L&#39;auteur tient à remercier l&#39;ensemble de mon premier cycle de recherche indépendant étudiants et tous mes physiologie microbienne étudiants des cycles supérieurs qui ont testé mes idées transposon de mutagenèse pendant les semestres de printemps 2010-2014. Ce travail a été financé par le Département des sciences biologiques de l&#39;Université d&#39;État de Youngstown.

1. L&#39;électroporation de cellules compétentes 5,11 <ol><li> Diluer une culture O / N LB de Enterobacter sp. UEE 20.1 dans 50 ml de milieu LB frais et croître avec secousses à 120 tpm et 30 ° C jusqu&#39;à une DO (600 nm) entre 0,4 et 0,6. Eventuellement, d&#39;autres souches bactériennes se développer à leur température optimale de croissance. </li><li> Refroidir les cellules sur de la glace pendant 5 min et centrifugation à 4 ° C et 7000 x g pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 50 ml d&#39;eau glacée stérile et centrifugation à 4 ° C et 7000 x g pendant 5 min. Répétez cette étape. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un volume d&#39;eau glacée égal au volume du culot cellulaire. Pour le stockage à long terme, laver les cellules avec 10 ml de glace froide 10% (v / v) de glycérol, remettre en suspension dans un volume de granulés égal de glace froid 10% (v / v) de glycérol, conserver à -80 ° C, et le dégel sur la glace avant l&#39;électroporation. </li><li> Ajouter 0,5 pi de la transposome à 40 pi decellules. La solution de transposome disponible dans le commerce est fourni à une concentration d&#39;ADN de 0,33 ug / ul. Bien 0,33 mg est recommandée, 0,165 pg d&#39;ADN est suffisante. </li><li> Placer le mélange cellules / transposome dans un froid de glace, 0,2 mm, cuvette d&#39;électroporation et appuyez sur le mélange au fond de la cuvette. Choquer les cellules à 25 pF, 200 Ω, et 2,5 kV. Pour veiller à ce que les cellules restent refroidis, rangez les cuvettes d&#39;électroporation dans un congélateur à -20 ° C avant utilisation. </li><li> Immédiatement, ajouter 960 ul de filtre stérilisés super bouillon optimale avec la répression catabolique (SOC) moyen. Mélanger par pipetage de haut en bas et de transférer les cellules à 1,5 ml d&#39;un tube de microcentrifugation stérile. NOTE: Les cellules commencent à mourir après le choc, mais le sel dans le milieu SOC leur permet de récupérer. Pour économiser, il est nécessaire d&#39;ajouter transposome ou de choquer les cellules témoins négatifs. Il suffit d&#39;ajouter 960 ul de milieu SOC stérile à elle. </li><li> Incuber les cellules à 30 ° C fou de 45 à 60 min sous agitation à 120 tours par minute. Ceci permet d&#39;obtenir le temps de transposome à recombiner avec le génome de l&#39;hôte et pour les cellules à exprimer la résistance à la kanamycine. </li><li> Étaler 100 pi de cellules sur une plaque de gélose LB-kan et incuber la plaque O / N à 30 ° C. Stocker le mélange de transformation restant dans le réfrigérateur à 4 ° C. Étaler montants supplémentaires à une date ultérieure jusqu&#39;à 2 semaines après l&#39;électroporation initial si nécessaire. </li></ol> 2. Maillage des transformants <ol><li> Bande d&#39;une grille sur le couvercle d&#39;une boîte de 100 x 15 mm de Pétri vide. Copier une grille de &quot;A Short Course en bactérienne génétique&quot; 12. </li><li> Tracez une ligne sur le fond d&#39;une plaque de gélose LB-kan. Utilisez un petit morceau de ruban adhésif pour l&#39;ancrer sur le couvercle en grille pour que la grille est visible à travers l&#39;agar-agar. Assurez-vous que la ligne sur la base de la plaque soit aligné avec le haut, au centre de la grille. L&#39;ancrage de la plaque avec du ruban adhésif empêche de glisser, permettant même maillage. La ligne facilite l&#39;identification de la colonie, après des répliques. </li><li> Choisissez un seul transformant avec un cure-dent stérile et repérer dans le centre d&#39;un carré de la grille. Il suffit de toucher la colonie et l&#39;endroit. Ne pas creuser le cure-dent dans la gélose. Pour éviter de contaminer la plaque, gérer le cure-dent à une seule extrémité. </li><li> Découvrir un autre transformant dans une case adjacente comme dans l&#39;étape 2.3. Lorsque la plaque est pleine, incuber O / N à 30 ° C. Ceci est la plaque de maître. </li></ol> 3. des répliques pour déterminer le phénotype Auxotrophe 12 <ol><li> Pour chaque plaque qui ont été quadrillées, faire une pile de trois nouvelles plaques d&#39;agar numérotés de un à trois: un pour LB-kan, deux M-9-kan et trois pour LB-kan. Sécher les plaques à l&#39;envers, O / N à 37 ° C avant utilisation. </li><li> Tracez une ligne sur le dessus de chaque plaque comme dans l&#39;étape 2.2. </li><li> Essuyez l&#39;outil réplique de placage avec 70% d&#39;éthanol, placer un carré de velours stérile sur le dessus de la réplique de placageol et serrer le carré de velours vers le bas. Mains sont pleines de microbes, même après les avoir lavées. Empêcher l&#39;introduction de contamination par les microbes manipulation du carré de velours par son bord. </li><li> Alignez la ligne sur la plaque de maître avec une ligne tracée sur la fixation et placez la plaque sur le dessus du carré de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la plaque à la place de velours. Veillez à ne pas salir les bactéries. Retirer la plaque de maître de la place du velours. </li><li> Alignez la ligne tracée sur la plaque numéro un avec la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la place du velours à la plaque. Retirer la plaque numéro un. </li><li> Jeter le carré de velours dans un bécher d&#39;eau et placer un carré de velours propre, stérile sur l&#39;outil réplique de placage à l&#39;étape 3.3. Cette étape évite la sur-inoculation qui provoque la croissance de la percée et des résultats faussement positifs. </li><li> Aligner laligne sur plaque numéro un avec la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la nouvelle place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la plaque numéro un à la place de velours. Retirer la plaque numéro un. </li><li> Alignez la ligne tracée sur la plaque numéro deux, la ligne sur la pince et le placer sur le dessus de la place de velours. Appliquez une légère pression pour transférer les bactéries de la place du velours à la plaque numéro deux. Retirer la plaque numéro deux. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.8 pour plaque numéro trois. La troisième plaque est une commande pour un transfert complet de la plaque maîtresse pour les deux autres plaques. Jeter le carré de velours dans un bécher d&#39;eau. Pour réutiliser les carrés de velours, l&#39;autoclave le bécher contenant les carrés de velours contaminés, les laver, les sécher, les envelopper dans du papier aluminium et re-autoclave eux. </li><li> Incuber les plaques à 30 ° CO / N. Les colonies qui se développent sur les deux plaques de gélose LB-Kan, mais ne parviennent pas à se développer sur des plaques M-9-kan sont considérés comme étant auxotrophes ( <strong&gt; Figure 2). </li><li> Streak sur auxotrophes de plaque numéro un sur une plaque de gélose LB frais-kan, et incuber la plaque à 30 ° CO / N. </li><li> Streak à l&#39;isolement 3 colonies de la plaque de série à l&#39;étape 3.11 sur une plaque LB-kan frais. Incuber la plaque à 30 ° CO / N. Cela garantit que le mutant est bien isolé. Divisez la plaque en tiers et série sur chaque colonie dans une section. </li><li> Coin de colonies provenant des colonies striées à 3,12 dérivés de l&#39;étape sur une plaque de LB-Kan fraîche pour former une grille comme dans les étapes 2.1 à 2.4. Chaque mutant est re-testé en triple. </li><li> Reproduire à nouveau la plaque comme dans les étapes 3.1 à 3.10 pour confirmer le phénotype auxotrophe. </li></ol> 4. Gene sauvetage <ol><li> Cultiver un 3 ml O / N culture d&#39;une colonie isolée à partir de l&#39;étape mutant 3,13 en milieu liquide LB-Kan à 30 ° C. Purifier l&#39;ADN génomique à partir de 1 ml de la culture en utilisant un kit de purification d&#39;ADN génomique disponibles dans le commerce. </li><li> Mettre en place un mélange de 0,025 UBFU CI endonucléase de restriction et 14 ul de 1 ug / ul d&#39;ADN génomique dans un volume réactionnel de 20 ul sur de la glace. Depuis FBu CI coupe le transposon à douze sites différents, il peut être plus efficace d&#39;utiliser l&#39;endonucléase de restriction BFA I ou III Hae, qui coupe le transposon à deux et trois sites différents, respectivement. </li><li> Incuber la réaction à 37 ° C pendant 25 min et ensuite à 80 ° C pendant 20 min pour inactiver l&#39;enzyme. Analyser 3 pl de l&#39;ADN partiellement digéré sur un gel d&#39;agarose à 0,8% (figure 3). A réussi la digestion partielle à un test de plus de 10 ko vers le bas du gel. </li><li> Ligaturer 15 pl de l&#39;ADN génomique partiellement digéré en utilisant 800 unités d&#39;ADN ligase T4 dans une réaction de 500 ul. Incuber la réaction O / N à 4 ° C. Le grand volume de réaction maximise la ligature de fragments simple pour eux-mêmes et minimise les interactions entre deux ou plusieurs fragments d&#39;ADN. </li><li> Précipitate l&#39;ADN lié par addition de 50 ul d&#39;acétate de sodium 3 M, pH 5,5, et 1 ml d&#39;éthanol à 95% et en incubant à -20 ° C pendant 20 min. </li><li> Microfuge l&#39;ADN à 4 ° C et 13 500 g pendant 10 min, laver le culot avec 70% d&#39;éthanol, le sécher dans un concentrateur sous vide centrifuge, et remettre en suspension dans 10 pi d&#39;eau sans nucléase. En variante, l&#39;ADN peut être séché à l&#39;air à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Utilisez 4 pl d&#39;ADN remis en suspension pour transformer E. coli souche pir ou ECD100D ECD100D pir116 par électroporation de l&#39;article 1. L&#39;origine de réplication γ R6k nécessite une souche bactérienne avec un gène pir pour reproduire 6. Les résultats de la souche pir dans les plasmides de copie bas, et la souche pir116 contient un gène mutant pir qui se traduit par des plasmides élevé de copies. Chaque transformant contient un plasmide nouveau avec le transposon et d&#39;une région du chromosome d&#39;interruption (Figure 1E). </li><li> Inoculmangé 5 ml de milieu LB-Kan avec une seule colonie, cultiver O / N avec agitation à 120 rpm et 37 ° C, et on purifie l&#39;ADN de plasmide à partir de l&#39;ensemble O / N culture en utilisant un kit commercial. </li><li> Digérer 14 ul du plasmide en utilisant l&#39;endonucléase de restriction Xho I. Assurez-vous que le volume final de la réaction est de 20 pi. Cette enzyme reconnaît un site au milieu du transposon à l&#39;extrémité 5 &#39;du gène de résistance à la kanamycine. Analyse 10 ul de la non digéré et digéré le plasmide sur un gel d&#39;agarose à 0,8% (figure 3). Le plasmide est constitué de l&#39;ADN de l&#39;hôte 2 de transposon flanquant ainsi kb. </li></ol> 5. Séquençage de l&#39;ADN <ol><li> La séquence du plasmide en utilisant un kit disponible dans le commerce de séquençage, des amorces qui sont homologues à chaque extrémité du transposon et d&#39;un système d&#39;analyse de séquençage capillaire. Alternativement, le plasmide peut être expédiée à une institution extérieure pour le séquençage. </li><li> Utilisez le standard de poids moléculaire (1 kb ladder) dansle gel d&#39;estimer la taille du plasmide. Ensuite, estimer le nombre de nanogrammes (ng) de plasmide qui est nécessaire pour 50 fmol. </li><li> Mesurer la concentration de l&#39;ADN plasmidique en utilisant un spectrophotomètre à une longueur d&#39;onde de 260 nm (260 A) et 280 nm (A 280). Veiller à la longueur du trajet de la lumière à travers la cuvette est de 1 cm. Déterminer la concentration en multipliant l&#39;absorbance à 260 nm par 50 ng / pl. ADN plasmidique de qualité aura un A 260 / A 280 rapport entre 1,8 et 2,0. </li><li> Le volume de l&#39;ADN requis pour chaque réaction de séquençage est le nombre de ng de 50 fmol requis divisé par la concentration du plasmide. Mélanger le volume requis de plasmide avec de l&#39;eau pour porter le volume total à 10 ul. </li><li> Chauffer le mélange ADN de plasmide / eau à 96 ° C pendant 1 min, puis refroidir à TA. </li><li> Ajouter 8 pi de mélange maître de la trousse de séquençage et 2 pi de 1,6 M de l&#39;une des amorces de séquençage. </li><li> Folbas le protocole du kit de séquençage pour le programme du thermocycleur et la réaction de nettoyage. </li><li> Analyser chaque échantillon en utilisant un système d&#39;analyse d&#39;ADN de capillaire. </li><li> Utilisez un logiciel disponible dans le commerce pour voir la séquence d&#39;ADN. Recherche de la séquence », 5&#39;-GAGACAG-3 &#39;&quot;, qui est la 7 dernières pb de la transposon (figure 4). La séquence avant de l&#39;extrémité 5 &#39;de ce segment 7 pb appartient au transposon. La séquence après l&#39;extrémité 3 &#39;de ce segment 7 pb appartient au gène interrompu. </li><li> Déterminer la fonction possible du gène interrompu à l&#39;aide du Local Alignment Search Tool (de BLAST) 7,8 de base. Utilisez la suite link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Coller la séquence de l&#39;interruptiongène ed dans la boîte de recherche, sélectionner &quot;Autres&quot; sous la base de données et cliquez sur &quot;BLAST&quot; au bas de la page. Lorsque le résultat apparaît, faites défiler la page pour afficher les résultats de l&#39;alignement (Figure 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial physiology and metabolism. , (2008).</li><li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics.">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li><li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes.">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).</li><li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes.">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation.">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K&#947;+origin+plasmids+at+different+copy+numbers.">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K&#947; origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li><li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Sch&#228;ffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches.">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).</li><li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li><li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains:+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02.">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li><li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes.">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li><li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).</li><li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis:+chorismic+acid.">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li><li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes.">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li><li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes.">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li><li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology.">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li><li>Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+with+the+microbial+production+of+butanol.">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., &amp; biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li></ol>

L&#39;auteur n&#39;a rien à divulguer.

Mutagenèse utilisant un transposon transposome est un outil efficace pour générer auxotrophes à Enterobacter sp. Bactéries positives YSU et d&#39;autres types de bactéries Gram négatif et Gram 3,4. Le processus a été initié par l&#39;introduction de la Tn 5 transposome -derived dans l&#39;hôte par électroporation. Pour identifier les colonies avec des inserts, la souche non transformée de cible doit être sensible à la kanamycine afin de sélectionner pour le marqueur de résis...

Bactéries prototrophes poussent dans M-9 sels milieu minimal contenant du glucose (milieu M-9), la conversion du glucose à travers les voies du métabolisme central du carbone pour produire des précurseurs, tels que des acides aminés, des acides nucléiques et des vitamines, pour une biosynthèse. M-9, le milieu contient du chlorure d&#39;ammonium comme source d&#39;azote, du sodium et du phosphate de potassium comme source de phosphore et un tampon, le sulfate de magnésium en tant que source de soufre et du glucose comme source de carbone et d&#39;énergie. Luria-Bertani (LB) est riche en acides aminés de tryptone et en vitamines et facteurs de croissance à partir de l&#39;extrait de levure. Il favorise la croissance des auxotrophes qui ne peut pas synthétiser les acides aminés, les vitamines et d&#39;autres facteurs de croissance nécessaires à la croissance sur le milieu M-9. Ainsi, prototrophes va croître dans LB et M-9 moyen, alors que auxotrophes vont grandir dans un milieu LB mais pas dans M-9 moyen. En introduisant des mutations dans une population de bactéries prototrophique et l&#39;identification des gènes mutés qui causent des phénotypes auxotrophes, il est possible d&#39;obtenir une meilleure compréhension du métabolisme dans une souche bactérienne. Mutagenèse par transposon peut être utilisée pour identifier un grand nombre des gènes nécessaires à la croissance sur glucose en milieu M-9. Les transposons se insère au hasard dans le génome de l&#39;hôte 2. En détectant les transformants de transposon sur des plaques de gélose LB et réplique les étalant sur des plaques de milieu M-9 de gélose, il est possible de cribler des mutants auxotrophes. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage de gène. Cette étude utilise un Tn 5 disponible dans le commerce -derived transposome qui est expédié à partir d&#39;une solution d&#39;un segment d&#39;ADN du transposon linéaire en mélange avec de la protéine de transposase. Le segment d&#39;ADN dépourvu d&#39;un gène de transposase, mais qui contient un gène de résistance à la kanamycine, une origine de réplication de R6K et γ deux motifs en mosaïque qui sont des séquences d&#39;ADN de la transposase de liaison à chaque extrémité du segment 3,4. Étant donné que la protéine de transposase est ajouté directement à l&#39;ADN, le segment d&#39;ADN seulest défini comme le transposon, et le complexe de protéine ADN / transposase est définie comme la transposome. Le transposome est transformé par électroporation 5 dans un hôte sensible à la kanamycine (Figure 1A). Les colonies qui croissent sur ​​des plaques de gélose LB contenant de la kanamycine (LB-Kan) présentent des inserts de transposons (Figure 1b), et les répliques plaqué les transformants qui ne parviennent pas à se développer sur les M-9 des plaques d&#39;agar de milieu contenant de la kanamycine (M-9-kan) sont auxotrophes (Figire 1C). L&#39;ADN génomique à partir d&#39;un mutant est purifié et digéré partiellement par la 4-base endonucléase de restriction de coupe, de FBu CI (figure 1D). L&#39;ADN ligaturé est transformé dans une souche d&#39;Escherichia coli (E. coli) qui contient le gène pir (Figure 1E). Ce gène permet à la nouvelle plasmide contenant le transposon et d&#39;accompagnement hôte région chromosomique à se répliquer dans E. coli 6. Le gène de résistance à la kanamycine sert aussimarqueur éligible pour le nouveau plasmide. Finalement, le séquençage en utilisant des amorces complémentaires à chaque extrémité du transposon et Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse de la séquence 7,8 résultante sont utilisés pour déterminer l&#39;identité des gènes interrompus. Cette stratégie de mutagenèse transposome offre trois avantages 3. Tout d&#39;abord, étant donné que la protéine de transposase est lié directement à la transposon, l&#39;insertion ne dépend pas de l&#39;expression du gène de la transposase dans l&#39;hôte. Une fois que le transposon est incorporé dans le génome de l&#39;hôte, la transposase est dégradée, ce qui empêche un mouvement supplémentaire du transposon. Cependant, le mouvement supplémentaire ne peut être évité si l&#39;hôte possède une Tn 5 élément transpositionnel endogène. D&#39;autre part, mise en place de la transposome par électroporation, il est possible de l&#39;utiliser dans une grande variété d&#39;hôtes. Elle élimine également la nécessité d&#39;introduire le transposon par la conjugaison bactérienne ou par viinfection RAL. Les deux procédés nécessitent susceptibilité de l&#39;hôte. En troisième lieu, l&#39;insertion du gène de résistance à la kanamycine et l&#39;origine de réplication de R6K γ dans la transposome rend plus facile d&#39;identifier le gène interrompu. les régions de transposons interrompue peuvent être stockées sous forme de plasmides et séquences, ce qui élimine la nécessité d&#39;utiliser la réaction en chaîne de la polymérase inverse (PCR) pour l&#39;identification du gène. Le protocole présenté dans cette vidéo décrit chaque étape de mutagenèse par transposon de Enterobacter sp. UEE 9 en utilisant un transposome de son introduction dans les cellules bactériennes à l&#39;identification du gène putatif il interrompu. En plus des protocoles précédemment publiés 3,4,10, des méthodes détaillées pour l&#39;utilisation des répliques à l&#39;écran pour auxotrophes sont présentés. Cette technique de mutagénèse peut être utilisée pour l&#39;étude d&#39;autres phénotypes, tels que les antibiotiques et les résistances métalliques, dans différents types de bactéries, pour identification le nombre minimal de gènes nécessaires à la croissance dans des conditions de culture définies dans les études de la biologie synthétique, ou pour enseigner une composante de laboratoire de génétique ou d&#39;un cours de physiologie microbienne.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Bactéries prototrophes poussent sur M-9 minimal sels du milieu supplémenté avec du glucose (milieu M-9), qui est utilisé comme source de carbone et d&#39;énergie. Auxotrophes peuvent être générés en utilisant une transposome. La, Tn 5 transposome -derived disponible dans le commerce utilisé dans ce protocole consiste en un segment linéaire d&#39;ADN contenant une origine de réplication de R6K γ, un gène de résistance à la kanamycine et deux extrémités séquence mosaïque, qui servent de sites de liaison de la transposase. Le transposome, à condition que un complexe de protéine ADN / transposase, est introduit par électroporation dans la souche prototrophe, Enterobacter sp. UEE, et lui-même intègre de façon aléatoire dans le génome de cet hôte. Les transformants sont étalés sur réplique Luria-Bertani des plaques de gélose contenant de la kanamycine (kan-LB) et sur des plaques de gélose M-9 contenant de la kanamycine moyennes (M-9-kan). Les transformants qui se développent sur des plaques LB-Kan, mais pas sur des plaques M-9-kan sont considérés comme étant auxotrophes. Génomique purifiéL&#39;ADN d&#39;un auxotrophe est partiellement digéré, ligaturé et transformé en un pir + Escherichia coli (E. coli) souche. L&#39;origine de réplication du plasmide R6Ky permet de se répliquer dans E. pir + coli et des souches, le marqueur de résistance à la kanamycine pour la sélection permet de plasmide. Chaque transformant possède un nouveau plasmide contenant le transposon flanquée par la région chromosomique interrompue. Séquençage Sanger et le Local Alignment Search Tool base (BLAST) suggèrent une identité putatif du gène interrompu. Il ya trois avantages à utiliser cette stratégie de mutagenèse de transposome. Tout d&#39;abord, il ne repose pas sur l&#39;expression d&#39;un gène de la transposase de l&#39;hôte. En second lieu, la transposome est introduit dans l&#39;hôte cible par électroporation, plutôt que par la conjugaison ou par transduction et est donc plus efficace. Troisièmement, l&#39;origine de réplication R6Ky, il est facile d&#39;identifier le g mutéène, qui est partiellement récupéré dans un plasmide recombinant. Cette technique peut être utilisée pour étudier les gènes impliqués dans d&#39;autres caractéristiques de Enterobacter sp. UEE ou d&#39;un plus grand nombre de souches bactériennes.

Transformation de Enterobacter sp. UEE par électroporation avec le transposome initié insertion du génome aléatoire dans le génome de l&#39;hôte (Figure 1A, B). Une électroporation réussie a donné plusieurs milliers de transformants qui se sont développées sur des plaques LB-Kan. Pour obtenir 300-400, colonies par plaque bien espacées, la quantité de mélange transformation propagation sur chaque plaque de gélose LB-kan a été optimisé. Chaque transformant contenait au moins un ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis at JoVE.com

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. UEE grandit dans un milieu de sels glucose minimes. Les auxotrophes sont générées par le transformant avec un transposome qui se insère de manière aléatoire dans le génome de l&#39;hôte. Les mutants sont trouvés par des répliques de milieu complexe à un milieu minimal. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage des gènes et le séquençage.

Génération de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. UEE auxotrophes utilisant mutagénèse par transposon

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K vues.  Youngstown State University.  Enterobacter sp. UEE grandit dans un milieu de sels glucose minimes. Les auxotrophes sont générées par le transformant avec un transposome qui se insère de manière aléatoire dans le génome de l'hôte. Les mutants sont trouvés par des répliques de milieu complexe à un milieu minimal. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage des gènes et le séquençage. 

Vidéo: Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Génération de Stable elegans transgéniques C. Utilisation de microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Recherche

Biologie

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Génération d&#39;ADN / ARN hybrides d&#39;ADN génomique par la transformation en utilisant l&#39;ARN contenant Oligonucléotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Une introduction au laboratoire Worm: La culture de Worms à la mutagenèse

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocoles de sélection mutagenèse et fonctionnelles pour l&#39;évolution dirigée de protéines dans les E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Simple mutagenèse bisulfite d&#39;ovocytes

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Un protocole pour l&#39;évaluation fonctionnelle de Whole-Protein Saturation mutagenèse Bibliothèques Utilisant à haut débit de séquençage

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...