Der Autor möchte allen meinen Bachelor Independent Research Studenten und alle meine Microbial Physiology Studenten, die während der 2010-2014 Frühjahr Semester meines Transposon-Mutagenese Ideen getestet danken. Diese Arbeit wurde durch das Department of Biological Sciences an Youngstown State University finanziert.

1. Elektroporation von Competent Cells 5,11 <ol><li> Eine verdünnte O / N-Kultur von LB Enterobacter sp. Ysu 1/20 in 50 ml frischem LB-Medium und wachsen zu einer OD (600 nm) von 0,4 bis 0,6 unter Schütteln bei 120 rpm und 30 ° C. Optional wachsen andere Bakterienstämme auf ihre optimale Wachstumstemperatur. </li><li> Kühlen der Zellen auf Eis für 5 Minuten und Zentrifugation bei 4 ° C und 7.000 × g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen, Resuspendieren der Zellen in 50 ml sterilem eiskaltem Wasser und Zentrifuge bei 4 ° C und 7.000 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Überstand verwerfen und die Zellen werden in einem Volumen von eiskaltem Wasser gleich dem Zellpelletvolumen. Für die Langzeitlagerung, Waschen der Zellen mit 10 ml eiskalter 10% (v / v) Glycerin, resuspendieren in einem gleichen Pelletvolumen eiskaltem 10% (v / v) Glycerin, bei -80 ° C und Auftauen auf Eis vor der Elektroporation. </li><li> Mit 0,5 ul der transposome 40 ulZellen. Das im Handel erhältliche transposome Lösung wird bei einer DNA-Konzentration von 0,33 ug / ul geliefert. Obwohl 0,33 ug empfohlen wird, ist 0,165 &amp; mgr; g DNA ausreichend. </li><li> Legen Sie die Zelle / transposome Mischung in einer eiskalten, 0,2 mm, Elektroporationsküvette und tippen Sie die Mischung auf dem Boden der Küvetten. Schock die Zellen in 25 &amp; mgr; F, 200 Ω und 2,5 kV. Um sicherzustellen, dass die Zellen bleiben gekühlt, vor dem Gebrauch die Elektroporationsküvetten in einem -20 ° C Gefrierschrank lagern. </li><li> Unmittelbar, fügen 960 ul Filter sterilisiert SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren und übertragen Sie die Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die Zellen beginnen, nach dem Schock sterben, aber das Salz in der SOC-Medium können sie sich zu erholen. Um zu sparen, ist es nicht notwendig, transposome hinzuzufügen oder um die negativen Kontrollzellen zu schocken. Fügen Sie einfach 960 ul sterilem SOC-Medium zu. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 30 ° C foder 45-60 min mit 120 rpm schütteln. Dies bietet Zeit für die transposome mit dem Wirtsgenom und die Zellen rekombinieren Kanamycinresistenz exprimieren. </li><li> Verbreiten Sie 100 ul von Zellen auf einer LB-kan-Agar-Platte und Inkubation der Platte O / N bei 30 ° C. Bewahren Sie die restlichen Transformationsmischung im Kühlschrank bei 4 ° C. Verbreiten Sie zusätzliche Beträge zu einem späteren Zeitpunkt bis zu 2 Wochen nach der ersten Elektroporation, falls erforderlich. </li></ol> 2. Gridding von Transformanten <ol><li> Band ein Gitter auf den Deckel eines leeren 100 x 15 mm Petrischale. Kopieren Sie ein Raster von &quot;A Short Course in Bacterial Genetics&quot; 12. </li><li> Zeichnen Sie eine Linie auf dem Boden eines LB-kan-Agar-Platte. Mit einem kleinen Stück Klebeband, um es in die gerasterten Deckel zu verankern, so dass das Netz durch den Agar sichtbar ist. Sicherzustellen, daß die Linie, auf der Unterseite der Platte ist mit dem oberen, in der Mitte des Gitters ausgerichtet. Die Verankerung der Platte mit Klebeband hält sie rutscht, was eine noch Gridding. Die Linie erleichtert Kolonie Identifikation nach Replikaplattierung. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Transformante mit einem sterilen Zahnstocher und Spot es in der Mitte eines Platzes in der Startaufstellung. Berühren Sie einfach die Kolonie und die Stelle. Graben Sie nicht die Zahnstocher in den Agar. Um eine Verunreinigung der Platte zu vermeiden, behandeln den Zahnstocher nur an einem Ende. </li><li> Finde einen anderen Transformante in ein angrenzendes Feld, wie in Schritt 2.3. Wenn die Platte voll ist, bebrüten es O / N bei 30 ° C. Dies ist der Masterplatte. </li></ol> 3. Replikaplattierung die Auxotrophie Phänotyp 12 Bestimmen <ol><li> Für jede Platte, die gerasterten wurde, stellen Sie einen Stapel von drei frischen Agarplatten nummeriert eins bis drei: eine für LB-kan, zwei für M-9-kan und drei für LB-kan. Trocknen der Platten auf den Kopf, O / N bei 37 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Zeichnen Sie eine Linie auf der Oberseite jeder Platte wie in Schritt 2.2. </li><li> Wischen Sie die Replica-Plating-Tool mit 70% Ethanol, legen Sie eine sterile velveteen Quadrat auf der Oberseite des Replika-Plattierung aufol und klemmen Sie die velveteen Quadrat nach unten. Hände sind mit Mikroben wimmelt sogar nach dem Waschen sie. Verhindern, dass der Einführung von verunreinigenden Mikroben durch den Umgang mit den Samt Quadrat am Rand an. </li><li> Richten Sie die Linie auf der Masterplatte mit einer Linie auf der Klemme gezogen und legen Sie die Platte auf der Oberseite des velveteen Quadrat. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien von der Platte auf den Samt Quadrat übertragen. Achten Sie darauf, um die Bakterien zu verschmieren. Entfernen Sie die Masterplatte aus der Samt Platz. </li><li> Richten Sie die Zeile auf Platte Nummer eins gezogen mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien aus der Samt Quadrat auf die Platte übertragen. Entfernen Platte Nummer eins. </li><li> Entsorgen Sie die velveteen Quadrat in ein Becherglas mit Wasser und legen Sie eine saubere, sterile velveteen Quadrat auf der Replikaplattierung Werkzeug wie in Schritt 3.3. Dieser Schritt verhindert Überimpfung, die bahnbrechende Wachstum und falsch positiven Ergebnissen führt. </li><li> Richten Sie dieLinie auf Platte Nummer eins mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der neuen Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien von der Platte Nummer eins auf den Samt Quadrat übertragen. Entfernen Platte Nummer eins. </li><li> Richten Sie die Zeile auf Platte Nummer zwei gezogen mit der Linie auf der Klemme und setzen Sie ihn auf der Samt Platz. Drücken Sie vorsichtig, um die Bakterien aus der Samt Quadrat Platte Nummer zwei zu übertragen. Entfernen Platte Nummer zwei. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.8 für Platte Nummer drei. Die dritte Platte ist eine Steuerung für eine vollständige Übertragung von der Master-Platte zu den beiden anderen Platten. Entsorgen Sie die velveteen Quadrat in einen Becher Wasser. Um die velveteen Quadrate wiederverwenden, Autoklavieren den Becher mit dem kontaminierten velveteen Quadrate, waschen Sie sie, trocknen sie, wickeln Sie sie in Alufolie und neu autoklavieren. </li><li> Die Inkubation bei 30 ° CO / N. Kolonien, die auf beiden LB-kan-Agar-Platten wachsen, aber keine Einigung über M-9-kan Platten wachsen werden als Auxotrophen (sein <strong&gt; Abbildung 2). </li><li> Streak aus Auxotrophen von Platte Nummer eins auf eine frische LB-kan-Agar-Platte, und Inkubation der Platte bei 30 ° CO / N. </li><li> Streak für Trennung 3 Kolonien von der Ausstrichplatte in Schritt 3.11 auf eine frische LB-kan Platte. Die Platte bei 30 ° CO / N. Dies stellt sicher, dass die Mutante ist gut isoliert. Teilen Sie die Platte in Drittel und streifen aus jeder Kolonie in einem Abschnitt. </li><li> Spot-Kolonien aus den ausgestrichen Kolonien von Schritt 3.12 auf eine frische LB-kan Platte abgeleitet, um ein Gitter, wie in den Schritten 2.1-2.4 bilden. Jede Mutante ist in dreifacher Ausfertigung erneut getestet. </li><li> Replizieren Platte wieder wie in den Schritten von 3,1 bis 3,10, um den Auxotroph Phänotyp zu bestätigen. </li></ol> 4. Gene Rettungs <ol><li> Wachsen Sie ein 3 ml O / N-Kultur eines isolierten Mutante Kolonie aus Schritt 3.13 in flüssigem LB-kan-Medium bei 30 ° C. Reinige genomischer DNA aus 1 ml der Kultur unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen genomischen DNA-Reinigungskits. </li><li> Richten Sie eine Mischung aus 0.025 UBFU CI-Restriktionsendonuclease und 14 &amp; mgr; l von 1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l genomische DNA in einer 20 ul Reaktion auf Eis. Da BFU CI schneidet das Transposon an zwölf verschiedenen Stellen, kann es effizienter sein, Restriktionsendonuclease, Bfa I oder Hae III, welches das Transposon an zwei und drei verschiedenen Stellen schneidet, jeweils verwenden. </li><li> Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C für 25 min und dann bei 80 ° C für 20 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren. Analyse 3 ul des teilweise verdaute DNA auf einem 0,8% Agarosegel (Abbildung 3). Eine erfolgreiche partiellen Verdau ergibt einen Ausstrich von über 10 kb bis zum Boden des Gels. </li><li> Ligieren 15 ul teilweise verdauten genomischen DNA mit 800 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem 500 &amp; mgr; l Reaktion. Inkubieren Sie die Reaktions O / N bei 4 ° C. Die großen Reaktionsvolumen maximiert die Ligation von einzelnen Fragmenten, sich selbst und minimiert die Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr DNA-Fragmente. </li><li> Niederschlagste der ligierten DNA durch Zugabe von 50 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,5, und 1 ml 95% Ethanol und Inkubation bei -20 ° C für 20 min. </li><li> Mikrozentrifugen die DNA bei 4 ° C und 13.500 g für 10 min, waschen Sie die Pellet mit 70% Ethanol, trocknen in einer Kreisel Vakuum-Konzentrator und resuspendieren es in 10 ul Nuklease freiem Wasser. Alternativ kann die DNA der Luft bei RT für 15 min getrocknet werden. </li><li> Verwenden Sie 4 ul resuspendiert DNA von E. Transformation coli-Stamm ECD100D pir oder ECD100D pir116 durch Elektroporation, wie in Abschnitt 1. Die R6K γ Replikationsursprung erfordert ein Bakterienstamm mit einem pir-Gen zu replizieren 6. Der PIR-Stamm führt zu geringer Kopien Plasmide und die pir116 Stamm enthält ein pir mutierten Gens, die in hoher Kopien Plasmide führt. Jede Transformante enthält ein neues Plasmid mit dem Transposon und einem Bereich der unterbrochenen Chromosom (1E). </li><li> Inoculaß 5 ml LB-Kan-Medium mit einer Einzelkolonie wachsen sie O / N bei 120 UpM und 37 ° C schütteln und zu reinigen Plasmid-DNA aus der gesamten O / N-Kultur unter Verwendung eines kommerziellen Kits. </li><li> Digest 14 ul der Plasmid mit der Restriktionsendonuklease Xho I. Sicherstellen, dass das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 &amp; mgr; l. Dieses Enzym erkennt eine Stelle in der Mitte des Transposons in das 5&#39;-Ende des Kanamycin-Resistenz-Gen. Analyse 10 ul der unverdauten und verdauten Plasmid auf einem 0,8% Agarosegel (Abbildung 3). Das Plasmid besteht aus dem 2 kb Transposon zzgl flankierenden Wirts-DNA. </li></ol> 5. DNA-Sequenzierung <ol><li> Sequenz, die das Plasmid unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Sequenzierungs-Kits, Primer, die homolog zu jedem Ende des Transposons sind, und eine Kapillare Sequenzierungsanalyse-System. Alternativ kann das Plasmid an einer Außen Einrichtung zur Sequenzierung versendet. </li><li> Verwenden Sie den Molekulargewichtsstandard (1 kb Leiter) indas Gel, um die Größe des Plasmids zu schätzen. Dann schätzen die Zahl der Nanogramm (ng) Plasmid, das für 50 fmol erforderlich ist. </li><li> Messung der Konzentration der Plasmid-DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers bei Wellenlängen von 260 nm (A 260) und 280 nm (A 280). Sicherstellen, dass die Länge des Lichtweges durch die Küvette beträgt 1 cm. Bestimmung der Konzentration durch Multiplikation der Absorption bei 260 nm von 50 ng / &amp; mgr; l. Hochwertige Plasmid-DNA wird einen A 260 / A 280 Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0. </li><li> Das Volumen der für jede Sequenzierungsreaktion erforderlichen DNA ist die Anzahl der NG 50 fmol dividiert durch die Konzentration des Plasmids erforderlich. Mischen das notwendige Volumen des Plasmids mit Wasser, um das Gesamtvolumen auf 10 ul zu bringen. </li><li> Erhitzen der Plasmid-DNA / Wasser-Gemisch bei 96 ° C für 1 min und dann auf RT kühlen. </li><li> Hinzufügen 8 ul Mastermix aus der Sequenzierungs-Kit und 2 &amp; mgr; l von 1,6 &amp; mgr; M einer der Sequenzierungsprimer. </li><li> FolNieder das Protokoll aus der Sequenzierungs-Kit für den Thermocycler-Programm und Reaktions Bereinigung. </li><li> Analysieren Sie jede Probe unter Verwendung einer Kapillare DNA-Analyse-System. </li><li> Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Software-Paket, um die DNA-Sequenz zu sehen. Die Suche nach der Sequenz &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;&quot;, die die letzten 7 bp des Transposons (Figur 4) ist. Die Sequenz vor dem 5&#39;-Ende dieser 7 bp-Segment ist in dem Transposon. Die Sequenz nach dem 3&#39;-Ende dieser 7 bp-Segment ist in dem unterbrochenen Gens. </li><li> Ermitteln Sie die mögliche Funktion des unterbrochenen Gens unter Verwendung der Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Verwenden Sie die folgende link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Fügen die Sequenz der Unterbrechungsed-Gen in das Suchfeld, wählen Sie &quot;Andere&quot; unter der Datenbank und klicken Sie auf &quot;BLAST&quot; am unteren Rand der Seite. Wenn das Ergebnis angezeigt wird, scrollen Sie die Seite, um die Alignment-Ergebnisse (Abbildung 5) zu sehen. </li></ol>

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Der Autor hat nichts zu offenbaren.

Transposon-Mutagenese unter Verwendung eines transposome ist ein effizientes Werkzeug zur Erzeugung Auxotrophen in Enterobacter sp. Ysu und andere Arten von Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien 3,4. Das Verfahren wurde durch Einführung der Tn5 abgeleitetes transposome in den Wirt durch Elektroporation eingeleitet. Kolonien mit Inserts zu identifizieren, hatten die nicht-transformierten Target-Stamm empfindlich sein gegenüber Kanamycin, um die Resistenzmarker von dem Transposon auszu...

Prototrophe Bakterien wachsen in M-9-Minimalsalzmedium, das Glucose (M-9-Medium) enthält, Glukose durch Umwandeln zentralen Kohlenstoffwechselwege für die Vor-, wie Aminosäuren, Nucleinsäuren und Vitamine zu erzeugen, für die Biosynthese 1. M-9-Medium enthält Ammoniumchlorid als Stickstoffquelle, Natrium- und Kaliumphosphat als Puffer und Phosphorquelle, Magnesiumsulfat als Schwefelquelle und Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle. Luria-Bertani (LB) Medium reich an Aminosäuren aus Trypton und Vitamine und Wachstumsfaktoren aus Hefeextrakt. Es unterstützt das Wachstum von auxotrophen Mutanten, die Aminosäuren, Vitamine und andere Wachstumsfaktoren für das Wachstum auf M-9 Medium benötigt nicht synthetisieren kann. So wird Prototrophe in LB und M-9 Medium wachsen, während Auxotrophen wird in LB-Medium, aber nicht in M-9 Medium wachsen. Durch Einführen von Mutationen in einen prototrophen Population von Bakterien und Identifizierung mutierter Gene, die auxotrophen Phänotyp verursachen, ist es possible um ein besseres Verständnis des Stoffwechsels in einem Bakterienstamm zu erhalten. Transposon-Mutagenese kann verwendet werden, um viele der für das Wachstum auf Glucose in M-9-Medium erforderlichen Gene zu identifizieren. Transposons fügen sich zufällig in das Wirtsgenom 2. Durch Tüpfeln Transposon Transformanten auf LB-Agar-Platten und Replika Plattierung sie auf M-9 Medium-Agar-Platten, ist es möglich, für Auxotrophe screenen. Unterbrochen Gene durch Gen-Rettungs identifiziert. In dieser Studie wird ein handelsüblicher Tn5 abgeleitetes transposome die als Lösung eines linearen DNA-Segments mit Transposon-Transposase-Protein gemischt geliefert wird. Das DNA-Segment fehlt ein Transposase-Gen, enthält jedoch ein Gen für Kanamycinresistenz, einen γ R6K-Replikationsursprung und zwei Mosaik Motive, die DNA-Sequenzen für Transposase Bindung an jedem Ende des Segments 3,4 sind. Da das Transposase-Protein direkt an die DNA, die DNA-Segment alleine hinzugefügtals Transposon definiert, und die DNA / Protein-Komplex Transposase als transposome definiert. Die transposome durch Elektroporation 5 in eine Kanamycin empfindlich Host (1A) transformiert. Kolonien, die auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (LB-kan) wachsen Transposon Einsätze (1B) und replikaplattiert Anten, die auf M-9 Medium-Agar-Platten mit Kanamycin (M-9-kan) sind auxotrophen nicht wachsen (Figire 1C). Genomischer DNA aus einer Mutante gereinigt und teilweise mit dem 4-Basisschneidende Restriktionsendonuklease, BFU CI (1D) verdaut. Die ligierte DNA wird in einem Stamm von Escherichia coli (E. coli) transformiert, dass das pir-Gen (1E) enthält. Dieses Gen ermöglicht das neue Plasmid, das Transposon und flankierenden chromosomalen Wirts-Region in E. replizieren 6 coli. Das Kanamycin-Resistenz-Gen dient als alselectable Marker für das neue Plasmid. Schließlich Sequenzierung unter Verwendung von Primern, die komplementär zu jedem Ende des Transposons und Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Analyse der erhaltenen 7,8-Sequenz verwendet werden, um die Identität des unterbrochenen Gene zu bestimmen. Diese transposome Mutagenesestrategie bietet drei Vorteile 3. Erstens, da die Transposase-Protein direkt mit dem Transposon gebunden, Insertion nicht auf die Expression der Transposase-Gens im Wirt ab. Sobald das Transposon integriert sich in das Wirtsgenom wird die Transposase verschlechtert, verhindert weitere Bewegung des Transposons. Allerdings können zusätzliche Bewegung nicht verhindert werden, wenn der Host besitzt eine endogene Tn 5 Transpositionselement. Zweitens Einführung des transposome durch Elektroporation macht es möglich, sie in einer Vielzahl von Wirten verwendet werden. Es entfällt auch die Notwendigkeit, das Transposon durch bakterielle Konjugation oder durch Einführung viral-Infektion. Beide Verfahren erfordern eine Wirtsempfindlichkeit. Drittens Aufnahme des Kanamycin-Resistenz-Gen und den Replikationsursprung R6K γ im transposome macht es einfacher, das unterbrochene Gen zu identifizieren. Transposon-unterbrochenen Bereiche gespeichert und sequenziert, wie Plasmide, wodurch die Notwendigkeit, die inverse Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Identifizierung von Genen verwendet werden. Die in diesem Video vorgestellt Protokoll beschreibt jeden Schritt zur Transposon-Mutagenese von Enterobacter sp. Ysu 9 mit einem transposome von seiner Einführung in den Bakterienzellen zur Identifikation der putativen Gens er unterbrochen. Zusätzlich zum zuvor veröffentlichten Protokollen 3,4,10 werden detaillierte Verfahren zur Verwendung Replika-Plattierung für Auxotrophe Bildschirm dargestellt. Dieses Mutagenese-Technik kann zur Untersuchung von anderen Phänotypen, wie Antibiotika-Resistenzen und Metall verwendet werden, in verschiedenen Arten von Bakterien, identifying die minimale Anzahl von Genen für Wachstums unter definierten Kulturbedingungen in der synthetischen Biologie Studium erforderlich ist oder für den Unterricht ein Labor Bestandteil einer Genetik oder mikrobielle Physiologie natürlich.

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K&amp;gamma;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>ECP09500</td><td>Capable of replicating plasmids with an R6K&amp;gamma; replication origin at a low copy number</td></tr><tr><td>EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>EC6P095H</td><td>Capable of replicating plasmids with an R6K&amp;gamma; replication origin at a high copy number</td></tr><tr><td>5X M-9 Salts</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>When required, media contained 50 &amp;mu;g/ml kanamycin sulfate</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohydrate</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td><td></td><td></td><td>0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 20 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 20 mM Glucose</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>Partial digestion of genomic DNA</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>Plasmid digestion</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>DNA sequencing</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Plasmid purification</td></tr><tr><td>Replica Plating Block</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Velveteen Squares</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>Replica plating</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Diversified Biotech</td><td>PSTK-1100</td><td>Grid for replica plating</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes &amp;ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>Drying DNA</td></tr><tr><td>CEQ 2000XL DNA Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA sequencing</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>DNA sequence analysis</td></tr></tbody></table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Prototrophe Bakterien wachsen auf M-9 Minimalsalzmedium mit Glucose (M-9-Medium) ergänzt, die als Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet wird. Auxotrophe können mit einem transposome erzeugt werden. Die im Handel erhältlichen, Tn 5 stamm transposome in diesem Protokoll verwendet wird, besteht aus einem linearen DNA-Segment, das ein Replikationsursprung R6K γ, der ein Gen für Kanamycinresistenz und zwei Mosaiksequenz endet, die als Transposase-Bindungsstellen dienen. Die transposome, als DNA / Transposase Proteinkomplex vorgesehen ist, wird durch Elektroporation in die prototrophen Stamm, Enterobacter sp eingeführt. Ysu und schließt sich zufällig in diesWirtsGenom. Transformanten werden auf Luria-Replika-Bertani-Agarplatten ausplattiert, die Kanamycin (LB-kan) und auf M-9 Medium-Agar-Platten mit Kanamycin (M-9-kan). Die Transformanten, die auf LB-kan Platten auf M-9-kan Platten wachsen, aber nicht gelten als Auxotrophen sein. Gereinigter genomischerDNA aus einer auxotroph ist teilweise verdaut, ligiert und in einen pir + Escherichia coli (E. coli) Stamm transformiert. Die R6Kγ Replikationsursprung ermöglicht das Plasmid in pir + E. replizieren coli-Stämme und die Kanamycin-Resistenzmarker-Plasmid ermöglicht die Auswahl. Jede Transformante besitzt ein neues Plasmid, das das Transposon durch die unterbrochene chromosomale Region flankiert. Sanger-Sequenzierung und die Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) deuten auf eine vermeintliche Identität des unterbrochenen Gens. Es gibt drei Vorteile bei der Verwendung dieses transposome Mutagenese-Strategie. Erstens ist es nicht auf die Expression einer Transposase-Gen von der Wirts verlassen. Zweitens wird die transposome in den Ziel-Host durch Elektroporation, anstatt durch Konjugation oder Transduktion eingeführt und ist daher effizienter. Drittens macht die R6Kγ Replikationsursprung es leicht zu identifizieren, die die mutierte gene, die in einem rekombinanten Plasmid teilweise zurückgewonnen wird. Diese Technik kann verwendet werden, um die in anderen Eigenschaften von Enterobacter sp beteiligten Gene zu untersuchen. Ysu oder einer größeren Vielzahl von Bakterienstämmen.

Transformation von Enterobacter sp. Ysu durch Elektroporation mit dem transposome eingeleitet Zufalls Genom Insertion in das Wirtsgenom (1A, B). Eine erfolgreiche Elektroporation ergab mehrere tausend Transformanten, auf LB-kan Platten wuchs. Um 300-400 zu erhalten, gut verteilte Kolonien pro Platte, wurde die Menge der Transformationsmischung Spread an jedem LB-kan-Agar-Platte optimiert. Jeder Trans enthalten mindestens ein Transposon-Einsatz, aber es war nicht klar, ob ein wichtiges Gen für ...

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Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K Aufrufe.  Youngstown State University.  Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert. 

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Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic characteristics, this unconventional yeast is not only a good model for the study of the fundamental nature of fungal differentiation but is also a promising microbial platform for biochemical production and various biotechnological applications, which require extensive genetic manipulations. However, genetic manipulations of Y. lipolytica have been limited due to the lack of an efficient and stable genetic transformation system as well as very high rates of non-homologous recombination that can be mainly attributed to the KU70 gene. Here, we report an easy and rapid protocol for the efficient genetic transformation and for gene deletion in Y. lipolytica Po1g. First, a protocol for the efficient transformation of exogenous DNA into Y. lipolytica Po1g was established. Second, to achieve the enhanced double-crossover homologous recombination rate for further deletion of target genes, the KU70 gene was deleted by transforming a disruption cassette carrying 1 kb homology arms. Third, to demonstrate the enhanced gene deletion efficiency after deletion of the KU70 gene, we individually deleted 11 target genes encoding alcohol dehydrogenase and alcohol oxidase using the same procedures on the KU70 knockout platform strain. It was observed that the rate of precise homologous recombination increased substantially from less than 0.5% for deletion of the KU70 gene in Po1g to 33%-71% for the single gene deletion of the 11 target genes in Po1g KU70&#916;. A replicative plasmid carrying the hygromycin B resistance marker and the Cre/LoxP system was constructed, and the selection marker gene in the yeast knockout strains was eventually removed by expression of Cre recombinase to facilitate multiple rounds of targeted genetic manipulations. The resulting single-gene deletion mutants have potential applications in biofuel and biochemical production.

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Forschung

Genetik

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Immunologie und Infektion

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Schnelle Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit modularem Golden Gate Klonen

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Biotechnik

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

The Green Monster Verfahren zur Erzeugung von Hefestämmen Buchwert Multiple Deletionen

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Erzeugung

Zusammenfassung

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