המחבר מבקש להודות לכל סטודנט לתואר ראשון שלי עצמאי תלמידי מחקר ואת כל הסטודנטים לתואר השני מיקרוביאלית הפיסיולוגיה שלי שנבדקו רעיונות mutagenesis transposon במהלך הסמסטרים אביב 2010-2014. עבודה זו מומנה על ידי המחלקה למדעי ביולוגיה באוניברסיטת מדינת יאנגסטאון.

1. Electroporation של תאים מוסמכות 5,11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל O / תרבות N LB של sp Enterobacter. YSU 1/20 ל -50 מיליליטר של מדיום LB הטרי ולגדול עם רועד ב120 סל&quot;ד ו -30 ° C עד OD (600 ננומטר) בין 0.4 ו -0.6. לחלופין, לגדול זני חיידקים אחרים בטמפרטורת הצמיחה האופטימלית שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל התאים על קרח למשך 5 דקות ו צנטריפוגות ב 4 ° C ו -7,000 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend תאי 50 מיליליטר של מים סטריליים קרח קרים ו צנטריפוגות ב 4 ° C ו -7,000 XG למשך 5 דקות. חזור על פעולה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend התאים בנפח מים קרים כקרח שווים לגלולת נפח תא. עבור אחסון לטווח ארוך, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של קרח קר 10% (v / v) גליצרול, גלול בשווה גלולה נפח של קרח קר 10% (v / v) גליצרול, חנות ב -80 מעלות צלזיוס, והפשרה על קרח לפני electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl של transposome 40 μl שלתאים. פתרון transposome זמין המסחרית מסופק בריכוז ה- DNA של 0.33 מיקרוגרם / μl. למרות 0.33 מיקרוגרם מומלץ, 0.165 מיקרוגרם DNA מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת התא / transposome בקרח קר, 0.2 מ&quot;מ, קובט electroporation ולהקיש על התערובת לתחתית של קובט. לזעזע את התאים ב 25 μF, 200 Ω, ו -2.5 קילו וולט. כדי להבטיח שהתאים נשארים מקוררים, לאחסן cuvettes electroporation במקפיא C -20 ° לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד, להוסיף 960 μl של מסנן מעוקר מרק סופר אופטימלי עם דיכוי catabolite בינוני (SOC). מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהעביר את תאי צינור microfuge סטרילי 1.5 מיליליטר. הערה: התאים מתחילים למות לאחר ההלם, אבל מלח במדיום SOC מאפשר להם להתאושש. כדי לחסוך, אין זה הכרחי להוסיף transposome או לזעזע את תאי בקרה השליליים. רק להוסיף 960 μl בינוני SOC סטרילי אליו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס ואו דקות 45-60 עם רועד ב120 סל&quot;ד. זה מספק זמן לtransposome ללהשתלב מחדש עם גנום המארח ולתאים להביע התנגדות kanamycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות של תאים 100 μl על צלחת אגר LB-קאן ודגירת O הצלחת / N ב 30 מעלות צלזיוס. אחסן את תערובת הטרנספורמציה שנותרה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. מורחים סכומים נוספים במועד מאוחר יותר עד 2 שבועות לאחר electroporation הראשוני במידת צורך. </li></ol> 2. gridding של transformants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרט רשת למכסה של צלחת פטרי מ&quot;מ ריקה 100 x 15. העתק רשת מ&quot; ​​קורס קצר בקטריאלי הגנטיקה &quot;12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתוח קו על החלק התחתון של צלחת אגר LB-קאן. השתמש בפיסה קטנה של סרט לעגן אותו למכסה gridded כך שהרשת היא גלויה לעין דרך אגר. ודא שהשורה על החלק התחתון של הצלחת מיושרת עם החלק העליון, מרכז הרשת. עיגון הצלחת עם קלטת שומר עליו מפני החלקה, ומאפשר לאף gridding. הקו מאפשר זיהוי מושבה לאחר ציפוי העתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר transformant יחיד עם קיסם סטרילי ולהבחין בו במרכזה של כיכר ברשת. רק לגעת במושבה והמקום. לא לחפור הקיסם לתוך אגר. כדי למנוע זיהום הצלחת, להתמודד עם הקיסם רק בקצה אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט transformant נוסף בכיכר סמוכה כמו בשלב 2.3. כאשר הצלחת מלאה, דגירה אותו O / N ב 30 מעלות צלזיוס. זה צלחת האדון. </li></ol> 3. Replica ציפוי לקביעת Auxotroph הפנוטיפ 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת שgridded, להפוך את ערימה של שלוש צלחות טריות אגר ממוספרות אחד עד שלוש: אחד לLB-קאן, שני לM-9-קאן ושלושה לLB-קאן. ייבש את הצלחות הפוכות, O / N, על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר קו בחלק העליון של כל צלחת כמו בשלב 2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את כלי ציפוי העתק עם 70% אתנול, למקם את כיכר קטיפה סטרילית על גבי ציפוי ההעתק לol ולצבוט את כיכר הקטיפה. ידיים רוחשת חיידקים גם לאחר שטיפתם. למנוע הכניסה של זיהום חיידקים על ידי הטיפול מרובע הקטיפה בקצה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר קו על צלחת ההורים עם קו משורטט על המהדק ומניח את הצלחת על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מהצלחת לכיכר הקטיפה. היזהר שלא למרוח את החיידקים. הסר את צלחת האב מכיכר הקטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הקו שצויר על מספר לוחית אחד עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מכיכר הקטיפה לצלחת. הסר את מספר לוחית אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את כיכר הקטיפה לתוך כוס מים ומניח את ריבוע נקי, סטרילי קטיפה על כלי ציפוי העתק כמו בשלב 3.3. פעולה זו מונעת על-חיסון שגורם לצמיחת פריצת דרך ותוצאות חיוביות כוזבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישרקו על מספר לוחית אחד עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה החדשה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים ממספר לוחית אחת לכיכר הקטיפה. הסר את מספר לוחית אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הקו שצויר על מספר לוחית שתיים עם הקו על המהדק ולמקם אותו על גבי כיכר הקטיפה. להפעיל לחץ עדין להעביר את החיידקים מכיכר הקטיפה למספר צלחת שתי. הסר את מספר לוחית שתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.8 למספר לוחית שלוש. הצלחת השלישית היא שליטה להעברה מלאה מהצלחת הראשית לשתי צלחות האחרות. מחק את כיכר הקטיפה לתוך כוס של מים. כדי לעשות שימוש חוזר ריבועי הקטיפה, חיטוי הכוס המכילה ריבועי קטיפה המזוהמים, לשטוף אותם, לייבש אותם, לעטוף אותם בנייר אלומיניום ומחדש חיטוי אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות על 30 מעלות CO / N. מושבות הגדלים על שני הצלחות אגר LB-קאן, אבל לא מצליחים לגדול על צלחות M-9-קאן נחשבות auxotrophs ( <stרונג&gt; איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> auxotrophs פס החוצה ממספר לוחית אחת על צלחת אגר LB-קאן טרי, ודגירה את הצלחת על 30 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס החוצה לבידוד 3 מושבות מצלחת הפס בשלב 3.11 על צלחת LB-קאן טרי. דגירה את הצלחת על 30 מעלות CO / N. הדבר מבטיח כי המוטציה היא מבודדת היטב. מחלקים את הצלחת לשלישים ופס את כל מושבה בסעיף אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות ספוט מהמושבות הנמוגות נגזרות מצעד 3.12 על צלחת LB-קאן טרי כדי ליצור רשת כמו בצעדים 2.1-2.4. כל מוטציה היא להיות מחדש נבדקה בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את צלחת שוב כמו בצעדים 3.1-3.10 כדי לאשר את הפנוטיפ auxotroph. </li></ol> 4. ג&#39;ין הצלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 3 O מיליליטר / תרבות N של מושבה מוטציה מבודדת מצעד 3.13 במדיום LB-קאן נוזלי על 30 מעלות צלזיוס. לטהר DNA הגנומי של 1 מיליליטר של התרבות באמצעות ערכת טיהור הדנ&quot;א הגנומי זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תערובת של 0.025 Uendonuclease Bfu CI הגבלה ו -14 μl של 1 מיקרוגרם / הדנ&quot;א הגנומי μl בתגובת 20 μl על קרח. מאז Bfu CI חותך את transposon בעשרה אתרים שונים, זה יכול להיות יעיל יותר להשתמש endonuclease הגבלה, BFA אני או Hae III, אשר חותך את transposon בשניים ושלושה אתרים שונים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות ולאחר מכן ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להשבית את האנזים. ניתוח 3 μl של ה- DNA המעוכל חלקית על ג&#39;ל 0.8% agarose (איור 3). תוצאות מוצלחות חלקיות עיכול במריחה מ 10 kb עד לתחתית של הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור 15 μl של הדנ&quot;א הגנומי מעוכל חלקית באמצעות 800 יחידות של האנזים T4 DNA בתגובת μl 500. דגירה C ° O תגובה / N ב 4. גדול נפח התגובה מגדיל את קשירה של שברים יחידים לעצמם וממזער את יחסי גומלין בין שניים או יותר שברי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precipitate DNA ligated על ידי הוספת 50 μl של 3 אצטט M נתרן, pH 5.5, ו 1 מיליליטר של 95% אתנול ו דוגרים אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microfuge DNA על 4 מעלות צלזיוס ו13,500 XG במשך 10 דקות, לשטוף את הכדור עם 70% אתנול, לייבש אותו ברכז ואקום צנטריפוגלי, וresuspend אותו 10 μl מים nuclease חינם. לחלופין, ה- DNA יכול להיות אוויר יבש ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 4 μl של ה- DNA resuspended להפוך E. PIR coli ECD100D מתח או pir116 ECD100D ידי electroporation כאמור בסעיף 1. המקור שכפול γ R6k דורש זן חיידקים עם גן PIR לשכפל 6. תוצאות מתח PIR בפלסמידים עותק נמוכים, ומתח pir116 מכיל את גן שעבר מוטציה PIR כי תוצאות בפלסמידים עותק גבוהים. כל transformant מכיל פלסמיד חדש עם transposon ואזור של כרומוזום שהופסק (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Inoculאכלתי 5 מיליליטר של מדיום LB-קאן עם מושבה אחת, לגדל אותו O / N עם רועד ב120 סל&quot;ד ו -37 מעלות צלזיוס, ולטהר את פלסמיד דנ&quot;א מכל O / התרבות N באמצעות ערכה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל 14 μl של פלסמיד באמצעות I. Xho endonuclease ההגבלה ודא הנפח הסופי של התגובה הוא 20 μl. אנזים זה מזהה אתר באמצע transposon בסוף &#39;5 של גן התנגדות kanamycin. לנתח 10 μl של מעוכל ומתעכל פלסמיד על 0.8% agarose ג&#39;ל (איור 3). פלסמיד מורכב מה- DNA מארח transposon kb 2 בתוספת האיגוף. </li></ol> רצף 5. DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף פלסמיד באמצעות מערכת ניתוח רצפי נימי ערכה זמינה מסחרי רצף, פריימרים שהומולוגיים לכל קצה של transposon, ו. לחלופין, פלסמיד ניתן לשלוח למוסד מחוץ לרצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש בתקן המשקל המולקולרי (סולם kb 1) בג&#39;ל להעריך את גודלו של פלסמיד. ואז, להעריך את מספר ננוגרם (ng) של פלסמיד הנדרש ל-50 fmol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של פלסמיד דנ&quot;א באמצעות ספקטרופוטומטר באורכי גל של 260 ננומטר (260) ו- 280 ננומטר (280). להבטיח את אורך נתיב האור דרך קובט הוא 1 סנטימטר. קבע את הריכוז על ידי הכפלת הספיגה ב 260 ננומטר ב -50 ng / μl. פלסמיד דנ&quot;א באיכות גבוהה יהיה 260 / יחס 280 בין 1.8 ו -2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנפח של ה- DNA הנדרש לכל תגובת סידור הוא מספר NG נדרש ל-50 fmol מחולק בריכוז של פלסמיד. מערבבים את הנפח של פלסמיד הנדרש במים כדי להביא את הנפח הכולל של עד 10 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את תערובת פלסמיד דנ&quot;א / מים על 96 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ולאחר מכן לקרר אותו לRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 μl של תערובת הורים מערכת הרצף ו -2 μl של 1.6 מיקרומטר של אחד מצבעי יסוד הרצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Folנמוך הפרוטוקול מערכת הרצף לתכנית Cycler תרמית וניקוי תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל דגימה באמצעות מערכת ניתוח ה- DNA נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחבילת תוכנה זמינה מסחרי כדי להציג את רצף ה- DNA. חפש את הרצף, &quot;5&#39;-GAGACAG-3&quot;, &quot;שהוא 7 נ&quot;ב האחרון של transposon (איור 4). הרצף לפני סוף &#39;5 של קטע 7 נ&quot;ב זה שייך לtransposon. הרצף אחרי סוף &#39;3 של קטע 7 נ&quot;ב זה שייך לגן שהופסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הפונקציה האפשרית של הגן שהופסק שימוש המקומי יישור חיפוש הכלי בסיסי (פיצוץ) 7,8. השתמש הבא link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . הדבק את הרצף של הפסיקהגן ed לתוך תיבת השאילתה, בחר באפשרות &quot;אחר&quot; תחת מסד הנתונים ולחץ על &quot;פיצוץ&quot; בחלק התחתון של הדף. כאשר התוצאה מופיעה, לגלול את הדף למטה כדי להציג את תוצאות היישור (איור 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial physiology and metabolism. , (2008).</li><li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics.">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li><li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes.">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).</li><li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes.">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation.">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K&#947;+origin+plasmids+at+different+copy+numbers.">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K&#947; origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li><li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Sch&#228;ffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches.">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).</li><li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li><li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains:+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02.">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li><li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes.">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li><li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).</li><li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis:+chorismic+acid.">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li><li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes.">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li><li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes.">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li><li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology.">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li><li>Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+with+the+microbial+production+of+butanol.">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., &amp; biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li></ol>

המחבר יש מה למסור.

mutagenesis transposon באמצעות transposome הוא כלי יעיל ליצירת auxotrophs בsp Enterobacter. חיידקים חיוביים YSU וסוגים אחרים של שלילי גרם וגרם 3,4. התהליך נעשה ביוזמת החדרת Tn 5 transposome -derived למארח על ידי electroporation. לזהות מושבות עם מוסיף, מתח יעד untransformed היה צריך להיות רגיש לkanamycin כדי לבחו?...

חיידקי Prototrophic לגדול בM-9 מלחים מינימאליים בינוני המכילים גלוקוז (M-9 בינוניים), המרת גלוקוז דרך מסלולי חילוף חומרים פחמן מרכזיים לייצר מבשרים, כגון חומצות אמינו, חומצות גרעין וויטמינים, לביוסינתזה 1. M-9 בינוניים מכיל אמוניום כלוריד כמקור חנקן, נתרן ופוספט אשלגן כחיץ ומקור זרחן, מגנזיום סולפט כמקור גופרית וגלוקוז כמקור פחמן ואנרגיה. לוריא-Bertani הבינוני (LB) הוא עשיר בחומצות אמינו מtryptone ובויטמינים וגורמי גדילה מתמצית שמרים. הוא תומך בצמיחה של auxotrophs שלא יכול לסנתז חומצות אמינו, ויטמינים וגורמי גדילה אחרים הנדרשים לצמיחה על M-9 בינוניים. כך, prototrophs יגדל בLB ו- M-9 בינוני, ואילו auxotrophs יגדל במדיום LB אבל לא בM-9 בינוניים. על ידי החדרת מוטציות לאוכלוסיית prototrophic של חיידקים וזיהוי גנים שעברו מוטציה שגורמים לפנוטיפים auxotrophic, זה פוssible להשיג הבנה טובה יותר של חילוף החומרים בזן חיידקים. mutagenesis transposon יכול לשמש כדי לזהות רב של גנים הדרושים להתפתחות ברמת הסוכר בM-9 בינוניים. Transposons להכניס את עצמם באופן אקראי לגנום המארח 2. על ידי תצפית transformants transposon על צלחות אגר LB והעתק ציפוים על גבי צלחות אגר M-9 בינוניים, ניתן להקרין לauxotrophs. גנים נקטעו מזוהים דרך הצלת גן. מחקר זה משתמש Tn זמין מסחרי 5 -derived transposome שנשלח כפתרון של קטע DNA transposon יניארי מעורבב עם חלבון transposase. קטע DNA חסר גן transposase אבל מכיל את גן לעמידות kanamycin, המוצא שכפול γ R6K ושני מוטיבים פסיפס שהם רצפי DNA לtransposase מחייבים בכל קצה של הקטע 3,4. מאחר וחלבון transposase מתווסף ישירות ל- DNA, מגזר ה- DNA לבדמוגדר כtransposon, ומורכב חלבון ה- DNA / transposase מוגדר כtransposome. Transposome עובר טרנספורמציה על ידי electroporation 5 למארח רגיש kanamycin (איור 1 א). יש מושבות הגדלים על צלחות אגר LB המכילות kanamycin (LB-קאן) מוסיף transposon (איור 1), וtransformants העתק מצופה שלא מצליח לגדול על M-9 צלחות אגר המכילות בינוני kanamycin (M-9-קאן) הם auxotrophs (Figire 1 ג &#39;). הדנ&quot;א הגנומי של מוטציה הוא מטוהר ומעוכל חלקית עם endonuclease הגבלת חיתוך 4-הבסיס, Bfu CI (1D איור). DNA ligated הופך לזן של Escherichia coli (E. coli) המכיל את גן PIR (איור 1E). גן זה מאפשר לפלסמיד החדש המכיל את transposon ואיגוף אזור כרומוזומליות מארח לשכפל בE. coli 6. גן התנגדות kanamycin משמש כסמן electable לפלסמיד החדש. לבסוף, רצף באמצעות פריימרים משלימים לכל קצה של transposon והיסוד מקומי יישור חיפוש כלי הניתוח (פיצוץ) 7,8 של הרצף וכתוצאה מכך נמצא בשימוש כדי לקבוע את זהותו של גנים נקטעו. אסטרטגית mutagenesis transposome זה מספקת שלושה יתרונות 3. ראשית, מאז חלבון transposase קשור ישירות לtransposon, הכנסה אינה תלויה בביטוי של גן transposase בתוך הפונדקאי. ברגע שtransposon משלב את עצם לתוך הגנום המארח, transposase נפגע, מניעת תנועה נוספת של transposon. עם זאת, לא ניתן למנוע תנועה נוספת אם המארח בעל אלמנט transpositional אנדוגני Tn 5. שנית, כניסתה של transposome ידי electroporation מאפשרת להשתמש בו במגוון רחב של מארחים. זה גם מבטל את הצורך להציג את transposon ידי קוניוגציה או על ידי viזיהום RAL. שני התהליכים דורשים רגישות מארח. שלישית, הכללה של גן התנגדות kanamycin והמוצא שכפול γ R6K בtransposome עושה את זה קל יותר לזהות את הגן שהופסק. ניתן לאחסן אזורי transposon-מופרע ורצף כפלסמידים, ומבטל את הצורך להשתמש בתגובת השרשרת של פולימראז ההפוך טכניקה (PCR) לזיהוי גן. הפרוטוקול שהוצג בסרטון הזה מתאר כל שלב לmutagenesis transposon של sp Enterobacter. 9 YSU באמצעות transposome מהחדרתו לתאי החיידקים לזיהוי של הגן המשוער שזה ייפסק. בנוסף לפרוטוקולים שפורסמו בעבר 3,4,10, שיטות מפורטות לשימוש בציפוי העתק למסך auxotrophs מוצגות. טכניקת mutagenesis זה יכול לשמש לחקר פנוטיפים אחרים, כגון התנגדויות אנטיביוטיות ומתכת, בסוגים שונים של חיידקים, לזיהויifying המספר המינימלי של גנים הדרושים להתפתחות בתנאי תרבות הוגדרו במחקרים בביולוגיה סינטטיים, או להוראת מרכיב מעבדה של גנטיקה או קורס פיזיולוגיה של חיידקים.

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K&amp;gamma;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>ECP09500</td><td>Capable of replicating plasmids with an R6K&amp;gamma; replication origin at a low copy number</td></tr><tr><td>EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>EC6P095H</td><td>Capable of replicating plasmids with an R6K&amp;gamma; replication origin at a high copy number</td></tr><tr><td>5X M-9 Salts</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>When required, media contained 50 &amp;mu;g/ml kanamycin sulfate</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohydrate</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td><td></td><td></td><td>0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 20 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 20 mM Glucose</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>Partial digestion of genomic DNA</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>Plasmid digestion</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>DNA sequencing</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Plasmid purification</td></tr><tr><td>Replica Plating Block</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Velveteen Squares</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>Replica plating</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Diversified Biotech</td><td>PSTK-1100</td><td>Grid for replica plating</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes &amp;ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>Drying DNA</td></tr><tr><td>CEQ 2000XL DNA Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA sequencing</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>DNA sequence analysis</td></tr></tbody></table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

חיידקי Prototrophic גדלים על M-9 מלחים מינימאליים בינוני בתוספת גלוקוז (בינוני M-9), המשמש כמקור פחמן ואנרגיה. יכול להיות שנוצר Auxotrophs באמצעות transposome. Tn 5 transposome זמין מסחרי, -derived שימוש בפרוטוקול זה מורכב ממקטע ליניארי של ה- DNA המכיל מקור R6K שכפול γ, גן לעמידות kanamycin ושני ברצף הפסיפס מסתיים, המשמש כאתרי transposase מחייבים. Transposome, סיפק כמתחם חלבון ה- DNA / transposase, מוצג על ידי electroporation למתח prototrophic, sp Enterobacter. YSU, ובאופן אקראי משלב את עצם לתוך הגנום של מארח זה. Transformants היא העתק מצופה על לוריא-Bertani צלחות אגר המכילות kanamycin, (LB-קאן) ועל גבי צלחות אגר M-9 מדיום המכילות kanamycin (M-9-קאן). Transformants הגדלים על צלחות LB-קאן, אבל לא על צלחות M-9-קאן נחשב auxotrophs. הגנומי מטוהרDNA מauxotroph מתעכל באופן חלקי, ligated והפך לPIR + Escherichia, מתח (E. coli). מקור שכפול R6Kγ מאפשר פלסמיד לשכפל בPIR + E. coli זנים, וסמן התנגדות kanamycin מאפשרים בחירת פלסמיד. כל transformant בעל פלסמיד חדש המכיל את transposon מוקף אזור כרומוזומליות שהופסק. סנגר רצף והמקומי יישור חיפוש הכלי בסיסי (פיצוץ) מציעים זהות משוערת של הגן שהופסק. ישנם שלושה יתרונות לשימוש באסטרטגית mutagenesis transposome זה. ראשית, הוא אינו מסתמך על הביטוי של גן transposase על ידי המארח. שנית, transposome מוחדר מארח היעד על ידי electroporation, ולא על ידי נטיה או על ידי התמרה ולכן הוא יעיל יותר. שלישית, מקור שכפול R6Kγ עושה את זה קל לזהות g המוטציהENE שהוא התאושש באופן חלקי בפלסמיד רקומביננטי. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הגנים מעורבים במאפיינים אחרים של sp Enterobacter. YSU או של מגוון רחב יותר של זני חיידקים.

הפיכתו של sp Enterobacter. YSU ידי electroporation עם transposome יזם הכנסת הגנום אקראית לתוך הגנום המארח (איור 1 א, ב &#39;). Electroporation מוצלח הניב כמה אלף transformants שגדלה על צלחות LB-קאן. כדי להשיג 300-400, היטב במרווחי מושבות בכל צלחת, הסכום של התפשטות תערובת הטרנספורמציה על כל צלחת אגר LB...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis at JoVE.com

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K Views.  Youngstown State University.  sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף. 

Video: Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic characteristics, this unconventional yeast is not only a good model for the study of the fundamental nature of fungal differentiation but is also a promising microbial platform for biochemical production and various biotechnological applications, which require extensive genetic manipulations. However, genetic manipulations of Y. lipolytica have been limited due to the lack of an efficient and stable genetic transformation system as well as very high rates of non-homologous recombination that can be mainly attributed to the KU70 gene. Here, we report an easy and rapid protocol for the efficient genetic transformation and for gene deletion in Y. lipolytica Po1g. First, a protocol for the efficient transformation of exogenous DNA into Y. lipolytica Po1g was established. Second, to achieve the enhanced double-crossover homologous recombination rate for further deletion of target genes, the KU70 gene was deleted by transforming a disruption cassette carrying 1 kb homology arms. Third, to demonstrate the enhanced gene deletion efficiency after deletion of the KU70 gene, we individually deleted 11 target genes encoding alcohol dehydrogenase and alcohol oxidase using the same procedures on the KU70 knockout platform strain. It was observed that the rate of precise homologous recombination increased substantially from less than 0.5% for deletion of the KU70 gene in Po1g to 33%-71% for the single gene deletion of the 11 target genes in Po1g KU70&#916;. A replicative plasmid carrying the hygromycin B resistance marker and the Cre/LoxP system was constructed, and the selection marker gene in the yeast knockout strains was eventually removed by expression of Cre recombinase to facilitate multiple rounds of targeted genetic manipulations. The resulting single-gene deletion mutants have potential applications in biofuel and biochemical production.

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Genetics

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Immunology and Infection

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Bioengineering

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

דור של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video