This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

הערה: נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות 26. הפרוטוקול (MO13M391) אושר על ידי ועדת אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בג&#39;ונס הופקינס. קורבן 1. ילודי עכבר, Dissection, וקיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר בילוד משאיפת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנותק מייד hindlimb מעל הברך. עד שיום כ 7 לאחר הלידה, עצמות הרגל רכות מספיק כדי לחתוך דרך במספריים מעבדה גדולים או סכין חד ולאחר מכן קטע על cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את hindlimb ב 10 מיליליטר של paraformaldehyde 4% קרים כקרח שבנאגר מלוח פוספט (PBS) בצינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טבילה לתקן hindlimb בparaformaldehyde ל4-24 שעות על 4 מעלות צלזיוס. רקמה עוברית דורשת כמה שעות בלבדים של קיבעון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע מקיבעון יותר מ 24 שעות, מכיוון שהדבר עלול להפחית את יעילות assay TUNEL. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect hindlimb ידי טבילתו בתמיסת סוכרוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות paraformaldehyde לסוכרוז 10% ב- PBS באותו הצינור 15 מיליליטר, דגירה הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לסוכרוז 30% ב- PBS, דגירה הלילה ב 4 ° C או עד כיורים hindlimb לחלק התחתון של הצינור. רקמה ניתן להשאיר בסוכרוז% 30 לתקופה ארוכה יותר, ובלבד שסוכרוז כבר מסונן סטרילי. </li></ol></li></ol> 2. רקמות הטבעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שכותרתו חצי דרך עובש הטבעה עם ההטבעה בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח hindlimb על גבי מדיום ההטבעה, עם הצד החתוך הקרוב ככל האפשר לקיר אחד של העובש. סמן את הכיוון של hindlimb בצד החיצוני של העובש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע כמה hindlimbs ולחתוך באותו הבלוק. עם זאת, חשוב להבטיח כי כל היןdlimbs בבלוק מכוון מקביל זה לזה כדי לקבל חלקים ברמות תואמות לאורך הציר של הגפיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות hindlimbs עם ההטבעה בינונית. אם hindlimbs Shift לחוץ בזמן השפיכה הבינוני, מחדש מכוונים אותם עם מלקחיים קהים שקצהו או קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הטמעה בינונית לחדור את הרקמה בטמפרטורת חדר למשך לפחות 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבניות מקום ישירות על קרח יבש או באיזופנטאן על קרח יבש להקפיא הטבעה בינונית. הקפד לשמור על רמת התבניות בכל העת ולהימנע מהסטה של ​​הרקמה המוטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תבניות קפוא ב -80 ° C עד מוכן לחתוך, לתקופה של עד מספר חודשים. </li></ol> 3. איברים Cryosectioning Embedded <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורה שנקבעה cryostat הקאמרית ל-20 ° C, טמפרטורת אובייקט ל-18 מעלות צלזיוס; להתאים טמפרטורת אובייקט למטה לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את גוש הרקמה בתוך חדר cryostat לפחות 30 דקות. טמפ &#39;בלוק הנכוןerature הוא קריטי לאיכות סעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חלקים רוחביים בעובי של 10 מיקרומטר או פחות. חלקים עבים יותר לא חדרו באופן מלא על ידי חומרים כימיים TUNEL. השתמש בצלחת אנטי-רול, להבים, וזווית להב (בדרך כלל 5 מעלות) מומלצים לcryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חלקים על gelatin- או שקופיות זכוכית vectabond מצופים בטמפרטורת חדר. הנח מייד לתיבה להחליק על קרח יבש. שמור את תיבת השקופיות במכל נפרד עם קרח יבש ממוקם ליד cryostat בהישג יד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חלקים רוחביים סידוריים דרך ציר הגפה הארוך, דילוג 100-200 מיקרומטר. לאסוף לפחות 3 חלקים סמוכים בכל רמת סדרתי. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Assay על סעיפים Hindlimb באמצעות ערכה זמינה מסחרי (בכל הצעדים בטמפרטורת חדר אלא אם צוין) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר שקופיות עם חלקים לטמפרטורת חדר ולילה יבש או בסוף השבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם סעיפים על ידי immersinשקופיות g בPBS עבור 2 x 10 דקות בצנצנת Coplin. יבש עם מעבדה לנגב, הסרת כמה שיותר נוזל סביב הסעיף ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי Permeabilize <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באחת שאינו מפרקי חלבונים, מגיב מבוסס saponin מסחרי או 0.5% Tween20 ו0.05% Triton X100 בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופית לתוך תא לחות. תא לחות פשוט הוא תיבת קצה פיפטה ריקה עם מכסה הדוק, עם הוסיפו מספיק מים כדי לכסות את החלק התחתון של התיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספיק מגיב פיפטה לשקופית כדי לכסות את הסעיף (50 μl מספיק עבור גפיים עכבר בילוד). אל פיפטה ישירות על הסעיף, כפי שתסיסה חוזרת ונשנית עלולה לגרום לסעיף להרים את השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים קהים שקצהו, למקם את המלבן קטן של parafilm על גבי הסעיף להתפזר הירידה של מגיב ולכסות את הסעיף לחלוטין. אם כל בועות יוצרות תחת parafilm, בעדינות להרים אותו, יבש, ולהחיל מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות עם permeabiliמגיב zation עבור שעה 1 בתא לחות מכוסה. אם חלקים מתחילים להמריא מהשקופיות, זמן permeabilization עשוי להיות מופחת עד 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בPBS בדקות 2 x 5 צנצנת Coplin. המלבנים parafilm צריכים לצוף למעלה ולאחר מכן ניתן להסיר ומבוטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מעבדה לנגב, לייבש כמה שיותר נוזל סביב הסעיפים ככל האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג הפסקת DNA בתיווך TDT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הוראות הערכה לעשות חיץ 1x TDT תיוג, תיוג חיץ מספיק פיפטה לשקופית כדי לכסות קטע רקמה (50 μl מספיק עבור גפיים עכבר בילוד). דגירה בתא לחות במשך 5 דקות. לחלופין, לטבול את השקופית במאגר תיוג TDT בצנצנת coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר הוראות ערכה לעשות תערובת תיוג TDT. הערכה כוללת קובלט, מגנזיום, מנגן וקטיונים; קטיון מנגן עובד היטב במגוון רחב של רקמות, כולל שרירי שלד, Tiss מערכת עצביםUES, כבד, עור, ועצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת חיובית, להוסיף DNase (שכותרתו &quot;nuclease&quot; בערכה) לתערובת תיוג TDT. לחלופין, טרום לטפל סעיף בקרה חיובי עם DNase במאגר nuclease עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, בהתאם להוראות ערכה. שמור על פתרון DNase וחתכים שטופל DNase מסעיפים ניסיוניים אחרים כדי למנוע זיהום צולב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת שלילית, להשמיט אנזים TDT מתערובת התיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר חיץ תיוג TDT משקופית ככל האפשר. תערובת תיוג פיפטה TDT לשקופית (50 μl לכל סעיף), מכסה במלבן חדש של parafilm, ודגירה בתא לחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הוראות הערכה לעשות חיץ תחנת 1x. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר תערובת תיוג TDT מהשקופיות, ולהוסיף 200-300 חיץ תחנת μl כדי לכסות את קטע הרקמה, דגירה בתא לחות במשך 5 דקות. אל<html> ternatively, לטבול את השקופית במאגר תחנה בצנצנת Coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שקופיות דקות 2 x 2 בPBS. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר PBS מהשקופית ככל האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר הוראות ערכה להכנת פתרון תיוג והעמסת לתייג dNTPs בהפסקות DNA. פתרון פיפטה לשקופית (50 μl לכל סעיף), מכסה במלבן חדש של parafilm, ודגירה בתא לחות למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית לשטוף עבור 2 דקות ב PBS בצנצנת Coplin. השתמש במעבדה לנגב כדי להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר מהשקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל Hoechst 33258 גרעיני כתם עד 1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS ופיפטה לשקופית (100-200 μl מספיק לכסות סעיף). דגירה בתא לחות במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x במשך 5 דקות בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip עם antifade תקשורת הרכבה הקרינה ולאטום קצוות עם לק. </li></ol></li></ol>&gt; 5 רכישת jove_title &quot;. דיגיטלית תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי עם DAPI, FITC, ומסנני טקסס אדומים (או שווה ערך). השתמש במטרה גבוהה יותר הגדלה (20X או 40X) כדי לוודא שהתיוג היה מוצלח וגרעינים (שלמים או מקוטעים) תויגו. מטרת 10X מספיק כדי לכמת את puncta TUNEL-החיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות של צביעת Hoechst, מכתים TUNEL, ואות autofluorescent כשלושה ערוצים בצבעים מלאכותיים נפרדים בשילוב בתמונה אחת. אם תווית fluorophore TUNEL היא ירוקה, אות autofluorescent תמונה במסנן האדום, ולהפך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כל הגדרות ההדמיה שווה בין השקופיות לthresholding וquantitation שלאחר מכן. עבור כל מסנן, זמנים מוגדרים מראש וחשיפת שיא, רווח, וbinning (לא binning הוא הטוב ביותר); לא להשתמש בהגדרות חשיפה או רווח אוטומטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בניסוי וטעייה כדי למצוא הגדרות חשיפה ורווח שיהיה ללכוד הטוב ביותר בטווח של intensities בכל השקופיות המוכתמות. ודא שאין פיקסלים רוויים בתמונות שנרכשו, כquantitation הטיה רצון זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של כל קבוצת השרירים של עניין. זה עשוי לדרוש מספר רב של תמונות ש&quot; תפור &quot;ביחד. </li></ol> ניתוח 6. תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתוכניות ניתוח תמונה זמינות מסחרי כדי לנתח תמונות דיגיטליות של מכתים TUNEL. ניתוח באמצעות תוכנה מסחרית מוצג כאן. לחלופין, ImageJ התוכנה החופשי מNIH ניתן להשתמש כדי לנתח מכתים TUNEL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם סעיף סמוך לסעיף מוכתם TUNEL עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E) ולקחת תמונה דיגיטלית מלא קטע עם מיקרוסקופ brightfield קונבנציונלי. השתמש בתמונה זו H &amp; E בשילוב עם אטלס האנטומיה 5,18,19 לאתר את המבנים אנטומיים שיש לכמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ערוץ TUNEL כבוי, להתחקות באופן ידני את קווי המתאר של האזור שיש לכמת, באמצעותHoechst וערוצי autofluorescence להדרכה. להמיר את האזור איתר לתוך מסכה (סט של פיקסל נבחר מרכז להיות מנותח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ערוץ TUNEL. שימוש בעוצמת thresholding פונקציה בתכנית ניתוח תמונה, לקבוע את הסף התחתון שלא לכלול את כל אות autofluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחיל את אותן הגדרות סף לכל התמונות בסט המחקר. המרת בחירות thresholded למסכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תמונה, לשלב את מסכת אזור השריר ומסכת TUNEL. מסכת השילוב החדשה תייצג אות TUNEL בתוך אזור השריר לייחס רק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע quantitation מסכה על מסכת שילוב לקבוע מספר האובייקטים ומתנגדים אזור של אות TUNEL בתוך אזור השריר איתר. לבצע את זה באמצעות פונקצית החלקיקים Analyzer בImageJ. </li></ol>

<ol><li>Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+end-labelling+detects+DNA+strand+breaks+in+apoptosis+and+other+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states.</a> 170 (1), 1-8 (1993).</li>
<li>Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+as+a+tumor+marker+of+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">TUNEL as a tumor marker of tongue cancer.</a> Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).</li>
<li>Colecchia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+by+the+TUNEL+technique+in+clinically+localised+prostatic+cancer+before+and+after+combined+endocrine+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy.</a> 50 (5), 384-388 (1997).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Delaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Limb+Anatomy+Atlas%3A+an+interactive+3D+tool+for+studying+embryonic+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning.</a> 8, 83(2008).</li>
<li>Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrotic+cell+death+by+the+TUNEL+assay+in+the+hypoxic-ischemic+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain.</a> Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDidenko%2C+VV+%22In+Situ+Detection+of+DNA+Damage+%3A+Methods+and+Protocols%22">In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols</a>. , Humana Press. 978-970 (2002).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).</li>
<li>Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+detection+of+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for the detection of DNA fragmentation.</a> J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).</li>
<li>Fayzullina, S., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+DNA+damage+precedes+spinal+motor+neuron+DNA+damage+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA).</a> PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).</li>
<li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+cell+death+in+the+developing+cerebral+cortex+of+the+rat.+Evidence+of+apoptosis-associated+internucleosomal+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation.</a> Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Gown, A. M., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+in+archival+paraffin+sections%3A+immunohistochemistry+using+antibodies+to+cleaved+caspase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3.</a> J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).</li>
<li>Hara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+apoptosis+studied+by+a+sequential+TUNEL+technique%3A+a+method+for+tract-tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).</li>
<li>Harn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+occurs+more+frequently+in+intraductal+carcinoma+than+in+infiltrating+duct+carcinoma+of+human+breast+cancer+and+correlates+with+altered+p53+expression%3A+detected+by+terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated+dUTP-FITC+nick+end+labelling+%28TUNEL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL).</a> Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).</li>
<li>Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+detection+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Screening and detection of apoptosis.</a> J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).</li>
<li>Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Koppen, G., Angelis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+X-ray+induced+DNA+damage+measured+by+the+comet+assay+in+roots+of+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba.</a> Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).</li>
<li>Kuehl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Labat-Moleur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+apoptotic+cell+detection+in+tissue+sections%3A+critical+evaluation+and+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement.</a> J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).</li>
<li>Modak, S. P., Bollum, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+measurement+of+single-strand+breaks+in+nuclear+DNA+in+fixed+lens+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections.</a> Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).</li>
<li>Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+against+single-stranded+DNA+detects+both+programmed+cell+death+and+drug-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis.</a> Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).</li>
<li>National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).</li>
<li>Negoescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+apoptotic+cell+labeling+by+the+TUNEL+method%3A+improvement+and+evaluation+on+cell+preparations%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations).</a> J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hypothermia+mitigates+post-ischemic+neuronal+death+following+focal+cerebral+ischemia+in+rat+brain%3A+immunohistochemical+study+of+Fas%2C+caspase-3+and+TUNEL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL.</a> Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+death+in+the+immature+brain+is+an+apoptosis-necrosis+morphological+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-NMDA+and+NMDA+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+deaths+in+adult+brain+are+morphologically+distinct%3A+further+evidence+for+an+apoptosis-necrosis+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).</li>
<li>Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+programmed+cell+death+in+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">De novo programmed cell death in oral cancer.</a> Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).</li>
<li>Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+and+apoptosis+of+smooth+muscle+cells+in+intracranial+aneurysms.+Studies+with+in+situ+DNA+end+labeling+and+antibody+against+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir.%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA.</a> Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry+under+the+influence+of+pH+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies.</a> J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+apoptosis+in+breast+cancer+pT1-pT2%29.+A+TUNEL%2C+p53%2C+bcl-2%2C+bag-1+and+Bax+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.Histopathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study.</a> Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).</li>
<li>Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+apoptosis-inducing+factor+%28AIF%29+in+keratoacanthomas+and+squamous+cell+carcinomas+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin.</a> Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).</li>
<li>Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rheumatoid+arthritis+synovial+membrane%3A+modulation+by+disease-modifying+anti-rheumatic+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology.%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment.</a> Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).</li>
<li>Stadelmann, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+in+tissue+sections%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis in tissue sections).</a> Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).</li>
<li>Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+cells+exposed+to+ionizing+radiation+by+use+of+anti-single-stranded+DNA+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody.</a> Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).</li>
<li>Watanabe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptotic+cells+in+human+colorectal+cancer+by+two+different+in+situ+methods%3A+antibody+against+single-stranded+DNA+and+terminal+deoxynucleotidyl+transferase-mediated+dUTP-biotin+nick+end-labeling+%28TUNEL%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods.</a> Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+signal-regulating+kinase+1+is+involved+not+only+in+apoptosis+but+also+in+non-apoptotic+cardiomyocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).</li>
<li>Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+by+a+caspase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor.</a> Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

שיטה לאיתור ולכמותית לנתח אפופטוזיס הקשורים נזק ל- DNA בשרירי שלד עכבר מתואר. ההליך כולל קצירת רקמה, צביעת TUNEL, רכישת תמונה דיגיטלית, וניתוח תמונה. אספקה ​​היסטולוגית משותפת וכלים נחוצים, וערכת TUNEL מסחרית מיוחדת היא הכרחית. פריטי הציוד הגדולים החיוניים הדרושים הם מערכת מחשב לניתוח תמונה cryostat, מיקרוסקופ epifluorescent עם יכולת תמונה דיגיטלית, ו. הנסיין צריך להיות מודע לבעיות פוטנציאליות. autofluorescence רקמות הוא דאגה העיקרית בתחום ההדמיה הקרינה. בבעלי החיים unperfused, שנותר תאי דם אדומים יתרום אות autofluorescent גבוהה למדי. תאי האנדותל יכולים להיות גם autofluorescent באופן משמעותי. לכן, חשוב לוודא כי autofluorescence הוא לא טועה לאות TUNEL-חיובית. הערכה זו מושגת בקלות על ידי לקיחת תמונה בערוץ ללא fluorophore, שישמש להשוואה וחיסור אפשרי מהערוץ TUNEL-החיובי. בדרך זו, שיטת TUNEL הקרינה מבוססת עדיפה על שיטות מיקרוסקופיה brightfield colorimetric שאינו מציעות בקרה פנימית לצביעת רקע. קיבעון רקמות יהיה השפעות משמעותיות על ההצלחה של תיוג TUNEL. עדיף לצמצם את זמן קיבוע בparaformaldehyde, שלא יעלה על 24 שעות. רקמה עוברית וילוד תדרוש פעמים קיבעון קצרות יותר באופן משמעותי מאשר 24 שעות. כאשר תיוג TUNEL הוא מוצלח, אות TUNEL החיובי צריכה להיות הרבה יותר גבוהה מאשר autofluorescence רקע, כך אות שניתן לבודד בקלות על ידי gating עוצמת הסף באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. אחזור Antigen שימוש בפרוטוקול הרגיל של חימום במאגר ציטראט 27,35 עשויים לשפר מעט אות TUNEL נמוכה אם זמן חימום למינימום (5 דקות), אבל לפני הטיפול זה עשרds להפחית אות TUNEL אם חימום להארכה לתקופות ארוכות יותר (למשל 20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס). אחזור Antigen יגדיל autofluorescence רקע ותוצאות חיוביים שגויות, ובכך עשוי לשלול רווחים כלשהם ביחס אות לרעש מאות TUNEL מוגבר. מדידות אות TUNEL חייבת להיות מנורמלות או לאזור השריר הכולל ונרשמת או למספר הגרעינים לאזור ונרשמת. בגלל TUNEL מודד גרעינים אפופטוטיים, הנורמליזציה האידיאלית תהיה גרעינים כולל. עם זאת, גם בסעיפים דקים יחסית (10 מיקרומטר) שריר, myofibers והגרעינים הם כה רבים וצפוף כל כך מקרוב, שזה בלתי אפשרי לספור באופן אוטומטי גרעינים צבעוניים Hoechst על ידי אלגוריתמי thresholding והפרדת חלקיקים. ספירה ידנית היא גם מאוד עתיר עבודה ולא מדויקת. החלופה אפשרית היא לנרמל לסך אזור שריר. Assay TUNEL, בשימוש עם עיבוד רקמות מתאיםטכניקות ובקרות חיוביות ושליליות, היא שיטה מהירה יחסית, לשחזור, כמותי לאיתור נזק ל- DNA ומוות של תאים ברקמה. ניתן להשתמש בו כדי לאשר אפופטוזיס כמנגנון הפתולוגי, לזהות סוגים מושפעים תא, ועל מנת להעריך את יעילותם של טיפולים רפואיים. הליך זה יהיה בעל ערך לחוקרים בתחומי מחלות שלד שריר ופציעה, כוללים SMA, ALS, ניוון שרירים, מיופתיה מושרה רעלן, ולממש את הפיסיולוגיה.

dUTP Terminal transferase deoxynucleotidyl (TDT) תיוג ניק הסוף (TUNEL) הוא התהליך של שימוש באנזים TDT לצרף dUTP 3 &#39;מסתיים כפול ודנ&quot;א חד-גדילים שוברים 12,23. שיטת TUNEL לגילוי נזק אפופטוזיס ו- DNA דווחה לראשונה לפני למעלה מ -20 שנים על ידי et al גבריאלי. 1,12,24. זה מאז העריך ומותאם בהכנות רקמות שונות 7,23,27,40. TUNEL נעשה שימוש כדי ללמוד מוות מושרה איסכמיה תא של הנוירונים 6,14,29 וcardiomyocytes 43,44, מוות של תאים עצביים הפעלת יתר רעיל 30,31, וכסמן ביולוגי לטיפול בדלקת פרקים 39. כמו כן, שמש כגורם מנבא וסמן תאים סרטניים בסרטן בבני אדם שונים 2,3,15,32,37,38,42. שיטות אלטרנטיביות קיימות לנזק לדנ&quot;א וגילוי מוות של תאים, אבל יש להם אתגרים ואזהרות טכניים. סופג דרום עשוי לשמש לquantifנזק y DNA בlysates רקמות השלם 7,9-11, אך שיטה זו אינו מספקת רזולוציה ברמה התאית וקשה לכמת. Assay השביט הוא שיטה מבוססת תאים חלופי שדורשת חילוץ גרעינים השתמרו מתאי 4,20,28,36. למרות assay השביט עובד היטב בתאים מבודדים בתרבית, זה הרבה יותר קשה להכין גרעינים שלמים מרקמת שריר שלד 8,21. כמו עם כתם דרום, assay השביט אינו מספק מידע תא מסוג ספציפי מhomogenate רקמת שריר כולו. חלופה נוספת לשיטת TUNEL היא אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד DNA חד-גדילי 25,33,41 או נגד חלבונים המשתתפים במסלולי תגובת נזק ל- DNA ומוות של תאים (לדוגמא p53, H2AX, וcaspases) 13,17,22,40. שיטות המבוססים על נוגדנים אלה נדרשים אפיון יסודי של נוגדנים וספציפיות נוגדן מצוין להניב יחס אות ל- רקע גבוה. גם כאשר מפרטנוגדני ific קיימים, הם עשויים לדרוש denaturation של חלבון המטרה באמצעות הליכי אחזור אנטיגן 34,35. כפי שאנו דנים כאן, אחזור אנטיגן בתוצאות רקמת שריר גבוה בלתי מתקבל על הדעת autofluorescence. בניגוד לשיטות חלופיות, TUNEL משיג גילוי נזק ל- DNA עם אות גבוהה ורקע נמוך, סגוליות מעולה שיכול להיבדק עם פקדים פשוטים חיוביים ושליליים, חדירת רקמה טובה שאינו דורשים אחזור אנטיגן, ורזולוציה ברמה תאית. בנוסף, שיטת TUNEL לוקחת בערך 4 שעות כדי להשלים, ואילו בדרך כלל שיטות חלופיות דורשות incubations הלילה. אנחנו לומדים מוות של תאי שריר שלד במודל עכבר של ניוון שרירים (SMA) 10 שנוצר על ידי Hsieh-לי ועמיתים 16. כדי לכמת תאים אפופטוטיים בשריר, פיתחנו שיטה של ​​הכנת רקמה, צביעה, וquantitation שעובדת וחסונה על פני skele שונהקבוצות שרירים טל בנקודות זמן התפתחותיים שונות בעכברים. אנו משתמשים בערכת TUNEL תיוג זמינה מסחרי ותוכנת ניתוח תמונה זמינה מסחרי. יש לנו גם השתמשתי בהצלחה assay TUNEL בשילוב עם מכתים immunofluorescent בחוט השדרה 10. השיטות שתוארו כאן הן שימושיות לחוקרים שרוצים להעריך פתולוגיה רקמה, מנגנונים של מחלה, מנגנונים של הזדקנות, והתפתחותית (לפני ואחרי לידה) מוות של תאים בשריר שלד. טכניקת TUNEL שימושית במיוחד עבור מחקרים של נזק לדנ&quot;א ותיקון ומוות של תאים במערכות מודל שבו רק קבוצת משנה של תאים הוא רזולוציה רמה מושפעת וסלולרית היא הכרחית. וידאו זה מתאר לנתיחה, עיבוד רקמות, חתך, ותיוג TUNEL הקרינה מבוססת של שרירי שלד עכבר. הוא גם מתאר שיטה של ​​quantitation אות TUNEL חצי אוטומטי.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &amp;deg;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Embedding medium for cryosectioning.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &amp;mu;m sections may be used.</td></tr><tr><td>Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Slides from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 &amp;deg;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td></tr><tr><td>Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td></tr><tr><td>Vectabond tissue adhesion reagent</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescein &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; apoptosis detection kit</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease buffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>DNase-free water</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Water from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope with digital camera</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td></tr><tr><td>Vectashield antifade media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade media from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>glass coverslips, No.1 thickness</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.</td></tr></tbody></table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

עם כתמים מוצלחים, אות TUNEL החיובי צריכה להיות בהירה מספיק כדי לבודד מautofluorescence על ידי קביעת סף עוצמה. אובייקטי TUNEL החיוביים בהגדלה נמוכה עשויים להופיע ברים סדירים בהירים כמו בשרירי שלד (איור 1 א). עם זאת, בהגדלה גבוהה יותר, כמה חפצי TUNEL חיובי עם המורפולוגיה אפופטוטיים הקלאסית יש לשים לב, אם סוג המוות של תאים המעורבים הוא אפופטוזיס (איור 1). הבקרה החיובית (DNase הוסיף) צריכה להפגין אות TUNEL החיובי בשפע, מפוזרת באופן אחיד על פני כל הרקמות בסעיף (איור 1 ג). הבקרה השלילית (אנזים TDT הושמט מתגובה) אמורה להניב רקע בעצימות נמוכות ואות autofluorescent בלבד (1D איור). עור מספק שליטה פנימית חיובית בסעיפי רגל כולה, כפי שרקמה זו יש שיעור גבוה של אפופטוזיס הנורמלי (איור 1 א). דם אדוםתאים, עצם, ותאי האנדותל יכולים לתרום אות autofluorescent משמעותית (איור 2). מומלץ תמונה כל קטע בערוץ נפרד ללא תיוג ניאון כדי להבטיח autofluorescence כי הוא לא טועה לאיתות חיובית TUNEL. אות TUNEL חיובי אמיתית צריכה להיות בעוצמה גבוהה בהרבה מautofluorescence, כך שיכולים להיות המבודד על ידי קביעת סף עוצמת תמונה (איור 2 א, בשורה אמצעית). לחלופין, ערוץ autofluorescent עשוי להיות מופחת באופן דיגיטלי מערוץ TUNEL להניב אות TUNEL-חיובי (איור 2 א, שורה תחתונה). שיטת תיוג TUNEL המתוארת כאן נעשתה שימוש כדי לכמת מוות של תאי שריר שלד במודל של עכברים של SMA 10. תיוג TUNEL מצביע על עלייה במספר הפרופילים אפופטוטיים בשרירי רגליים מעכברי SMA ישנים 5 ימים, בהשוואה לבקרת littermate (איור 3 א). העלייה באפופטוזיס היאלכימות בשיטה שתוארה לעיל, מצביע על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית במספר קבוצות שרירים (איור 3). <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1: תיוג TUNEL נציג של שרירי hindlimb העכבר. () TUNEL שכותרת סעיף רוחבי של hindlimb העכבר מראה tibialis שרירים, שוקה, ועור קדמי. ת&quot;א - tibialis קדמי, FDL - longus digitorum המכופף, EDL - longus digitorum פושטי. ירוק - TUNEL, כחולים - גרעינים, אדומה - אות autofluorescent. קווים מקווקווים להתוות תחומים שרירים כדי לכמת. העור סמוך שרירי hindlimb מספק שליטה פנימית חיובית לתיוג TUNEL. בר סולם = 200 מיקרומטר. תמונות ההגדלה גבוהה (B) נציג זיהוי מבני TUNEL-החיובי (ירוק) בעוברי<html> יום 13 עכבר שרירי שלד כגרעינים אפופטוטיים. בר סולם = 10 מיקרומטר. A ו- B שונה מFayzullina ומרטין 2,014 10. (C) רוחבי סעיף של hindlimb עכבר TUNEL שכותרתו לאחר טיפול DNase לשמש כביקורת חיובית. רוב הגרעינים תיוג TUNEL בהיר. בר סולם = 50 מיקרומטר. (ד) סעיף רוחבי של אותו hindlimb העכבר כפי שמוצג בC (חצי סמוך לסעיף בC) TUNEL שכותרתו עם אנזים TDT הושמט כדי לשמש כביקורת שלילית. אין אות TUNEL חיובית בהירה; את האות הירוק רק הוא autofluorescence כפי שזוהה על ידי colocalization עם אות במסלול האדום. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2 &quot;fo: = תוכן רוחב&quot; &quot;src =&quot; 6in / קבצים / ftp_upload / 52,211 / &quot;width =&quot; 600 52211fig2highres.jpg &quot;/&gt; איור 2: autofluorescence רקמות יש לקחת בחשבון ולא נכלל בניתוח quantitation תיוג TUNEL. (א) סעיף עכבר hindlimb רוחבי עם תיוג TUNEL וautofluorescence: תמונה מקורית (שורה העליונה), אותה תמונה עם ספים מתואמים (בשורה אמצעית), ואותה תמונה עם autofluorescence ערוץ (אדום) שנגרע (בשורה תחתונה). קביעת ערכי סף מבטל תא האדום ביותר בדם וautofluorescence תא האנדותל, אך לא את חפץ הצביעה (ראש החץ, בשורה אמצעית). חיסור ערוץ גם מבטל את חפץ הצביעה (ראש החץ, בשורה תחתונה). ירוק - TUNEL, אדום - autofluorescence, כחולים - גרעינים. בר סולם = 100 מיקרומטר. מלבן אפור משרטט אזור המוגדל בB. (ב) תמונה בהגדלה גבוהה יותר של פנל autofluorescence אדום ב. תאי דם אדומים וכמה תאי האנדותל (חיצים), וTissautofluoresce ue חפץ צביעה (ראש חץ) בשני מסנני הקרינה האדומים וירוקים. בר סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52211/52211fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3: תיוג TUNEL תערוכות מוות של תאים בשריר השלד של עכברי SMA ילוד שרירי hindlimb תחתון מעכברי SMA ביום הלידה 5 תויגו על ידי שיטת TUNEL () תיוג TUNEL תערוכות פרופילים אפופטוטיים מרובים בקבוצות שרירים מרובות בעכבר SMA.. שריר (מימין) בהשוואה לשליטה littermate (משמאל). ירוק - TUNEL, כחולים - Hoechst (גרעינים), אדום - autofluorescence. קווים מקווקווים להתוות אזורי השריר לכמת. ת&quot;א - קדמי tibialis, FDL - חפירה מכופףlongus itorum, EDL - longus digitorum פושטי. ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר תיוג TUNEL. (ב) היה לכמת כאזור פיקסל הכולל של אות TUNEL המנורמל לאזור פיקסל הכולל של שרירים. אמצעי ± סטיות התקן מוצגים, n = 4 - 5 עכברים. משמעות סטטיסטי בין SMA ובקרה לכל קבוצת שרירים (אחד זנב מבחן t): * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001. נתון זה שונה מFayzullina ומרטין 2,014 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method at JoVE.com

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K Views.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Video: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Bioengineering

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Developmental Biology

זיהוי נזק לדנ"א בביציות של עכברים שנעצרו בשלב

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

מחבר זרקור: הבנת תגובת נזק לדנ"א בביציות יונקים ובעוברים טרום השרשה 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

יצירת פרופיל של סימני היסטון גנומיים במיובלסטים של עכברים באמצעות CUT&#38;Tag

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

מחבר זרקור: ניווט אתגרים וחידושים בחקר תאי גזע שריר

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.

שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&#38;Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

זיהוי וניתוח של נזק לדנ"א בשרירי שלד עכבר

Summary

Explore More Videos

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ"א

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר

שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר

שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית