The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

윤리 문 : 이 프로토콜에 기술 된 실험 절차는 독점적 초파리 작업 및 독일의 동물 복지 관련 법률의 적용을받을 수 없습니다 포함한다. 미디어, 도구, 그리고 파리의 1 준비 <ol><li> 탄산 수소 칼륨 17없이 변경 시판 가루 M3 성장 매체를 준비합니다. 주의 : 눈과 피부를 자극 함. 10 % 소 태아 혈청으로 보충 배지, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg은 / ㎖ 스트렙토 마이신. 최상의 결과를 위해 열 불 활성화 및 곤충 배양 테스트 태아 혈청을 사용합니다. -20 ° C에서 분취에서 0.2 μm의 병 상단 필터 장치 및 저장을 통해 (중간이라고 함) 완전 배지를 필터링합니다. 사용 전에 필터 (0.2 μm의 주사기 필터 팁) 매체는 다시 침전물을 제거합니다. </li><li> 약리학 적 분석에 대한 억제제 원액을 준비합니다. Dissol분량 씩 적당한 용매 및 저장소의 화학 물질을했습니다. (: 눈과 피부를 자극주의)을 디메틸 설폭 시드 예를 들어, 28.69 mM의 anacardic 산의 재고 솔루션을 준비합니다. </li><li> 해부 번데기 고환 및 단일 낭종 절제술의 중단을위한 도구를 준비합니다. 이 샤프하고 딱딱한 바늘보다는 포셉 쌍을 사용한다. 집게의 쌍의 2 개의 아암 사이에 개발 모세관 력은 매우 어려운 매체 소량 단일 낭종 절개한다. 예를 들어, 접종 루프 홀더에 삽입 스테인리스 곤충 핀의 끝을 사용한다. </li><li> 성인 초파리 충분한 수 (약 40-60 파리)와 적절 세 번데기, 씨앗을 약 10 대형 배양 병 (4cm 직경 튜브)를 얻기 위해. HP 스위치를 분석하기 위해, 자신의 내생 패턴 12,16,22에 H2AvD-RFP 및 ProtamineB-eGFP는 표현 파리를 사용합니다. 25 ℃ 표준 조건 하에서 배양 바이알; 최대 4-5일 셋째-령 유충 크롤링까지 약에 대한 C ° 및 튜브 (25)의 벽에 번데기를 시작합니다. </li></ol> 해부를위한 24 시간짜리 번데기를 구하는 2 마킹 또는 화이트 수집 예비 - 번데기 <ol><li> , HP 스위치에 특정 화학 물질의 영향을 테스트 약 24 시간 APF 12에서 번데기 고환을 해부합니다. 무대 번데기를 구하려면 유충을 pupating로 준비된 플라이 문화 유리 병을 (섹션 1.4 참조) 가능한 많은 흰색 사전 번데기를 식별합니다. 번데기에서 첫 번째 단계에서 사전 번데기는 움직이지 않은 먹이, everted spiracles과 흰색 색상의 번데기와 오히려 단축 애벌레로 나타납니다. 번데기는 번데기 개발 (26)의 다음 단계를 나타냅니다 30-60 분, 내 황갈색 갈색이된다. </li><li> 튜브의 외측에 영구 마커 사전 번데기의 위치를​​ 표시한다. 약 24 시간 동안 25 ° C에서 튜브를 품어. <ol><li> 또한,PBS 버퍼에 적신 작은 붓으로 유리 병의 측면에서 사전 번데기을 선택합니다. 그런 다음 새로운 50 ㎖의 반응 관의 측면에 사전 번데기를 전송하고 약 24 시간 동안 25 ° C에서 배양. </li></ol></li></ol> 번데기 형성 후 약 24 시간에서 번데기 고환의 3 해부 <ol><li> 10cm 플라스틱 세포 배양 또는 배양 접시에 매체의 몇 방울 (약 80 ㎕의 각)를 배포합니다. 집게의 폭 넓은 쌍 또는 중간에 적신 브러쉬를 사용하여, (섹션 2 참조) 배양 병에서 24 시간 APF 단계에서 번데기을 선택합니다. 접시에 매체의 각 드롭 한 번데기를 전송합니다. </li><li> 절개를 들어, 광섬유 일루미네이터 구비 입체 현미경을 사용한다. 이 문화에 적절한 개발을 방지 할 수로 해부하는 동안 RT 위 고환에 열을 가하지 마십시오. <ol><li> 제 5 집게 이쌍와 번데기를 해부하다. 한 쌍으로, 가장 후방에서 번데기를 잡아일부 (후부 spiracles) 및 위치에 고정. </li><li> 포셉의 다른 쌍의 앞쪽에 spiracles을 잡고 그 앞쪽 끝에서 번데기 아가미를 엽니 다. 흉부의 적어도 일부가 노출 될 때까지 번데기 케이스를 벗겨. </li><li> 가장 후단에 의해 위치에 번데기를 계속 누르고 있습니다. 번데기의 내부 압력을 해제하려면, 번데기의 머리 영역으로 집게의 쌍의 두 팔을 삽입합니다. </li><li> 집게를 열고 앞쪽 방향으로 집게를 이동하여 열려있는 번데기를 추출. 이 운동으로 생성 된 개방의 첫 번째 시도에서 가능한 한 커야합니다. 압력이 고환이 작은 구멍을 통해 직접 추진되고 가장 자주 중단되고이 있으므로 출시되기 전에 그 후방 끝에서 번데기의 손상을 방지. </li><li> 번데기가 개방되면, 번데기의 방출 내압 라 통해 신체 지방 세포 및 조직의 응집체를 누르는 것을 관찰헤드 영역 RGE 개구. 번데기 고환이 이미이 물질 번데기 밀려되었는지 여부를 확인합니다; 이는 어떤 경우에 일어난다. 고환은 24 시간 APF에서 다른 조직에 연결되어 있지 않은, 따라서 번데기 23에서 쉽게 배출 될 수 있습니다. </li><li> 그들은 번데기에 남아있는 경우이 고환 손상을 줄 수 있으므로 집게와 번데기를 압박하지 마십시오. 한 쌍의 핀셋을 사용하여 개구의 크기를 증가시킨다. </li><li> 그런 다음 가장 후단에 번데기를 개최합니다. 번데기에서 고환을 해제 전방에 후방에서 번데기의 내용을 밖으로 다른 집게 쌍 부드럽게 행진을 닫습니다. </li></ol></li><li> 미리 잘라 200 μL 피펫 팁으로 그들을 잡아 당겨 고환을 수집합니다. 고환과 전송 체 지방 세포의 수를 줄이기 위해 매체의 단지 매우 소량의 전송을 시도. 새로운 배양 접시에서 매체로 고환을 놓습니다. 단 몇 지방 바디 셀 때까지 고환에게 매체와 여러 번 세척의는 남아있다. </li><li> 라이브 영상의 경우, 매체와 유리 바닥 배양 접시에 고환을 전송하고 반전 영상 현미경을 사용합니다. 약물 분석의 경우, 5 단계를 계속합니다. </li></ol> 남성 생식 줄 낭종 및 라이브 영상의 4 해부 <ol><li> 유리 바닥 배양 접시에 하나 이상의 번데기 고환을 전송합니다. </li><li> 광섬유 조명과 두 개의 스테인레스 스틸 바늘 스테레오 현미경을 사용하여 남성 생식 세포 낭종의 해부 (1.3 절 참조). <ol><li> 한 바늘,주의 깊게 전방 또는 후방 끝에 하나의 고환을 고정하려고합니다. 위치를 잡습니다. 고환에 다른 바늘을 삽입하고 옆으로 바늘을 이동하여 고환 칼집을 방해. 낭종의 대부분은이 운동에 의해 고환에서 발표 될 예정이다. </li><li> 한 바늘 위치에있는 고환을 계속 누르고 있습니다. 다른 바늘 고환에서 남아있는 낭종 밖으로 조심스럽게 행진. </li><li> 신사로 구분 집계 낭종 중LY는 낭종의 클러스터를 통해 또는 200 μL 피펫 팁을 사용하여 매체와 새로운 배양 접시에 낭종을 전송하여 옆으로 바늘을 이동. </li></ol></li><li> 단일 낭종의 라이브 이미징을위한 반전 영상 현미경으로 배양 접시를 이동합니다. 바늘 필요하다면 다시 낭종을 분산. <ol><li> 위상 콘트라스트와 형광 현미경을 사용하여 낭종의 무대를 확인합니다. </li><li> 원하는 단계의 낭종에 초점을 맞 춥니 다. 낭종이 배양 접시의 바닥에 부착하기 때문에 초점이 떠있는 경향이하지 않는, 자주 이상 이미징 실험을하는 동안 초점과 낭종의 위치를​​ 확인합니다. 참고 : 고정화 폴리-L-라이신과 함께 요리를 코팅하는 초기 배아 줄 낭종의 발전에 해 롭습니다. 대신, 개별 낭종이 분리 될 수있다. 약간의 연습으로, 아주 조심스럽게 바늘로 눌러 특정 낭종을 지목 할 수있다. 이것은 별도의 숭배 단일 낭종의 전송을 허용합니다현미경의 시야에 맞는 그려진 아웃 팁 유리 파스퇴르 피펫 우레 요리. 격리 된 낭종은 다음도 쉽게 장기 배양 한 후 배양 접시에 재배치 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 본래 번데기 고환과 5 약리 분석 <ol><li> 12 회 반복 한 실험의 배지 500 ㎕를 함께 24 - 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰을 채운다. 미리 잘라 200 μL 피펫 팁을 사용하여 각 웰에 전송 한 번데기의 고환. <ol><li> 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 격리 된 고환에서 프로타민의 존재를 확인합니다. 고환은 HP 스위치가 낭종의 하나에 자리를 차지하게되지 않았 음을 나타냅니다 ProtamineB-eGFP는 신호 없어야합니다. 이미 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종을 보여 고환을 교체합니다. </li><li> 제 12 웰에 원하는 최종 농도에 도달하기 위해 희석 된 저해제 화합물 (anacardic 산)을 함유하는 배지 500 μl를 추가웰당 배지 1 ㎖ 중의 (150 μM). 처리되지 않은 컨트롤과 같은 나머지 우물을 사용; 억제제 화합물과 함께 사용되는 용매로 동일한 양으로 배지 500 μl를 추가한다. 주 : 많은 다른 화합물 및 용매를 사용하는 경우, 대조군으로 단독 배지를 사용하는 것이 더 효율적일 수 있으며 별도의 실험에서, 용매의 농도를 증가의 영향을 테스트하기 위해. </li></ol></li><li> 어둠 속에서 24 시간 동안 25 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 전술 한 바와 같이 배양 고환에 프로타민의 존재를 다시 확인합니다. 제어 고환 이제 HP 스위치를 통해 전환을 나타내는 하나 이상의 ProtamineB-eGFP는 양성 낭종을 표시해야합니다. </li><li> 200 ㎕의 팁과 피펫을 사용하여, 폴리-L-라이신 코팅 된 슬라이드에 고환을 전송 다른 12,27,28 설명 된대로 적절한 형광 항체 스쿼시 준비 및 얼룩을합니다. </li></ol>

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저자는 경쟁의 이익이 없다.

제시된 프로토콜은 특정 발달 단계에와 배양 접시에있는이 세포와 조직의 생체 개발에 초파리 고환 및 단일 배아 줄 낭종을 해부 할 수있는 능력에 모두 기반이 각 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 하나의 응용 프로그램은 정자 개발하는 동안 중요한 프로세스의 약리 조작이다. 중요한 것은이 쉽게 비행 유전학을 기반 기능 분석을 사용하여 얻은되지 후 감수 정자에 액세스 할 수 있습니다. 다른 애플리케이션은 생활과 생식 세포 및 정소 개발 현미경 관찰이다. 특히 문화에 초파리 세포와 장기의 기능이 응용 프로그램의 이점은 생존하고 RT에서 정상적인 분위기에서 개발. 따라서, (25 ° C의 표준 사육 온도로 가열) 가열 단계가 장착 된 반전 영상 현미경 라이브 이미징 실험에서 의미있는 결과를 얻기에 충분하다. 또한라이브 이미징을위한 형광 단백질 태그 단백질을 표현하는 더 많은 유전자 변형 플라이 균주가 존재하거나 쉽게 설정할 수 있습니다. 특정 발달 단계의 번데기 고환 또는 세균 줄 낭종을 얻으려면, 그것은 하나가 초파리 개발의 타이밍을 잘 알고하는 것이 중요합니다. 각 단계에 대한 정확한 타이밍은 실험실 배양 조건에 따라 다양하고, 긴장을 비행 경험적으로 설정해야 할 수도 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 이것은 예를 들면, HP 스위치를 대상으로, 약리학 분석에 특히 중요하다. 이러한 실험의 경우, 타이밍도 한 집단 내에서 약간 다를 수 있기 때문에 항상 실제 억제제 시험 전에 ProtamineB-eGFP는 신호 정자를 확인하는 것이 좋습니다. 첨부 된 지방이 신체 조직의 무료 그대로 장기 조기 번데기 단계에서 고환을 해부 실험을 가능하게해야 위의 프로토콜에 따라. 이 고환과, 더욱 더, GE의 격리RM 줄 낭종은 매우 약합니다. 그러므로, 취급 및 집게, 바늘 및 피펫을 이용하여 정소 낭종 및 전사에 필요한 손재주와 경험을 개발하는 것이 중요하다. 특히 감수 초 후 감수 생식 세포 발달을 목표로 연구는이 혜택을 누릴 것입니다. 그것은 성인 고환에서 긴 편모 늦은 정자의 낭종을 해부 비교적 쉽지만, 그것은 이전 스테이지를 얻기 어렵다. 이 프로토콜 다음과 같은 초기 번데기 고환에서 이러한 낭종을 해부하는 것은 훨씬 더 효율적입니다. 일반적인 비행 피로, 번데기 만 약 50 %가 남성 될 것 명심하십시오. 따라서, 필요한 고환의 수만큼 번데기 적어도 두번 해부 준비. 대안으로, 고환이 그대로 유충 3:23, 34의 좌우 지방 신체 조직에 매립 반투명 라운드 장기를 식별 할 수 있으므로, 입체 현미경을 사용하여 남성 L3 유충을 식별하기, 및 신선한 배양 병에 그들을 수집 할 수 있음 수준비 및 해부에 대한 사전 번데기를 선택하는 데 사용 될 수있다. 이는 남성 미리 35 번데기를 식별하는 것도 가능하다. 이전에 18에보고 된 바와 같이 우리는 격리 된 세균 줄 낭종과 문화에서 그대로 번데기 고환이 모두 빛에 민감한 것으로 나타났습니다. 이 빛이 감도는 약물 학적 분석에 사용되는 일부 화학 물질에 대한 유지 수 있습니다. 따라서, 배양 동안 어둠 속에서 분석의 배양 접시를 유지하는 것이 가장 좋습니다. 개발 고환과 함께 시간 경과 이미징 실험을 계획 할 때 마찬가지로, 특히, 절연 낭종은 너무 긴 노출 시간 및 / 또는 너무 높은 샘플링 속도가 생체 개발을 억제 할 수 있습니다 점에 유의하십시오. 적절한 샘플링 레이트는 실험적으로 결정되어야한다. 배양 접시에서 세균 및 / 또는 곰팡이 감염 이상 성장은 심각한 문제가있다. 너무 많은 세균에 감염된 배양 접시는 생체에는 Deve을 지원하지 않습니다고환 및 낭종의 lopment. 따라서, 설명 된 배지 페니실린 및 스트렙토 마이신 (단계 1.1 참조)하지만, 장기 배양 중에 포함 이러한 항생제는 저하 될 수 있으며 그들의 활성을 감소 것이다. 이는 생존 기간 한정 이유 중 하나 (최대. 72 시간) 상기 프로토콜을 사용하여 관찰 할 때 배양 낭종 수 있었다. 그러나이 시간 프레임은 요리 배지 정규 교환에 의해 확장 될 수 없었다. 우리는 다른 요소는 생식기의 다른 조직에서 성장 신호들의 부족으로, 배양 생존에 영향을 미칠 수 있음을 결론 지었다. 한편, 이후의 개발이 빠르게 감수 초파리 포유류보다. 초파리에서 spermiogenesis은 약 90 시간 소요되며, HP 스위치는 감수 분열 9,12 후 50 ~ 60 시간 사이에 일어난 일입니다. 따라서이 프로토콜을 구현할 약 48 시간의 통상의 생존 시간은 SPE에 피봇 발생 과정을 수행하기 위해 적합같은 감수 분열 또는 HP의 스위치로 rmatogenesis. 세균 또는 진균의 오염이 깨끗 툴과 미디어를 사용함으로써 회피 될 수 있지만, 제시된 프로토콜은 파리 때문에 엄격히 무균 작업 조건을 사용하고 표준 조건 하에서 발생하는 경우 정소 이미 박테리아를 포함하는 비행하지 않는다. 그럼에도 불구하고,이 문화 기술의 일부 응용 프로그램은 해부 파리 혜택을 누릴 수 있습니다 또는 (프로토콜, 17,36,37 참조) 무균 조건에서 발생합니다. 약리 분석법 억제제 또는 각종 효소의 활성화 제로서 작용하는 화학적 화합물의 용도에 따라 다르다. 일반적으로 그러한 실험에 사용 된 화합물은 종종 타겟 특이성에 크게 다르다. 이점으로서,이 산 anacardic 억지 P300 / CBP, PCAF,와 모자 (38)의 MYST 가족 구성원, 예를 들어, 전체 효소 클래스를 타겟팅 할 수있는 잠재력을 제공한다. 이 방법의 단점은 오프 대상 또는 세포 독성 효과 INDUC 잠재력이 될 수이러한 화합물에 의해 에드. 따라서, 번데기 고환 또는 낭종 분석에 사용 된 각 화합물은 세포 독성 및 다른 농도에서 특정 효과를 테스트해야합니다. 또한, 배양 조건, 화합물 농도 또는 활성 및 세포 투과도의 변화에​​ 약간의 차이가 유도 효과의 변동을 초래할 수있다. 따라서, 각각의 실험에서 치료 성공을 모니터링하는 것이 필요하다. 우리가 150 μM에서 anacardic 산을 사용할 경우 히스톤 H4 아세틸 지속적으로 감소하면서 예를 들어, 우리는 간 때로는 약간 고환 내의 염색질 응축 표현형의 강도에 약간의 변화를 관찰했다. 배양 초파리 고환과 약리 분석법은 정자 4,12,14,21의 전후 감수 기전을 분석하기 위해 사용되어왔다. 이 유전자 도구 후 감수 정자에 액세스 할 수 어렵 기 때문에 된 essentia와 선수를 대상으로합니다L 개의 사전 감수 및 감수 기능이 생체 외 접근법은 대안을 구성한다. 또한, 원칙적으로, 상기 방법은 시간이 지남에 따라 처리 된 생식 세포의 발달을 따라 실험 - 펄스 추적하도록 구성 될 수있다. 그러나, 우리는 아직이 가능성을 시험하지 않았다. 초기 번데기 고환을 사용하는 것은 약물 분석의 장점이다. 첫째, (24 시간 APF 정도) 젊은 번데기 고환의 얇은 외피는 화학 물질의 개선 투자율을 허용 할 수 있습니다. 포스트 감수 HP 스위치를 공부 둘째, 번데기 고환은 HP 스위치가 영향을 받거나되었는지 여부의 직접 판독을 가능하게 프로타민-GFP 발현 플라이 라인에서 24 시간 APF에서 해부. 현재까지, 초파리 기관, 고환 및 생식 - 라인 낭종을 포함한 조직의 생체 외 배양을위한 여러 프로토콜 (예 4,14,17,20,39,40 참조)이 개발되었다. 재배 매체에 사용되는 일반 조건1979 년에 설립되었다 여기에 제시된 프로토콜 17. 문화 시스템은 나중에 성인 고환 사에서 분리 후반 이후 감수 낭종의 개별화기구의 생체 내 이미징에 적응했다. 이전에, 우리는 이러한 조건이 또한 주위에 48 시간 12 그들의 낭종에서 생존과 감수 초 후 감수 생식 세포의 분화를 지원한다고합니다. 다른 문화 시스템 (19)과는 대조적으로이 문화에서 관찰 발달시기 (자세한 내용은 12 참조) 고정 된 샘플에서 결정 타이밍에 대략 일치했다. H2AvD-RFP 및 프로타민-GFP 형광 신호는 배양 생식 세포의 핵 염색질 형태 및 조성물을 시각화 할 수있다. 우리는 문화의 발달 단계의 명확한 식별을 위해이 같은 낭종의 코일과 같은 다른 기준 유리한 것으로 나타났습니다. 중요한 것은, 제시된 프로토콜은 플라이 EXT의 첨가를 포함하지 않는다소 태아 혈청 이외 RACT 또는 다른 성장 인자. 또한, 우리는 조건이 체외 문화 감수 분열의 형광 현미경 영상과 호환되는지 여기 보여준다. 이미지는 장기 발전을 지원하기 편한 매체 적당한 해상도를 얻을 수있다. 이것은 Voltalef 오일 41,42에서 단기 (약 3 시간)의 관찰을 가능하게하는 프로토콜 대조적이다. 재배 및 번데기 고환 및 단일 남성 생식 세포 낭종의 약물 치료를 위해 위에서 설명한 절차는 초파리의 정자에서 연구 할 수있는 많은 유전, 후성 유전 학적, 생물학적 세포, 또는 발달 질문에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 세균 온라인 줄기 세포에 초점을 맞추고, 특히 연구를 포함한다. 그것은 배양 성인의 라이브 영상 다음에 할 수있는 줄기 세포 개발이 20,43를 고환 보였다. 그러나, 성숙한 정소의 연동 운동 수렁시간은 이미지 수집 방해합니다. 따라서, 어느 촬상 단편화 고환 43 또는 실시 이미징 실험의 수는 손실 된 데이터 집합 (20)을 설명하기 위해 증가되어야한다을 사용하여 수행된다. 초기 번데기 고환 (24 시간 APF)는 아직 근육 세포에 동봉되어 있지 않습니다. 조금이라도 나이가 고환 (36-45 시간의 APF)은 몇 연동 움직임을 보여줍니다 (그림 3 및 보충 비디오 비교 1) 나타납니다. 따라서, 그대로 장기 어린 번데기 고환의 재배가 대안이 될 수있다. 또한, 한 번, 번데기 고환을 해부 할 수있는 능력을 숙달 결국 고립 세균 줄 낭종은 작은 세포 집단이기는하지만 동종의 소스로 단일 낭종을 사용하여 추가 응용 프로그램을 수 있습니다. 이미 증명 된 바와 같이 예를 들어, 그것은, 정자의 정의 단계 동안에 특정 유전자의 전사 조절을 분석하기 위해 RT-qPCR에 수행하는 것이 가능하다 <sup&gt; 15.

많은 종의 수컷 생식 세포의 발달 과정은 순차적이다. 형태 학적 및 성적으로 고도의 전문 정자의 형성에 절정에 중요한 일련의 사건이 특징입니다. 초파리에서, 고환 분할의 끝에서 세균 라인 줄기 세포는 비대칭 1,2 (개요를 그림 1 참조) 새로운 줄기 세포와 spermatogonium, 즉 차별화하기 위해 최선을 다하고 딸 셀을 야기합니다 . spermatogonium는 감수 분열의 시작과 함께 인상적인 성장과 전사 활동의 단계가 spermatocyte 단계라고, 유사 분열 분열의 네 라운드를 거쳐합니다. 하나 spermatogonium 유래 세포는 서로 접속하고이 체세포-구조 낭종이라고도 래핑 동기화 번들로 발전 유지. 감수 분열이 완료되면, 수컷 생식 세포의 형태가 완전히재구성 (개략적으로도 1에 도시). 처음 라운드 정자는 유체 역학적 헤드 구조를 형성하는 신장 및 편모가 개발한다. 5 - 결국, 정자 세포는 개별화 3이라는 복잡한 세포 자멸 - 관련 메카니즘에 의해 서로 분리된다. 9 - 노랑 초파리와 포유 동물 종을 포함하여 많은 종에서는 반수체 남성 생식 세포의 크로 마틴의 놀라운 후생 유전 학적 재 배열을 동반 생식 세포의 형태 학적 변화는 (HP 스위치) 6 히스톤 - 투 - 프로타민 스위치를했다. 아마도 거의 모든 표준 히스톤 많은 히스톤 변종 분자는 DNA에서 제거하고 성숙 정자의 크로 마틴에 특정 매우 컴팩트 한 nucleoprotamine 구조의 결과로 작은 기본적인 단백질 프로타민에 의해 대체된다. HP 스위치의 일반적인 특성은 t이다먼저 전이 단백질에 의해, 그리고 마지막으로 프로타민에 의한 히스톤 변형에 의해 정식 히스톤의 그는 교체. 12 -이 ​​모든 히스톤 제거 7,10 직전에 같은 히스톤 H4의 아세틸 화 수준의 급등 등의 후생 유전 학적 마크가 일부 변경, 동반한다. 전부는 아니지만 대부분은, 상술 된 공정의 성숙, 완전히 가임 정자의 개발에 필수적이다. 이것은 포유류의 정자의 공유로, 무척추 시스템 1,8,9와 유사성 상당한 양의 초파리뿐만 아니라 인간뿐만 아니라 사실이다. 남성 생식 세포 발달을 공부하는 것은 크게 초파리 모델 시스템에서 촉진된다. 파리는 유 전적으로 매우 액세스 할 수 있습니다. 돌연변이의 발생뿐만 아니라 융합 유전자 또는 RNA 간섭 플라이 구조 발현 균주의 설립은 적은 노력한다. 그러나, 포스트 - 감수 정자, 돌연변이 체의 사용 연구D 유전자 간단한 도구 한계에 도달 할 수 있었다. 초파리의 정자에서 전사는 감수 분열에 항목으로 거의 완전히 중단. 16 - 따라서, 포스트 감수 정자는 주로 확장 감수 의향 (13)에서 합성 병진 억압 저장 mRNA를 기반으로합니다. 따라서, RNA 간섭 또는 비 조건부 변이체의 사용과 같은 도구는 또한 특별히 미리 감수 또는 감수 생식 세포 발달에 필수적인 기능을 수행 유전자 산물의 사후 감수 역할을 연구하는데 적합하지 않다. 20 - 이러한 경우에 이용 될 수있다 초파리의 장점 중 하나는 문화 매체 4,12,17에 생체 개발을 해부 그대로 고환 생식 세포의 경우에도 낭종의 능력이다. 고환이나 세균 줄 낭종의 해부 및 재배는 살아있는 세포에서 배아 세포 개발뿐만 아니라 현미경 관찰을 할 수 있지만LSO와 약리학 적 분석의 사용 등, 이러한 히스톤 acetyltransferases (HAT들), 히스톤 디 아세틸 라제 (HDACs), 토포 이소 머라 제 또는 테아 같은 효소 복합체의 억제제. 따라서, 포스트 - 감수 정자 중에 효소 기능을 조작과 관계없이, 전 배아 감수 또는 감수 4,12 기능의 발달 결과를 모니터링하는 것이 가능하다. 약리학 적 분석에서, 우리는 이전 감수 의향 동안 bromodomain 단백질의 아세틸 화에 의존하는 지역화뿐만 아니라 모자 HDACs 12,21 타겟팅 특정 억제제를 사용하여 포스트 감수 정자의 후생 유전 학적 HP 스위치 히스톤 아세틸 화 수준의 관련성을 분석 하였다. 이러한 분석에서 HP 스위치를 표적으로하는 융합 유전자 histone2AvD-RFP 및 내인성 패턴 protamineB-eGFP는 12, 22를 표현하는 비행의 피로를 사용하여 가능하게하고, 관찰 한 것번데기 고환에서 정자 제 24 및 48 시간 (12) 사이 APF HP 스위치를 통과한다. 제시된 프로토콜은 초파리의 번데기, 배양 조건, 그대로 번데기 고환과 약물 분석에서 고환 및 낭종의 절개를 설명합니다. 이를 위해, 번데기 형성 (APF) 후 약 24 시간에서 번데기 고환 해부 (도 1 및 2 참조). 이때, 정소는 다른 조직에 대한 연결을하지 않은과 억제제 화합물 23,24으로 더 침투를 허용 만 얇은 외피에 의해 둘러싸여있다. 고환은 쉽게 문화에 취할 수 bean- 또는 서양 배 모양의 기관입니다. 이 고환 배양, 해부, 특정 억제제로 처리됩니다. 이어서, 억제제의 효과는 면역 형광 분석하고 융합 단백질 발현을 형광 현미경을 사용하여 관찰하고, 핵 morphol 비교함으로써미처리 된 생식 세포의 치료에 생식 세포의이 ogy. 이 프로토콜에서 제시하는 조건은 문화 고환 생식 세포 낭종을 개발의 라이브 영상을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Anacardic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>172050</td><td>brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td></tr><tr><td>Anti-acetyl-Histone H4</td><td>Merck Millipore</td><td>06-598</td><td>brand: Upstate</td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver.Z1 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5-Inox forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optical&amp;nbsp; illuminator</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td><td>Dianova</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B1155</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop or pin holder</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td><td>Plano GmbH</td><td>N5018</td><td>In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td><td>Plano GmbH</td><td>N5014</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell plates, 24-wells</td><td>Becton Dickinson</td><td>351147</td><td>brand: Falcon</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>invitrogen</td><td>15070</td><td>brand: Gibco</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 binocular</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

포유류 및 노랑 초파리의 정자 중에 수컷 생식 세포가 필수적 발생 과정의 일련의 개발. 이 줄기 세포 인구, 유사 분열 증폭 및 감수 분열에서 차별화가 포함되어 있습니다. 또한, 포스트 - 감수 세균 세포 형태학 극적인 재 형성 공정뿐만 아니라 생식 라인 염색질 히스톤 투 프로타민 스위치 글로벌 후생 유전 학적 재구성을 겪는다. 돌연변이 또는 기타 유전 적 도구를 사용하여 포스트 감수 정자에서 단백질의 역할을 연구하는 것이 종종 필수적 배아 사전 감수, 또는 조사 하에서 감수 단백질의 기능에 의해 방해된다. 이러한 단백질의 돌연변이 체의 사후 감수 표현형의 발달 이전 블록을 통해 가려 질 수있는, 또는 표현형의 해석은 복잡 할 수있다. 모델 생물 초파리 melanogaster가이 문제에 대한 바이 패스 제공 : 그대로 고환 및초기 번데기 해부 생식 세포의 경우에도 낭종 배지에서 체외 개발할 수있다. 이러한 문화를 만들기 사용은 고환과 배아 줄 낭종의 생식 세포 생활의 미세한 영상을 수 있습니다. 중요한 것은, 재배 및 고환 생식 세포는 감수함으로써 사후 단계를 포함하여, 정자 중에 효소 기능의 조작을 허용하는, 약리학 적 억제제가 액세스된다. 제시된 프로토콜은 해부 번데기 고환 생식 세포 낭종을 배양하는 방법에 대해 설명합니다. 번데기 고환 및 배양 조건의 개발에 대한 정보는 문화에 살고 고환 생식 세포 낭종의 현미경 영상 데이터와 함께 제공됩니다. 또한 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 억제제 anacardic 산을 사용하여 히스톤 투 프로타민 스위치를 표적 분석을들 포스트 감수 정자 형성을 연구하는 약리학 적 분석을 설명한다. 원칙적으로,이 배양 방법은 많은 O를 해결하도록 구성 될 수있다사전 및 사후 감수 정자에서 거기 연구 질문.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

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Research

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Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.4K 조회수.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

비디오: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

연구

신경과학

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

의 두부 컴플렉스 유전 유도하고 양성 및 침윤성 종양의 시각화를위한 프로토콜<em&gt; 초파리</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

의학

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

발생학

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

생물학

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

비행 고환에있는 영상 중심체

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm development. However, immunolabeling of the whole Drosophila testis is often associated with significant non-uniformity of staining due to antibody penetration. Squashed preparations only partially overcome the problem since it decreases the 3D quality of the analyses. Herein, we describe a whole-mount protocol using NP40 and heptane during fixation together with immunolabeling in liquid media. It preserves the volume suitable for confocal microscopy together with reproducible and reliable labeling. We show different examples of 3D reconstitution of spermatocyte nuclei from confocal sections. The intra- and inter-testes reproducibility allows 3D quantification and comparison of fluorescence between single cells from different genotypes. We used different components of the intranuclear MINT structure (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) as well as two components associated with the nuclear pore complex to illustrate this protocol and its applications on the largest cells of the testis, the S4-S5 spermatocytes.

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

We present here an improved protocol for the whole-mount preparation and immunostaining of Drosophila testes, suitable for confocal microscopy and also allowing reproducible and reliable labeling. We illustrate this protocol by 3D representation and quantification of colocalization experiments on the large S4-S5 spermatocytes.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

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