイアルをインキュベート;まで4-5日3齢幼虫のクロールされるまで、約のためのC°およびバイアル25の壁に蛹化を開始します。 </li></ol> 2解剖のために24時間齢の蛹の入手ホワイトプリ蛹マーキングまたは収集<ol><li> HPのスイッチ上の特定の化学物質の影響をテストするために、 約 24時間のAPF 12で蛹精巣を解剖。上演蛹を取得するには、幼虫をpupatingでプリペアフライ培養バイアルを取る（セクション1.4を参照）、できるだけ多くの白人前蛹を識別します。蛹化中の一番最初のステップの間に前蛹は動かず、無給電、裏返した気門及び白色蛹殻とむしろ短くなる幼虫として表示されます。蛹殻は蛹開発26の次の段階を示しており、30〜60分以内に黄褐色になる。 </li><li>バイアルの外側に油性マジックで事前に蛹の位置をマークします。 約 24時間25℃でバイアルをインキュベートする。 <ol><li>別の方法として、PBS緩衝液で湿らせた小さなブラシでバイアルの側面から前蛹を選択します。その後、新しい50mlの反応管の側に予め蛹を転送し、 約 24時間25℃でインキュベートする。 </li></ol></li></ol>蛹の形成後に、約 24時間で蛹精巣の3解剖<ol><li> 10cmのプラスチック製の細胞培養やシャーレ上の培地を数滴（ 約 80μlの各）を配布します。鉗子の幅広いペアまたは培地で湿らせたブラシを使用して、培養したバイアル（セクション2を参照）から24時間のAPF段階で蛹を選択します。ディッシュ上の培地の各ドロップに1さなぎを転送します。 </li><li>解剖のために、光ファイバ照明装置を装備した実体顕微鏡を使用しています。これは、培養中の適切な発達を妨げる可能性があるため、切開中に室温より精巣を加熱しないでください。 <ol><li> 5号鉗子2対の蛹を解剖。 1組では、その最も後方で蛹をつかむパート（後部気門）と位置に保持。 </li><li>鉗子の他のペアで、前気門をつかみ、その前端で蛹蓋を開きます。胸部の少なくとも一部が露出するまで蛹のケースをはがし。 </li><li>その最も後端によって所定の位置にサナギを押し続けます。蛹の内圧を解放するには、蛹の頭部領域に鉗子の両アームを挿入します。 </li><li>鉗子を開いて前方方向に鉗子を移動させて開いたさなぎをリッピング。この移動に伴って生成された開口部は最初の試みで、可能な限り大きいことを確認してください。これは精巣が小さい開口部から直接押され、そして最も頻繁に中断されるのを引き起こす可能性があるため、圧力が解放される前に、その後方端で蛹に損傷を与えないようにしてください。 </li><li>蛹が開かれると、蛹の放出された内部圧力がラを通して脂肪体細胞や組織の凝集体を押したことを確認頭部領域におけるRGE開口部。蛹の精巣は、すでに本資料によって蛹から押し出されているかどうかをチェックします。これが発生する場合がある。精巣は、24時間のAPFで、他の組織に接続されていないため、蛹23から容易に排出される可能性があります。 </li><li>彼らは蛹に残っている場合、これは精巣に損傷を与える可能性があるため、鉗子でサナギを圧迫しないようにします。鉗子の1ペアを使用して開口部のサイズを大きくします。 </li><li>そして、その最も後方の端で蛹を保持します。蛹から精巣を解放するために前方に後方から蛹の中身うち他のピンセットと静かに連勝を閉じます。 </li></ol></li><li>プレカット200μlのピペットチップにそれらを引いて、精巣を収集します。精巣で転送脂肪体細胞の数を減少させるために、媒体のごく少量を転送しよう。新鮮な培養皿に培地中に精巣を配置します。少数の脂肪体細胞になるまで培地で精巣を数回洗浄するsが残っている。 </li><li>ライブイメージングのために、媒体をガラスボトム培養ディッシュに精巣を転送し、倒立イメージング顕微鏡を使用しています。薬理学的アッセイのために、ステップ5に進みます。 </li></ol>男性生殖細胞の嚢胞とライブイメージングの4解剖<ol><li>ガラスボトム培養皿に1つまたは複数の蛹の精巣を転送します。 </li><li>光ファイバ照明と2つのステンレス鋼の針付き実体顕微鏡を使用して、男性の生殖嚢胞の解剖のため（1.3節を参照）。 <ol><li>一方の針を使用すると、慎重にその前方または後方端部に1つの精巣を突き止めるようにしてください。位置でそれを保持します。精巣に他の針を挿入し、横に針を移動させることにより、精巣鞘を混乱させる。嚢胞の多くは、この移動によって精巣から解放される。 </li><li>一方の針との位置に精巣を押し続けます。他の針で精巣からの残りシストアウト優しく連勝。 </li><li>紳士で区切り集約さ嚢胞のどちらかLYは、嚢胞のクラスタを介して、または200μlのピペットチップを用いて培地を新鮮な培養皿に嚢胞を転送することによって横に針を移動させる。 </li></ol></li><li>単一の嚢胞のライブイメージングのための倒立イメージング顕微鏡に培養皿を移動します。必要に応じて、針で再び嚢胞を分散させる。 <ol><li>位相コントラストおよび蛍光顕微鏡を使用して嚢胞の段階を特定する。 </li><li>所望の段階の嚢胞に焦点を当てています。嚢胞は、培養皿の底に付着し、そのためピントて浮動する傾向がないように、より長いイメージング実験中に頻繁に嚢胞の焦点と位置を確認してください。 注：固定化のためのポリ-L-リジンで皿をコーティングする初期の生殖系列嚢胞の発達に有害である。その代わりに、個別の嚢胞を単離することができる。いくつかの練習で、それは非常に静かに針でそれを押すことによって、特定の嚢胞を選び出すことが可能である。これは、単一の嚢胞の転送がカルトを分離することができるようになります顕微鏡の視野に収まる引き出し先端がガラスパスツールピペットでUREの料理。単離された嚢胞がその後も容易に長期のインキュベーション後に培養皿に再配置することができる。 </li></ol></li></ol>無傷蛹精巣を持つ5。薬理学的アッセイ<ol><li> 12回の反復の一つの実験のための培地500μlを24ウェル細胞培養プレートの各ウェルを埋める。プレカット200μlのピペットチップを用いて、各ウェルに一つの蛹の精巣を転送する。 <ol><li>倒立蛍光顕微鏡を用いて、単離された精巣におけるプロタミンの存在を確認してください。精巣は、HPのスイッチは嚢胞のいずれかで行われていないことを示していますProtamineB-EGFP信号のないものでなければならない。すでにProtamineB-EGFP陽性嚢胞を示して精巣を交換してください。 </li><li>最初の12のウェルに、所望の最終濃度に達するように希釈した阻害剤化合物（アナカルド酸）を含有する培地500μlを追加ウェルあたり1mlの培地中で（150μM）。未処理のコントロールとして残りのウェルを使用します。阻害剤化合物と同様に使用する溶剤の同量の培地500μlを加える。注：多くの異なる化合物および溶媒を使用する場合、それはコントロールとして培地のみを使用し、別個の実験において溶媒濃度を増加さの影響を試験するために、より効率的かもしれない。 </li></ol></li><li>暗闇の中で24時間、25℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>上記のようにインキュベート精巣でプロタミンの存在をもう一度確認してください。制御精巣は現在、HPのスイッチを介して遷移を示す一つ以上のProtamineB-EGFP陽性嚢胞を示すべきである。 </li><li>他の場所12,27,28説明したように200μlの先端でピペットを用いて、ポリ-L-リジンコートスライドに精巣を転送、スカッシュ準備をして、適切な蛍光抗体で染色する。 </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

著者らは競合する利益を有していない。

提示されたプロトコルは、特定の発達段階でのショウジョウバエ精巣および単一生殖細胞嚢胞を分析する能力に、培養皿の中でこれらの細胞および組織のex vivoでの開発の両方に基づいて、2つの異なるアプリケーションを記述します。一つの用途は、精子の発達中の重要なプロセスの薬理学的操作である。重要なことは、これは簡単にハエ遺伝学に基づいて機能解析を使用して得られていません減数分裂後の精子形成へのアクセスを可能にする。他のアプリケーションが生きていると生殖細胞および精巣の開発の顕微鏡観察である。 RTで、通常の雰囲気下で生き残り、発展させる培養中のショウジョウバエの細胞や臓器の能力から、特にこのアプリケーションの利点。したがって、加熱されたステージ（25℃の標準的育種温度に加熱）を装備した倒立イメージング顕微鏡はライブイメージング実験に意味のある結果を得るのに十分である。さらなるライブイメージングのための蛍光タンパク質タグ付きタンパク質を発現するより、多くのトランスジェニックハエ株は存在しないか、容易に確立することができる。 蛹の精巣または特定の発達段階の生殖嚢胞を得るためには、一つは、ショウジョウバエの発達のタイミングに精通していることが重要です。各ステージの正確なタイミングは、実験室の中で培養条件を変化させると、株を飛ぶ、経験的に確立されなければならない場合があります。上記で概説したように、これは、例えば、HPスイッチを標的、薬理学的アッセイにとって特に重要である。タイミングが一つでも集団内でわずかに変化することができますので、このような実験のために、それは常に、実際の阻害剤試験前ProtamineB-EGFP信号と精子細胞を確認することをお勧めします。 上記のプロトコルに続いて、添付の脂肪体組織の自由な無傷の器官として初期の蛹の段階から精巣を解剖するために、実験を有効にする必要があります。これらの精巣および、なおさら、孤立したGERM-ライン嚢胞は非常に壊れやすいものです。したがって、鉗子、針、およびピペットを用いて精巣および嚢胞を処理し、転送するのに必要な手先の器用さと経験を開発することが重要です。特に減数分裂および初期減数分裂後の生殖細胞発達を標的とする研究は、この恩恵を受ける。それは成人の精巣から長い鞭毛後期精子細胞の嚢胞を分析することは比較的容易であるが、それは初期段階を得ることが困難である。このプロトコルに従って、初期の蛹の精巣からこれらの嚢胞を解剖すると、はるかに効率的です。通常のハエ株で、蛹のわずか約 50％が男性であることに留意してください。そのため、必要な精巣の数と、少なくとも倍の蛹を解剖するための準備。或いは、精巣無傷幼虫23,34の横方向の脂肪体組織に埋め込 ​​まれたような半透明の円形の器官を同定することができるように、立体顕微鏡を用いて雄L3幼虫を識別するために、新鮮な培養バイアル中にそれらを収集することが可能であること缶ステージングおよび解剖のための前蛹を選択するために使用される。それは、男性のプレ蛹35を識別することも可能である。 また、以前に18報告されている単離された生殖嚢胞や文化にそのまま蛹精巣の両方が、光に敏感であることに気づいた。この光感度も薬理学的アッセイで使用されるいくつかの化合物のために保持しているかもしれません。したがって、インキュベーションの間に暗闇の中でアッセイの培養皿を維持することが最善です。開発精巣および、とタイムラプスイメージング実験を計画する際に同様に、特に、孤立した嚢胞は、あまりにも長い露光時間および/ ​​またはすぎる高いサンプリングレートはex vivoでの開発を阻害する可能性に留意してください。適切なサンプリングレートは、実​​験的に決定されるべきである。 培養皿中の細菌および/または真菌感染症および過成長が深刻な問題となる。あまりにも多くの細菌に感染した培養皿は、ex vivoで DEVEをサポートしていません精巣および嚢胞のlopment。したがって、記載の培養培地は（ステップ1.1参照）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むが、長期のインキュベーションの間に、これらの抗生物質が低下する可能性があり、それらの活性が減少するかもしれない。これは、上記のプロトコルを使用した場合に観察培養した嚢胞の生存の限られた時間の理由の一つ（最大72時間）である可能性があります。まだこの時間枠は、皿中の培養培地を定期的に交換することによって拡張することができなかった。私たちは、他の要因がそのような生殖管の他の組織からの増殖シグナルの欠如として、培養中の生存に影響を与えるかもしれないと結論付けている。一方、減数分裂後の開発は、哺乳動物におけるよりもショウジョウバエの高速です。 ショウジョウバエでは、精子は、約90時間を要し、HPのスイッチは、減数分裂9,12後に50〜60時間の間で行われる。このように、このプロトコルを用いて達成周り48時間の通常の生存時間はSPEにおいて極めて発達過程に従うことが非常に適しているそのような減数分裂またはHPのスイッチとしてrmatogenesis、。細菌や真菌の汚染がきれいなツールやメディアを使用することで回避できますが、提示されたプロトコルは、ハエのため、厳密に無菌労働条件を利用し、標準的な条件下で飼育するとき睾丸は既に細菌が含まれて飛ばない。それにもかかわらず、この培養技術のいくつかのアプリケーションは、（プロトコルのために、17,36,37を参照）無菌条件下で解剖したり、隆起したハエの恩恵を受ける可能性があります。 薬理学的アッセイは、さまざまな酵素の阻害剤または活性化因子として機能する化学化合物の使用に依存します。一般的にこのような実験において使用される化合物は、しばしばそれらの標的特異性が大きく異なる。利点としては、これは、アナカルド酸阻害P300 / CBP、PCAF、帽子38のMYSTファミリーのメンバーと、例えば、全体の酵素クラスをターゲットにする可能性を提供しています。これの欠点は、潜在的なオフターゲットまたは細胞傷害効果inducかもしれないそのような化合物によって編したがって、蛹精巣や嚢胞を用いたアッセイで使用される各化合物は、その細胞毒性及び異なる濃度で特定の効果をテストする必要があります。また、培養条件、化合物濃度または活性、および細胞透過性の変化に多少のばらつきが誘導される効果のばらつきにつながるかもしれない。したがって、各実験における治療の成功を監視する必要がある。私たちは、150μMでアナカルド酸を使用した場合に、ヒストンH4のア​​セチル化は一貫して減少している間たとえば、私たちは、間に、時にはいくつかの精巣内のクロマチン凝縮表現型の強度に多少の変動を観察した。 培養物中のショウジョウバエ精巣で薬理学的ア ​​ッセイは、精子形成4,12,14,21の前後の減数分裂のメカニズムを分析するために使用されてきた。それはエッセンで選手を標的とするために、遺伝的ツールで減数分裂後の精子形成にアクセスすることは困難であるためLの前減数分裂と減数分裂の機能は、このex vivoでのアプローチは、代替手段を構成している。また、原理的には、本方法は、経時的な処置生殖細胞の発達を追跡するパルスチェイス実験に適合させることができる。しかし、私たちはまだこの可能性をテストしていません。初期の蛹精巣の使用を作ることは薬理学的アッセイで有利である。まず、（24時間APF前後）若い蛹精巣の薄い外側シースは、化合物の改善された透過性を可能性があります。減数分裂後のHPのスイッチを研究するときに、第2、蛹精巣は、HPのスイッチには影響されたかどうかを直接読み出しを可能にするプロタミン-GFP発現フライラインから24時間のAPFで解剖した。 現在までのところ、精巣および生殖系列嚢胞を含むショウジョウバエの器官や組織のex vivo培養のためのいくつかのプロトコルが開発されている（ 例えば 、4,14,17,20,39,40を参照のこと）。培養培地および使用される一般的な条件1979年に設立されたここで紹介するプロトコルで17。培養系は、後に成人の精巣4から分離された後期減数分裂後の嚢胞で個別化機構のin vivoイメージングに適合させた。以前は、私たちはこれらの条件はまた、周りの48〜12時間のために彼らの嚢胞で減数分裂や早期減数分裂後の生殖細胞の生存と分化を支持することを報告した。他の培養システム19とは対照的に、これらの培養物において観察された発生のタイミングは（詳細については、12を参照） を固定したサンプルから決定されたタイミングとほぼ一致した。 H2AvD-RFPおよびプロタミン-GFP蛍光シグナルは培養中の生殖細胞の核形態およびクロマチン組成物を可視化するために使用することができる。私たちは、培養中の発達段階の明確な識別のために、このような嚢胞のコイリングなどの他の基準、より有利であることがわかった。重要なことは、提示されたプロトコルは、フライ内線の添加を伴わないウシ胎児血清以外RACTまたは他の増殖因子。さらに、本 ​​発明者らは、条件がエキソビボ培養における減数分裂の蛍光顕微鏡画像と互換性があることをここに示す。画像は、長期的発展をサポートする使いやすい培地中で妥当な解像度を得ることができる。これはVoltalef油41,42に短期間（ 約 3時間）の観察を可能にするプロトコルとは対照的である。 栽培や蛹精巣およびシングル男性生殖嚢胞の薬物治療のための上記の手順は、 ショウジョウバエの精子形成に研究することができる多くの遺伝的、エピジェネティックな、生物学的細胞、または発生の質問に簡単に適応可能である。これは、生殖系列幹細胞に着目し、特に研究を含む。それは、20,43精巣幹細胞の発達を培養成体のライブイメージングを続けることができることが示されている。しかし、成熟した精巣の蠕動運動sheathは画像取得を妨害する。したがって、いずれの画像化は、断片化精巣43または行わイメージング実験の数は、失われたデータセット20を考慮して大きくする必要があるを使用して行われる。初期の蛹精巣（24時間APF）は、まだ筋肉細胞に同封されていません。でも、少し古い精巣（36-45時間のAPF）は、いくつかの蠕動運動を表示します（ 図3、補足ビデオ1を比較する）ように見える。したがって、無傷の臓器若い蛹精巣の栽培は、代替となりうる。 また、一度、蛹精巣を分析するために、最終的には孤立した生殖細胞嚢胞が小さく、細胞集団にもかかわらず、均質の源として、単一の嚢胞を使用してさらなる応用を可能にする能力を習得。すでに実証されているように、例えば、それは、精子形成の定義された段階において特定遺伝子の転写調節を分析するためにRT-定量PCRを実行することが可能である<suP&gt; 15。

多くの種の雄性生殖細胞の発達は、連続プロセスである。これは、形態学的およびエピジェネティックに専門性の高い精子の形成に絶頂に達する重要な一連の事象によって特徴付けられる。 キイロショウジョウバエでは、精巣デバイドの先端の生殖系列幹細胞は非対称的に新たな幹細胞と精原細胞を生じる、 すなわち、分化に努めて娘細胞（概要については図1を参照）1,2 。精原細胞は、減数分裂の開始と、印象的な成長と転写活性の位相が精母細胞期と呼ばれる、有糸分裂の4ラウンドを受け、。 1精原細胞由来の細胞が互いに接続二つ体細胞、嚢胞と呼ばれる構造でラップされた同期化されたバンドルとして開発残る。減数分裂の完了後に、雄性生殖細胞の形態は、完全に再編成（ 図1に概略的に示される）。最初に、円形精子細胞は、流体力学的なヘッド構造を形成するために細長く、そして鞭毛を発現する。 5 -最終的に、精子細胞は、個別3と呼ばれる複雑な、アポトーシス関連機構によって互いに分離されている。 9 - キイロショウジョウバエと哺乳動物種を含む多くの種では、半数体雄の生殖クロマチンの著しいエピジェネティックな再配置を伴う生殖細胞の形態学的変化は、（HPのスイッチ）6ヒストンからプロタミンスイッチと呼ばれる。おそらくほぼすべての標準的なヒストンおよび多くのヒストン変異体分子は、DNAから取り除かれ、成熟精子のクロマチンに特有の非常にコンパクトなヌクレオプロタミンの構造が得られる小型の塩基性タンパク質、プロタミン、に置き換えられます。 HPのスイッチの一般的特徴は、Tである彼最初のヒストン変異体による、その後の移行タンパク質による、最後にプロタミンによる正規のヒストンの交換。 12 -このすべては、ヒストン脱7,10の直前に、ヒストンH4のアセチル化レベルの急増などのエピジェネティックマークにいくつかの変更が添付されています。 全てではないが大部分は、上述した処理により、成熟した、完全に稔性精子の発達に必須である。これは、哺乳類の精子形成共有として、無脊椎動物のシステム1,8,9との類似、かなりの量のショウジョウバエでなく、人間だけでなく真実である。雄性生殖細胞の発達を研究することは大いにショウジョウバエモデル系において促進される。ハエは、遺伝的に非常にアクセス可能です。突然変異体の世代だけでなく、融合遺伝子またはRNA干渉構築物を発現するハエ株の確立は、少し手間がかかります。しかし、減数分裂後の精子形成の研究では、突然変異体の使用ANdは単純な遺伝子ツールが限界に達する可能性がある。 ショウジョウバエの精子形成において、転写は、減数分裂に入ると、ほぼ完全に停止する。 16 -このように、減数分裂後の精子形成は、主に拡張された減数分裂前期13で合成され、翻訳抑制され、保存されたmRNAに基づいています。そのため、RNA干渉または非条件付き突然変異体の利用のようなツールは、具体的にも前減数分裂または減数分裂生殖細胞の開発に不可欠な機能を果たす遺伝子産物の減数分裂後の役割を研究するのに適していない。 20 -このような場合に利用することができるショウジョウバエの一つの利点は、培地4,12,17にex vivoで開発するための解剖無傷精巣および生殖細胞のさえ嚢胞の能力である。精巣や生殖系列嚢胞の切開、培養を生細胞における生殖細胞の発達だけでなく顕微鏡観察を可能にするが、そのようなヒストンアセチルトランスフェラーゼグッズ（帽子）、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）、トポイソメラーゼ、またはプロテアソームの酵素複合体の阻害剤、例えば 、薬理学的ア ​​ッセイの使用LSO。これにより、減数分裂後の精子形成の際に酵素機能を操作するためにかかわらず、胚性減数分裂前、又は減数分裂の機能4,12の発達の結果を監視することが可能である。 薬理学的ア ​​ッセイでは、以前に減数分裂前期中のブロモドメインタンパク質のアセチル化に依存するローカリゼーションだけでなく、帽子やHDACは12,21をターゲットに特異的な阻害剤を使用して、減数分裂後の精子形成におけるエピジェネティックなHPのスイッチのヒストンアセチル化レベルの関連性を分析した。これらのアッセイにおけるHPのスイッチを標的とすることは融合遺伝子histone2AvD-RFPと内因性パターンのprotamineB-EGFP 12,22を表現するハエ株を使用することにより可能となり、観察したこと蛹精巣の最初の精子細胞は、24および48時間APF 12の間、HPのスイッチを通過します。 提示されたプロトコルは、 ショウジョウバエの蛹、培養条件、および無傷の蛹精巣を持つ薬理アッセイからの精巣および嚢胞の解剖を説明しています。この目的のために、蛹殻形成（APF）と、約24時間で蛹の精巣を解剖している（ 図1および2を参照）。この時、精巣は他の組織への接続を行っていないと阻害剤化合物23,24によって、より良い浸透を可能にする唯一の薄い外側シースに囲まれている。精巣は簡単に文化に撮影することができBean管理や洋ナシの形の器官です。これらの精巣を培養し、解剖し、そして特異的な阻害剤で処置される。続いて、阻害剤の効果は、免疫蛍光分析し、融合タンパク質発現の蛍光顕微鏡を用いて監視され、核モルホリンの比較により未処理の生殖細胞のものと処理された生殖細胞のOGY。このプロトコルで提示条件も培養中の精巣および生殖系列嚢胞を開発するライブイメージングを可能にする。

<table><tbody><tr><td>Anacardic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>172050</td><td>brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td></tr><tr><td>Anti-acetyl-Histone H4</td><td>Merck Millipore</td><td>06-598</td><td>brand: Upstate</td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver.Z1 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5-Inox forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optical&amp;nbsp; illuminator</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td><td>Dianova</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B1155</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop or pin holder</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td><td>Plano GmbH</td><td>N5018</td><td>In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td><td>Plano GmbH</td><td>N5014</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell plates, 24-wells</td><td>Becton Dickinson</td><td>351147</td><td>brand: Falcon</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>invitrogen</td><td>15070</td><td>brand: Gibco</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 binocular</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

哺乳類におけるおよびキイロショウジョウバエにおける精子形成の間に、雄の生殖細胞は、本質的な発達過程の一連の開発しています。これは、幹細胞集団、有糸分裂増幅、および減数分裂の分化を含む。また、減数分裂後の生殖細胞は、劇的な形態学的再成形プロセスだけでなく、生殖クロマチンヒストン·ツー·プロタミンスイッチのグ​​ローバルなエピジェネティックな再構成を受ける。 変異誘発または他の遺伝的ツールを使用して、減数分裂後の精子形成におけるタンパク質の役割を研究することは、多くの場合、調査中で本質的な胚、前減数分裂、またはタンパク質の減数分裂の機能によって妨害されている。このようなタンパク質の変異体の減数分裂後の表現型は、以前の発達ブロックを介して目立たなくすることができ、または表現型の解釈が複雑になることができた。モデル生物ショウジョウバエは、この問題へのバイパスを提供しています：無傷の精巣をし、初期の蛹から解剖生殖細胞のさえ嚢胞は培養液中にex vivoで開発することができます。そのような培養の使用を作ることは精巣で生殖細胞を生きたと生殖系列嚢胞の顕微鏡イメージングを可能にします。重要なことは、栽培精巣および生殖細胞は、それによって減数分裂後の段階を含む、精子形成の際に酵素機能の操作を可能にする、薬理学的阻害剤にアクセス可能になる。 提示されたプロトコルは、解剖や蛹精巣および生殖系列嚢胞を育成する方法について説明します。蛹精巣および培養条件の開発に関する情報は、培養中の生きた精巣および生殖系列シストの顕微鏡用撮像データと一緒に提供される。また、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤アナカルド酸を用いて、ヒストンからプロタミンスイッチをターゲットアッセイにより例示減数分裂後の精子形成を研究するための薬理学的なアッセイを説明します。原則として、この培養法は、多くのOに対処するために適合させることができる前後の減数分裂精子形成におけるTHER研究課題。

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.4K ビュー.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

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Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

神経科学

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

発生生物学

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

生物学

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

個々の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>エッグチェンバース

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

フライ精巣における撮像中心体

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

解剖、イメージング、および薬理学的治療：ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

要約

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全体の開発、ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

後期胚性ショウジョウバエ生殖腺の解剖とライブイメージング

の分離キイロショウジョウバエ精巣

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

個々の準備ショウジョウバエエッグチェンバース

フライ精巣における撮像中心体

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

要約

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全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

の分離キイロショウジョウバエ精巣

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

個々の準備ショウジョウバエエッグチェンバース

フライ精巣における撮像中心体

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色

解剖、イメージング、および薬理学的治療：ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

全体の開発、ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

後期胚性ショウジョウバエ生殖腺の解剖とライブイメージング