O autor gostaria de agradecer a todos da minha graduação Pesquisa Independente Estudantes e todos os meus alunos de pós-graduação em Fisiologia Microbiana que testaram as minhas ideias mutagênese transposon durante os semestres 2010-2014 primavera. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Youngstown.

1. Eletroporação de células competentes 5,11 <ol><li> Dilui-se uma S / N cultura LB de Enterobacter sp. YSU 1/20 em 50 ml de meio LB fresco e crescer com agitação a 120 rpm e 30 ° C para uma DO (600 nm) entre 0,4 e 0,6. Opcionalmente, crescer outras estirpes de bactérias na sua temperatura de crescimento ideal. </li><li> Relaxar as células em gelo durante 5 min e centrifuga-se a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante, ressuspender as células em 50 ml de água gelada estéril e centrifugar a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min. Repita este passo. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em um volume de água gelada igual ao volume de sedimento celular. Para armazenamento a longo prazo, lavar as células com 10 ml de gelado a 10% (v / v) de glicerol, ressuspender o sedimento em um volume igual de gelado a 10% (v / v) de glicerol, armazenar a -80 ° C, e descongelar em gelo antes da electroporação. </li><li> Adicionar 0,5 mL da transposome a 40 ul decélulas. A solução transposome disponível comercialmente é fornecido a uma concentração de ADN de 0,33 ug / ul. Embora seja recomendado 0,33 g, 0,165 ug de DNA é suficiente. </li><li> Coloque a mistura de células / transposome numa gelada, 0,2 mm, de cuvete de electroporação e toque na mistura para o fundo da cubeta. Chocar as células a 25 mF, 200 Ω, e 2,5 kV. Para garantir que as células permanecem refrigerados, armazenar as tinas de eletroporação em um freezer -20 ° C antes do uso. </li><li> Imediatamente, adicione 960 mL de caldo de super filtro esterilizados ideal com catabólito repressão (SOC) médio. Misture por pipetagem cima e para baixo e transferir as células para um estéril de 1,5 ml tubo de microcentrífuga. NOTA: As células começam a morrer após o choque, mas o sal no meio SOC lhes permite recuperar. Para economizar, não é necessário adicionar transposome ou para chocar as células de controlo negativo. Basta adicionar 960 ul de meio SOC estéril a ele. </li><li> Incubar as células a 30 ° C fou 45-60 min com agitação a 120 rpm. Isso proporciona um tempo para o transposome para recombinar-se com o genoma do hospedeiro e para as células para expressar resistência à canamicina. </li><li> Espalhe 100 ul de células numa placa de agar LB-kan e incubar a placa de O / N a 30 ° C. Armazenar a mistura de transformação remanescente no frigorífico a 4 ° C. Espalhe valores adicionais em uma data mais tarde para duas semanas após a eletroporação inicial, se necessário. </li></ol> 2. Gridding de transformantes <ol><li> Fita de uma grade para a tampa de um vazio de 100 x 15 mm placa de petri. Copie uma grade de &quot;Um Curso de curta duração em Genética bacteriana&quot; 12. </li><li> Desenhar uma linha na parte inferior de uma placa de agar LB-kan. Usar um pequeno pedaço de fita adesiva para o ancorar a tampa em grade de modo que a grade é visível através do ágar. Certifique-se de que a linha na parte inferior da placa está alinhada com o topo, centro da grade. Ancorando a placa com fita impede de correr, permitindo até mesmo gridding. A linha facilita a identificação colônia após réplica de placas. </li><li> Escolha um único transformante com um palito estéril e detectá-lo no centro de uma praça no grid. Basta tocar a colônia eo local. Não cavar o palito no agar. Para evitar a contaminação da chapa, lidar com o palito apenas em uma extremidade. </li><li> Manchar outro transformante em um quadrado adjacente como no passo 2.3. Quando o prato está cheio, ele incubar O / N a 30 ° C. Esta é a placa mestre. </li></ol> 3. réplica de placas para determinar a auxotrofo Fenótipo 12 <ol><li> Para cada placa que foi reticulada, fazer uma pilha de três placas de agar fresco numeradas de um a três: um para LB-kan, dois para M-9-kan e três para LB-kan. Secar as placas de cabeça para baixo, S / N, a 37 ° C antes da utilização. </li><li> Desenhar uma linha no topo de cada placa como no passo 2.2. </li><li> Limpe a ferramenta réplica de placas com 70% de etanol, coloque um quadrado de veludo estéril em cima do forro réplica paraol e apertar o quadrado de veludo para baixo. As mãos estão cheias de micróbios mesmo depois de lavá-las. Evitar a introdução de contaminantes micróbios pela manipulação da praça de veludo pelas bordas. </li><li> Alinhar a linha na placa principal com uma linha traçada sobre o grampo e colocar a placa na parte superior do quadrado veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa até a praça de veludo. Tenha cuidado para não manchar as bactérias. Remova a placa mestre da praça de veludo. </li><li> Alinhe a linha desenhada na placa o número um com a linha no suporte e coloque-o em cima da praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias a partir da praça de veludo para a chapa. Retire a placa de número um. </li><li> Descarte a praça de veludo para um copo de água e coloque um pano limpo, quadrado veludo estéril na ferramenta réplica de placas como no passo 3.3. Este passo evita o excesso de inoculação, que provoca o crescimento avanço e resultados falsos positivos. </li><li> Alinhe alinha na placa o número um com a linha do grampo e coloque-o em cima da nova praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa número um para a praça de veludo. Retire a placa de número um. </li><li> Alinhe a linha desenhada na placa de número dois com a linha no suporte e coloque-o em cima da praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias a partir da praça de veludo para placa de número dois. Retire a placa de número dois. </li><li> Repita o passo 3.8 para três número da placa. A terceira placa é um controlo para a transferência completa da placa mestra para as outras duas placas. Descarte a praça de veludo para um copo de água. Para reutilizar as praças de veludo, autoclave o copo contendo os quadrados de veludo contaminados, lave-as, seque-as, enrole-os em papel alumínio e re-autoclave-los. </li><li> Incubar as placas a 30 ° CO / N. As colónias que crescem em ambas as placas de agar LB-kan mas não conseguem crescer em placas de M-9-kan são considerados (auxotrofos <stRong&gt; Figura 2). </li><li> Streak fora auxotrofos de placa número um em um prato fresco agar LB-kan, e incubar a placa a 30 ° CO / N. </li><li> Streak fora para isolamento três colônias da placa raia na etapa 3.11 em uma placa LB-kan fresco. Incubar a placa a 30 ° CO / N. Isto assegura que o mutante é bem isolado. Divida o prato em três partes e raia a cada colônia em uma seção. </li><li> Colônias spot das colônias estrias derivados de passo 3,12 em uma placa de LB-kan fresco para formar uma grade como nos passos 2,1-2,4. Cada mutante está sendo re-testadas em triplicata. </li><li> Replicar placa novamente como nos passos 3,1-3,10 para confirmar o fenótipo auxotrofo. </li></ol> 4. Gene Resgate <ol><li> Cresça um 3 ml O / N a cultura de um mutante isolado de colónias a partir do passo 3.13 em meio LB-kan líquido a 30 ° C. Purifica-se o ADN genómico a partir de 1 ml de cultura utilizando um kit de purificação de ADN genómico disponíveis comercialmente. </li><li> Configurar uma mistura de 0,025 LBFU CI endonuclease de restrição e 14 uL de 1 ug de ADN genómico ul / em uma reacção de 20 ul em gelo. Desde BFU CI corta o transposão em doze locais diferentes, pode ser mais eficiente a utilização de endonuclease de restrição, Bfa I ou Hae III, que corta o transposão em dois e três locais diferentes, respectivamente. </li><li> Incubar a reacção a 37 ° C durante 25 minutos e depois a 80 ° C durante 20 minutos para inactivar a enzima. Analise 3 ul de DNA parcialmente digerido num gel de agarose a 0,8% (Figura 3). Uma bem-sucedida de digestão resultados parciais em um esfregaço de acima de 10 kb para a parte inferior do gel. </li><li> Ligadura de 15 ul de ADN genómico digerido parcialmente usando 800 unidades de DNA ligase de T4 numa reacção de 500 ul. Incubar a reacção de O / N a 4 ° C. O grande volume de reacção maximiza a ligação de fragmentos individuais para si e minimiza as interacções entre dois ou mais fragmentos de ADN. </li><li> Precipitate o DNA ligado por adição de 50 ul de acetato de sódio 3M, pH 5,5, e 1 ml de etanol a 95% e incubando-se a -20 ° C durante 20 min. </li><li> Microcentrífuga o DNA a 4 ° C e 13.500 xg durante 10 min, lavar o sedimento com etanol a 70%, secá-lo num concentrador centrífugo de vácuo, e ressuspender-lo em 10 ul de água livre de nuclease. Alternativamente, o ADN pode ser seca ao ar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Use 4 ul de DNA para transformar E. ressuspensas coli pir ECD100D tensão ou ECD100D pir116 por eletroporação como na seção 1. A origem de replicação γ R6K requer uma estirpe bacteriana com um gene pir replicar 6. Os resultados da estirpe pir em baixas plasmídeos de cópia, e a estirpe pir116 contém um gene mutante pir que resulta em plasmídeos de elevado número de cópias. Cada transformante contém um novo plasmídeo com o transposão e uma região do cromossoma interrompido (Figura 1E). </li><li> InoculComeram 5 ml de meio LB-kan com uma única colónia, que crescem O / N com agitação a 120 rpm e 37 ° C, e purifica-se DNA de plasmídeo a partir de toda a cultura D / N usando um kit comercial. </li><li> Digerir 14 ul do plasmídeo usando a endonuclease de restrição Xho I. Certifique-se o volume final da reacção é de 20 uL. Este enzima reconhece um local no meio do transposão na extremidade 5 &#39;do gene de resistência à canamicina. Analise 10 ul do plasmídeo não digerido e digerido num gel de agarose a 0,8% (Figura 3). O plasmídeo consiste no DNA do hospedeiro transposão 2 kb de flanqueamento mais. </li></ol> Sequenciamento 5. DNA <ol><li> Sequenciar o plasmídeo utilizando um kit disponível comercialmente sequenciação, os iniciadores que são homólogas a cada uma das extremidades do transposão, e um sistema de análise de sequenciação capilar. Alternativamente, o plasmídeo pode ser enviado para uma instituição fora para o seqüenciamento. </li><li> Use o padrão de peso molecular (escada 1 kb) emo gel para estimar o tamanho do plasmídeo. Em seguida, estimar o número de nanogramas (ng) de plasmídeo que é exigido por 50 fmol. </li><li> Medir a concentração do ADN do plasmídeo utilizando um espectrofotómetro a comprimentos de onda de 260 nm (A 260) e 280 nm (A280). Assegurar o comprimento do percurso da luz através da cuvete é de 1 cm. Determinar a concentração multiplicando-se a absorvância a 260 nm por 50 ng / ul. DNA de plasmídeo alta qualidade terá um A 260 / A 280 rácio entre 1,8 e 2,0. </li><li> O volume de ADN necessário para cada reacção de sequenciação é o número de ng necessária para 50 fmol dividida pela concentração do plasmídeo. Misturar o volume do plasmídeo requerido com água para levar o volume total até 10 ml. </li><li> Aquece-se a mistura de ADN de plasmídeo / água a 96 ° C durante 1 min e em seguida arrefecer-lo para a TA. </li><li> Adicionar 8 ul de mistura principal a partir do kit de sequenciação e 2 ul de 1,6 uM de um dos iniciadores de sequenciação. </li><li> Folbaixo o protocolo do kit de sequenciamento para o programa do termociclador e limpeza reação. </li><li> Analise cada amostra, utilizando um sistema de análise de DNA capilar. </li><li> Use um pacote de software disponível no mercado para ver a seqüência de DNA. Busca para a sequência &quot;, 5&#39;-GAGACAG-3 &#39;&quot;, que é o último 7 pb do transposão (Figura 4). A sequência antes da extremidade 5 &#39;deste segmento de 7 pb pertence ao transposão. A sequência após a extremidade 3 &#39;deste segmento de 7 pb pertence ao gene interrompido. </li><li> Determinar a possível função do gene interrompido usando o Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Use o seguinte link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Cole a sequência da interrupçãogene ed na caixa de consulta, selecione &quot;outros&quot; sob o banco de dados e clique em &quot;BLAST&quot; na parte inferior da página. Quando o resultado aparece, role a página para ver os resultados do alinhamento (Figura 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial physiology and metabolism. , (2008).</li><li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics.">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li><li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes.">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).</li><li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes.">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation.">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K&#947;+origin+plasmids+at+different+copy+numbers.">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K&#947; origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li><li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Sch&#228;ffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches.">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).</li><li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li><li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains:+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02.">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li><li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes.">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li><li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).</li><li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis:+chorismic+acid.">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li><li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes.">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li><li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes.">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li><li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology.">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li><li>Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+with+the+microbial+production+of+butanol.">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., &amp; biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li></ol>

O autor não tem nada a divulgar.

Mutagênese Transposon usando um transposome é uma ferramenta eficiente para a geração de auxotrofos em Enterobacter sp. YSU e outros tipos de bactérias Gram negativas e Gram positivas 3,4. O processo foi iniciado pela introdução do Tn 5 transposome -derived no hospedeiro por electroporação. Para identificar as colónias com inserções, a estirpe não transformada alvo teve de ser sensíveis à canamicina, de modo a seleccionar para o marcador de resistência transportado pelo trans...

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo contendo glucose (meio M-9), a conversão de glicose através centrais vias de metabolismo de carbono para gerar precursores, tais como aminoácidos, ácidos nucleicos e vitaminas, para a biossíntese 1. M-9 meio contém cloreto de amónio como uma fonte de azoto, de sódio e fosfato de potássio como tampão e fonte de fósforo, sulfato de magnésio como fonte de enxofre e de glucose como fonte de carbono e energia. Luria-Bertani (LB) é rica em aminoácidos a partir de triptona e em vitaminas e factores de crescimento a partir de extracto de levedura. Ele suporta o crescimento de auxotrofos que não podem sintetizar aminoácidos, vitaminas e outros factores de crescimento necessários para o crescimento em meio M-9. Assim, prototrofos vai crescer em LB e meio M-9, ao passo que os auxotrofos vai crescer em meio LB, mas não em meio M-9. Com a introdução de mutações em uma população de bactérias e prototrófica identificação de genes mutantes que causam fenótipos auxotróficas, é possible para se obter uma melhor compreensão do metabolismo de uma estirpe bacteriana. Mutagénese de transposões pode ser utilizado para identificar muitos dos genes necessários para o crescimento em glicose em meio M-9. Os transposões inserir-se aleatoriamente no genoma do hospedeiro 2. Ao detectar transformantes transposões em placas de agar LB e plaqueamento de réplicas em placas de agar de meio M-9, é possível para o rastreio de auxotrofos. Genes interrompidos são identificados por meio de resgate gene. Este estudo utiliza um Tn comercialmente disponível 5 -derived transposome que é fornecido como uma solução de um segmento de DNA transposon linear misturado com proteína transposase. O segmento de DNA não possui um gene de transposase, mas contém um gene de resistência a canamicina, uma origem de replicação R6K γ e dois motivos de mosaico que são sequências de ADN para a transposase de ligação em cada extremidade do segmento de 3,4. Uma vez que a proteína transposase é adicionado directamente ao ADN, o segmento de ADN sozinhoé definida como o transposão, e o complexo de proteína de ADN / transposase é definida como a transposome. O transposome é transformada por electroporação 5 num hospedeiro sensível a canamicina (Figura 1A). As colónias que crescem em placas de agar LB contendo canamicina (LB-kan) têm inserções de transposões (Figura 1B), e de réplica banhado transformantes que não conseguem crescer em M-9 placas de agar com meio contendo canamicina (M-9-kan) são auxotróficos (Figire 1C). O ADN genómico de um mutante é purificado e parcialmente digerido com a base de 4-endonuclease de restrição de corte, BFU CI (Figura 1D). O DNA ligado é transformado numa estirpe de Escherichia coli (E. coli) que contém o gene pir (Figura 1E). Este gene permite que o novo plasmídeo contendo o transposão e região flanqueadora cromossómico do hospedeiro para se replicar em E. coli 6. O gene de resistência à canamicina serve como quantoelectable marcador para o novo plasmídeo. Por último, a sequenciação utilizando iniciadores complementares a cada uma das extremidades do transposão e Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análise da sequência resultante são utilizados para determinar a identidade dos genes interrompidos. Esta estratégia de mutagênese transposome oferece três vantagens 3. Em primeiro lugar, uma vez que a proteína de transposase está ligado directamente ao transposão, a inserção não depende da expressão do gene de transposase dentro do hospedeiro. Uma vez que o transposão incorpora-se no genoma do hospedeiro, a transposase é degradada, impedindo o movimento adicional do transposão. No entanto, o movimento adicional não pode ser evitado se o host possui um Tn 5 elemento transposicional endógena. Em segundo lugar, a introdução de transposome por electroporação torna possível utilizá-lo em uma ampla variedade de hospedeiros. Também elimina a necessidade de introduzir o transposão por conjugação bacteriana ou por viinfecção ral. Ambos os processos requerem a susceptibilidade do hospedeiro. Em terceiro lugar, a inclusão do gene de resistência à canamicina e a origem de replicação R6K γ na transposome faz com que seja mais fácil para identificar o gene interrompido. Regiões de transposões-interrompido pode ser armazenado e sequenciados como plasmídeos, eliminando a necessidade de se utilizar a reacção em cadeia inversa da polimerase (PCR) para a identificação de genes. O protocolo apresentado neste vídeo descreve cada passo para transposon mutagênese de Enterobacter sp. YSU 9 usando um transposome a partir da sua introdução nas células bacterianas para a identificação do gene putativo la interrompido. Além de protocolos previamente publicados 3,4,10, métodos detalhados para usar réplica de placas para rastrear auxotrofos são apresentados. Esta técnica de mutagénese podem ser usados ​​para a investigação de outros fenótipos, tais como antibióticos e resistências de metal, em diferentes tipos de bactérias, para identifying o número mínimo de genes necessários para o crescimento sob condições de cultura definidas em estudos de biologia sintética, ou para o ensino de um componente de um laboratório de genética ou curso de fisiologia microbiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo suplementado com glucose (meio M-9), que é usado como uma fonte de carbono e energia. Auxotrofos pode ser gerado usando um transposome. A disponível comercialmente, Tn 5 transposome -derived utilizado neste protocolo consiste de um segmento linear de DNA contendo uma origem de replicação R6K γ, um gene de resistência à canamicina e dois sequência termina mosaico, que servem como sítios de ligação de transposase. O transposome, fornecida como um complexo de proteína de ADN / transposase, é introduzida por electroporação na estirpe prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora-se aleatoriamente no genoma deste hospedeiro. Os transformantes são plaqueadas em réplica Luria-Bertani placas de agar contendo canamicina (LB-kan) e em placas de agar M-9 médias contendo canamicina (M-9-kan). Os transformantes que crescem em placas de LB-kan mas não em placas de M-9-kan são considerados auxotrofos. Genómico purificadoADN a partir de um auxotrofo é parcialmente digerido, ligados e transformados em uma pir + Escherichia coli (E. coli) estirpe. A origem de replicação R6Kγ permite que o plasmídeo se replique em pir + E. estirpes de E. coli, e o marcador de resistência à canamicina para selecção permite plasmídeo. Cada transformante possui um novo plasmídeo contendo o transposão ladeada pela região cromossómica interrompida. Seqüenciamento Sanger eo Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) sugerem uma identidade putativo do gene interrompido. Existem três vantagens de se utilizar esta estratégia mutagênese transposome. Em primeiro lugar, que não se baseia na expressão de um gene de transposase pelo hospedeiro. Em segundo lugar, o transposome é introduzido no hospedeiro-alvo por electroporação, em vez de por conjugação ou por transdução e, por conseguinte, é mais eficiente. Em terceiro lugar, a origem de replicação R6Kγ faz com que seja fácil de identificar o g mutadoeno que é parcialmente recuperada num plasmídeo recombinante. Esta técnica pode ser utilizada para investigar os genes envolvidos em outras características de Enterobacter sp. YSU ou de uma variedade mais ampla de estirpes bacterianas.

Transformação de Enterobacter sp. YSU por electroporação com o genoma transposome iniciado inserção aleatória no genoma do hospedeiro (Figura 1A; B). A eletroporação sucesso rendeu vários milhares de transformantes que cresceram em placas LB-kan. Para obter 300-400, colônias por placa bem espaçados, a quantidade de transformação mistura propagação em cada placa de ágar LB-kan foi otimizado. Cada transformante continha pelo menos uma inserção transposon, mas não estava claro ...

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Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K visualizações.  Youngstown State University.  Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético. 

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Uma Introdução ao Lab Worm: de Worms Cultivar a mutagênese

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...