יש הסופרים לא תודות.

1. מיכה ושקופיות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מס &#39;1 וחצי (0.17 מ&quot;מ) coverslips למדף מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate במשך 30 דקות בחומר ניקוי 2% ב60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 20 פעמים עם מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות באמצעות מלקחיים ומכה יבש באמצעות אוויר או חנקן דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים גיליון נציץ לתוך 10 x 10 מ&quot;מ חתיכות מרובעות באמצעות מספריים או סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כל חתיכה נציץ לתוך 2-3 עלונים דקים באמצעות סכין גילוח. הערה: שלב זה דורש שימוש בסכין חד. </li></ol> 2. עצרת מיכה וקאמרי הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית נקייה מיקרוסקופית זכוכית עם אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלון דבק נציץ לחתוך בשלב 1.6 לשקופית זכוכית באמצעות דבק אופטי. דבק צמיגות נמוך מומלץ לפזר טוב יותר את הירידה ומדביק את המיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא תחת מנורת UV, 10 דקות. הערה: הדבק הוא נרפא על ידי אור UV עם ספיגה מקסימלית בטווח של 350 ל380nm ואנרגיה המומלצת requIRED לריפוי מלא הוא 4.5 J / 2 סנטימטר. עם זאת, מקורות אור שונים יכולים לשמש לצעד זה (ראה חומרים המסופקים על ידי ספק דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את משטח נציץ נקי על ידי הסרת כמה השכבות הראשונות עם סקוטש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה קטנה (~ 20 מיקרומטר) של דבק אופטי על גבי המשטח נציץ. הערה: בשלב זה, דבק צמיגות גבוה עם רמת autofluorescence הנמוכה מומלץ. הניסיון שלנו הראה כי שימוש בשילוב של נמוך (שלב 2.2) ודבקי צמיגות גבוהים מגביר את היעילות באופן משמעותי מפיצול נציץ (שלב 2.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות coverslip נוקה לאחרונה על הירידה של דבק, הימנעות בועות אוויר, בואו נתפשר על דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא תחת מנורת UV, 10 דקות. הערה: לאחר שלב זה, את הכריך של שקופיות זכוכית, נציץ וcoverslip ניתן לאחסן לתקופה ארוכה יחסי של זמן (עד מספר שבועות). להמשיך לשלב הבא ממש לפני הכנת SLB בפועל, כדי לוודא שהמשטח נציץ הוא טרי. הערה: הדבק הוא נרפא על ידי אור UV עם ספיגה מקסימלית בטווח של 350 ל380nm והאנרגיה המומלצת הנדרשת לריפוי מלא הוא 4.5J/cm 2. עם זאת, מקורות אור שונים יכולים לשמש לצעד זה (ראה חומרים המסופקים על ידי ספק דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין exacto, בעדינות לרדת מאופני coverslip משקופיות זכוכית הצד כפי שמוצג בסרטון. ברוב המקרים, שכבה דקה ושטוחה של נציץ תישאר מחוברת לcoverslip. מיכה מצורף לשקופית זכוכית ניתן לעשות שימוש חוזר (חוזר מצעד 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות פני השטח על ידי עין בלתי מזוינת או תחת מיקרוסקופ לנתח, על מנת לוודא כי שכבה נציץ עדיין דבוקה לcoverslip ולא הוסרה לחלוטין במהלך הפיצול בשלב 2.8. מה שהופך את שריטה קטנה עם מלקחיים או לנתח מחט יעזור להבחין בין הדבק שבו יש עקביות שונה במובחן מיציץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את אטם גומי ממיליליטר בקבוקון כובע 1.5 ולהדביק את הכובע הפוך אל פני השטח באמצעות אופטידבק או לק, ולרפא עם מנורת UV, או שאוויר יבש 10 דקות, בהתאמה. הערה: אם המדגם הוא מוכן לבו זמנית אופטי (TIRFM או confocal) עם ההדמיה AFM, מיליליטר בקבוקון כובע 1.5 עשוי להיות קטן מדי כדי לעלות על ראש AFM על הבמה מיקרוסקופ. במקרה זה, הכובע עשוי להיות מוחלף על ידי כל O-טבעת פלסטיק בקוטר גדול יותר, מתאימה לראש AFM גובר. במקרה כאשר הניסוי דורש הסרת המכסה מבלי לפגוע במשטח נציץ, גריז סיליקון יכול לשמש במקום דבק או לק. </li></ol> 3. גיבוש נתמך יפידים bilayer (SLB) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פתרון יפוזום מוכן טרי לתוך תא עם משטח. ההיקף המינימאלי הנדרש להיווצרות SLB הוא ~ 30 μl. הערה: לפרטים נוספים על יפוזום והיווצרות SLB, עיין בפרוטוקולים שפורסמו, כגון כגון התיק ואח&#39; 2014 15.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם היווצרות SLB באמצעות פרוטוקול רצוי. במהלך דגירה והדמיה, החדר יכול להיות ממוקם בחום לחסום או במה מיקרוסקופ מחוממת כדי לשמור דרושה כדי לשמור על השומנים בשימוש מעל לטמפרטורת ההתכה שלהם טמפרטורה. </li></ol>

<ol>
	<li>Giocondi, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topography+of+membrane+domains.">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+analysis+of+membrane+dynamics.">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li><li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer.">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li><li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li><li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures.">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li><li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li><li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation.">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li><li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+supported+lipid+bilayer+study.">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li><li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers.">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li><li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions.">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li><li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+supported+lipid+bilayers:+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics.">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li><li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li><li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence/atomic+force+microscopy+studies+of+DPPC/dPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers.">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li><li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy.">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li><li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li><li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנת משטחים נציץ חלקים ודקים לתצהיר bilayer שומנים והדמיה ברזולוציה גבוהה. הטכניקה דורשת מיומנויות ידניות מינימליות, מוגבלות בעיקר לפירוק זהיר של כריך הזכוכית נציץ זכוכית (שלב 2.8), שהוא קריטי לקבלת משטח נציץ באיכות גבוהה. בדיקה של נציץ ביקע טרי נדר...

המטרה הכללית של הפרוטוקול הנוכחי היא להראות שיטה להכנת משטחים נציץ להדמיה ברזולוציה גבוהה של שומנים בדם bilayers נציץ נתמך (SLBs) באמצעות מיקרוסקופ אופטי סך הקרינה ההשתקפות פנימית (TIRFM) או confocal, אשר יכול גם להיות משולב עם כוח אטומי מיקרוסקופ (AFM). SLBs הוא מודל המשמש באופן נרחב למחקרים רבים של אשכולות שומנים בדם, הפרדה פאזות, דינמיקה של מרכיבי bilayer או האינטראקציות שלהם עם פפטידים, חלבונים או תרכובות אחרות 1-5. מצעים שונים עשויים לשמש להיווצרות SLB (כלומר זכוכית, נציץ, דו תחמוצת הצורן, פולימרים), בהתאם לאופי של המחקר 4,6-8. מחקרי קרום אופייניים להסתמך על שיטות הדמיה המבוססת על מיקרוסקופיה, כגון TIRFM וAFM. לפיכך, להדמית TIRFM, משטח זכוכית הוא בחירה אופיינית בגלל הזכוכית היא שקופה. הכנת הזכוכית היא קלה יחסית, ואיכות התוצאות היא בעיקרנקבע על ידי פני השטח יסודיים ניקוי לפני התצהיר של שלפוחית ​​שומנים. AFM בשל הרזולוציה הגבוהה הצירית דורש משטחים נציץ. מיכה הוא מינרל סיליקט, עם קרוב ל מחשוף בסיס מושלם. לפיכך, נציץ ביקע הטרי הוא שטוח אטומי, המאפשר תצפית של הפרשי גובה קרום אפילו בקנה המידה תת ננומטר 9. מחקרי דיפוזיה תוך שימוש בשיטות כגון מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS), אחת מולקולת מעקב (SMT), והתאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) הראו עם זאת, כי דינמיקת הקרום השומני תלויה במידה רבה בסוג של משטח עליו הם מופקדים, לפיה זכוכית ותציץ יכול לתת תוצאות שונות באופן נרחב 10,11. הבדלים אלה כוללים לא רק את מקדמי דיפוזיה של בדיקות הקרום, אלא גם את זיהוי של אוכלוסיות נפרדות של חלקיקים לשדר עם תעריפים שונים, ואולי גם מעבר בין מדינות שונות. כך,ההשוואה הישירה של תוצאות שהושגו תוך שימוש בטכניקות TIRFM וAFM היא לעתים קרובות בעייתית, אלא אם כן אותו המשטח (במקרה נציץ זה) משמש. אמנם יש כמה מחקרים שבם ההדמיה bilayer TIRFM וAFM נערכה על אותו המשטח נציץ 12,13, נציץ ומשמש רק לעתים נדירות למיקרוסקופיה אופטית, בעיקר בגלל בעיות טיפול. הכנה נציץ דורשת חיתוך ביד לעלונים דקים, אשר לאחר מכן מודבקים על coverslip באמצעות דבק אופטי 12. שיטת אולם זה דורשת קצת תרגול כדי להשיג תוצאות משביעות רצון. יתר על כן, המשטחים שהושגו הם לעתים קרובות גליים ועבים, מה שהופך אותם קשה לשימוש עם מרחק עבודה נמוך, עדשות צמצם מספריות גבוהות. משטחי מיכה מוכנים כפי שתואר בפרוטוקול זה הם דקים מאוד (~ 220 מיקרומטר, כולל עובי coverslip של 170 מיקרומטר) ושטוח מאוד, הימנעות &quot;גלי&quot;, שהוא קריטי להדמיה ברזולוציה גבוהה מוצלחת. הם יכולים לשמשעבור setups TIRFM או confocal. יתר על כן, ניתן להעביר את אותו הדגימות לAFM, ואפילו צילמו בו זמנית עם TIRFM / confocal ו AFM. שילוב של שתי טכניקות אלו מאפשרת קשר ישיר של דיפוזיה התנהגות עם מבנה קרום bilayer 14. מכיוון שמשטחים נציץ הם ביקע טריים, שהם נקיים ואינם דורשים זמן רב, בצורה גרועה לשחזור, והליכי ניקוי שעלול להיות מסוכנים (פרוטוקולי ניקוי זכוכית בדרך כלל כוללים כימיקלים כגון פתרון Piranha, חומצה גופרתית, נתרן / אשלגן הידרוקסידי). הרכבה של חדר קטן, גם תואר בפרוטוקול, מפחית את עוצמת הקול של שלפוחית ​​הנדרשת להיווצרות bilayer יעילה פחות מ50 μl. לבסוף, את כל התהליך של הרכבה משטח הוא לא זמן רב (הכנה לוקחת פחות מ 30 דקות), ואינה דורשת רמה גבוהה של מיומנות ידנית, כפי שעושה מחשוף נציץ קונבנציונלי והדבקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="710">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Coverslips 24 x 50mm - No H1.5</td>
			<td style="width:135px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">102222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DOPC</td>
			<td style="width:135px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hellmanex III (detergent)</td>
			<td style="width:135px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">320.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mica V-1 Grade</td>
			<td style="width:135px;">SPI Suppliers</td>
			<td style="width:119px;">1872-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (high viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (low viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sphingomyelin-ATTO647N</td>
			<td style="width:135px;">AttoTec</td>
			<td>AD 647N-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">UV lamp</td>
			<td style="width:135px;">Synoptics Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">GelVue GVM20</td>
			<td>The lamp was set to 100% power</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

bilayers שומנים נתמך (SLBs) נמצא בשימוש נרחב כמודל ללימוד תכונות קרום (הפרדת פאזות, אשכולות, דינמיקה) והאינטראקציה שלה עם תרכובות אחרות, כגון תרופות או פפטידים. עם זאת מאפייני SLB שונים בהתאם לתמיכה בשימוש. טכניקות המשמשות בדרך כלל להדמית SLB ומדידות הן מיקרוסקופיה הקרינה מולקולה בודדת, FCS ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). מכיוון שרוב מחקרי הדמיה אופטיים מתבצעים על תמיכת זכוכית, תוך AFM דורש משטח שטוח מאוד (בדרך כלל נציץ), תוצאות של טכניקות אלה לא ניתן להשוות באופן ישיר, שכן המאפיינים של הטעינה והחלקות של חומרים אלו משפיעים במידה רבה דיפוזיה. למרבה הצער, ברמה הגבוהה של מיומנות ידנית הנדרשת לחיתוך והדבקת פרוסות דקות של נציץ לשקופית הזכוכית מציגה משוכת לשימוש השגרתי של נציץ להכנת SLB. למרות שזה יהיה שיטת הבחירה, נציץ והכין כזהמשטחים לעתים קרובות בסופו של דבר להיות לא אחיד (גלי) וקשה לתמונה, במיוחד עם מרחק עבודה קטן, עדשות צמצם מספריות גבוהות. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לשחזור להכנת משטחים נציץ דקים ושטוחים לתצהיר שלפוחית ​​שומנים בדם והכנת SLB. בנוסף, קאמרי המותאם אישית שלנו דורש כמויות קטנות מאוד של שלפוחית ​​להיווצרות SLB. התוצאות הכוללות ההליך בייצור יעיל, פשוט וזול של משטחי bilayer שומנים באיכות גבוהה, כי הם ישירות דומים לאלה המשמשים במחקרי AFM.

דיפוזיה ההתנהגות של בדיקות שומנים בדם ניאון בSLBs היא שונה בהתאם למצע. TIRFM בשילוב עם טכניקת SMT הוא שיטה יקר המאפשר הדמית תנועות חלקיקים וחילוץ מקדמי דיפוזיה שלהם. אותות מולקולה אחת של בדיקה Sphingomyelin-ATTO647N לשדר בdOPC bilayer (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) נתמך על זכוכית ואציץ מוצג?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging at JoVE.com

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

אנו מציגים שיטה של ​​הכנת bilayers שומנים נציץ נתמך למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מיכה הוא שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי, אבל כמעט ולא משתמש בהדמיה בגלל טיפול בקשיים; ההכנה שלנו תוצאות בתצהיר גם של הגיליון נציץ, ומפחיתה את החומר המשמש בהכנת bilayer.

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

preparation-mica-supported-lipid-bilayers-for-high-resolution-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K Views.  Nanyang Technological University.  אנו מציגים שיטה של ​​הכנת bilayers שומנים נציץ נתמך למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מיכה הוא שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי, אבל כמעט ולא משתמש בהדמיה בגלל טיפול בקשיים; ההכנה שלנו תוצאות בתצהיר גם של הגיליון נציץ, ומפחיתה את החומר המשמש בהכנת bilayer. ...

Video: Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the optical mean free path (~1 mm in skin) with high resolution. By combining optical absorption contrast with the high spatial resolution of ultrasound in a single modality, this technique can penetrate deep tissues. Photoacoustic microscopy systems can have either a low acoustic resolution and probe deeply or a high optical resolution and probe shallowly. It is challenging to achieve high spatial resolution and large depth penetration with a single system. This work presents an AR-OR-PAM system capable of both high-resolution imaging at shallow depths and low-resolution deep-tissue imaging of the same sample in vivo. A lateral resolution of 4 &#181;m with 1.4 mm imaging depth using optical focusing and a lateral resolution of 45 &#181;m with 7.8 mm imaging depth using acoustic focusing were successfully demonstrated using the combined system. Here,&#160;in vivo&#160;small-animal blood vasculature imaging is performed to demonstrate its biological imaging capability.

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Here a switchable acoustic resolution (AR) and optical resolution (OR) photoacoustic microscopy (AR-OR-PAM) system capable of both high resolution imaging at shallow depth and low resolution deep tissue imaging on the same sample in vivo is demonstrated.

רזולוציה אקוסטית ואופטית למיקרוסקופיה פוטוקוסטית עבור<em&gt; בויבו</em&gt; בעלי חיים קטנים דם Vasculature הדמיה

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.