This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

NOTA: Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud 26. El protocolo (MO13M391) fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins y Uso. 1. Neonatal ratón Sacrificio, disección, y Fijación <ol><li> Sacrificar un ratón neonatal por inhalación de CO2. </li><li> Inmediatamente cortar el miembro posterior por encima de la rodilla. Hasta días aproximadamente postnatal 7, los huesos de las piernas son lo suficientemente suaves para cortar con tijeras grandes de laboratorio o cuchilla afilada y posteriormente la sección en un criostato. </li><li> Coloque la extremidad posterior en 10 ml de hielo frío 4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un tubo de 15 ml. </li><li> Inmersión solucionar el miembro posterior en paraformaldehido durante 4-24 horas a 4 ° C. Tejido embrionario sólo requiere varias horass de fijación. <ol><li> Evite fijación más de 24 horas, ya que esto puede reducir la eficiencia TUNEL ensayo. </li></ol></li><li> Cryoprotect la extremidad posterior por inmersión en solución de sacarosa. <ol><li> Cambiar paraformaldehído al 10% de sacarosa en PBS en el mismo tubo de 15 ml, incubar durante la noche a 4 ° C. </li><li> Cambio a 30% de sacarosa en PBS, se incuban durante la noche a 4 ° C o hasta que los sumideros de los miembros posteriores a la parte inferior del tubo. Tissue se puede dejar en 30% de sacarosa durante un período más largo, siempre que la sacarosa ha sido filtrada de forma estéril. </li></ol></li></ol> 2. Tejido incrustación <ol><li> Llenar un molde de inclusión a medio camino marcado con un medio de inclusión. </li><li> Colocar las extremidades posteriores en la parte superior del medio de incrustación, con el lado del corte lo más cerca posible a una de las paredes del molde. Marcar la orientación de la extremidad posterior en el exterior del molde. <ol><li> Insertar varios miembros traseros y corte en el mismo bloque. Sin embargo, es importante asegurarse de que todo hindlimbs en el bloque están orientados paralelos entre sí para obtener secciones en búsqueda de los niveles a lo largo del eje de la extremidad. </li></ol></li><li> Cubra miembros posteriores con medio de incrustación. Si extremidades posteriores cambian mientras se vierte el medio, les re-orientar con unas pinzas de punta roma o un palillo de dientes. </li><li> Permitir medio de inclusión para infiltrarse en el tejido a temperatura ambiente durante al menos 15 min. </li><li> Coloque los moldes directamente en hielo seco o en isopentano en hielo seco para congelar un medio de inclusión. Asegúrese de mantener el nivel de moldes en todo momento y evitar el desplazamiento del tejido embebido. </li><li> Mantenga moldes congelados a -80 ° C hasta que esté listo para cortar, durante hasta varios meses. </li></ol> 3. cryosectioning Embedded extremidades <ol><li> Ajuste la temperatura cámara del criostato a -20 ° C, la temperatura del objeto a -18 ° C; ajustar la temperatura del objeto abajo según sea necesario. </li><li> Equilibrar el bloque de tejido dentro de la cámara del criostato durante al menos 30 min. Temp bloque correctabibliografía es crucial para la calidad de la sección. </li><li> Los cortes de secciones transversales con un espesor de 10 micras o menos. Secciones más gruesas no será totalmente penetradas por reactivos TUNEL. Utilice la placa estabilizadora, cuchillas, y el ángulo de la hoja (típicamente 5 °) recomendado para el criostato. </li><li> Recoger secciones Onto gelatin- o portaobjetos de vidrio recubiertos con Vectabond a temperatura ambiente. Coloque inmediatamente en una caja de portaobjetos en hielo seco. Mantenga la caja portaobjetos en un recipiente aparte con hielo seco colocado cerca del criostato alcance de la mano. <ol><li> Los cortes de secciones transversales en serie a través del eje largo de la extremidad, saltándose 100-200 micras. Recoge al menos 3 secciones adyacentes en cada nivel de serie. </li></ol></li></ol> 4. Ensayo de TUNEL en las patas traseras Secciones utilizando un kit disponible comercialmente (todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique) <ol><li> Descongele las diapositivas con secciones a temperatura ambiente y se seque durante la noche o el fin de semana. </li><li> Rehidratar secciones por immersing diapositivas en PBS durante 2 x 10 min en un tarro Coplin. Seque con un paño de laboratorio, la eliminación de la mayor cantidad de líquido alrededor de la sección de lo posible. </li><li> Secciones permeabilizar <ol><li> Utilice una no proteolítico, reactivo basado en saponina comercial o 0,5% de Tween 20 y 0,05% de Triton X100 en PBS. </li><li> Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad. Una cámara de humedad simple es una caja de puntas de pipeta vacía con tapa hermética, con suficiente agua añadida para cubrir el fondo de la caja. </li><li> Pipetear lo suficientemente reactivo sobre el portaobjetos para cubrir la sección (50 l es suficiente para extremidades de ratón neonatales). No pipetear directamente a la sección, como la agitación repetida puede causar la sección de levantar fuera de la diapositiva. </li><li> Con unas pinzas de punta roma, colocar un pequeño rectángulo de parafina en la parte superior de la sección para extenderse la gota de reactivo y cubrir completamente la sección. Si todas las burbujas se forman bajo la parafina, levante suavemente si fuera poco, en seco, y volver a aplicar. </li><li> Incubar los portaobjetos con permeabilización reactivo durante 1 hora en una cámara de humedad cubierta. Si las secciones comienzan a levantar de la diapositiva, el tiempo de permeabilización puede reducirse a 30 min. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS en una jarra Coplin 2 x 5 min. Los rectángulos parafilm deben flotar en la parte superior y luego se pueden sacar y desechar. </li><li> El uso de un paño de laboratorio, seque todo el líquido alrededor de las secciones como sea posible. </li></ol></li><li> Etiquetado ruptura de ADN mediada por TDT <ol><li> Siga las instrucciones del juego para hacer 1x tampón TdT etiquetado, pipeta etiquetado de amortiguación suficiente sobre el portaobjetos para cubrir sección de tejido (50 l es suficiente para que los miembros de ratones neonatales). Incubar en la cámara de humedad durante 5 min. Alternativamente, sumerja el portaobjetos en tampón TdT etiquetado en una jarra Coplin. </li><li> Siga las instrucciones del juego para hacer mezcla de marcaje TDT. El kit incluye el cobalto, magnesio, y cationes de manganeso; el catión de manganeso funciona bien en una variedad de tejidos, incluyendo el músculo esquelético, el sistema nervioso TISSUES, el hígado, la piel y los huesos. </li><li> Para un control positivo, añadir DNasa (etiquetado &quot;nucleasa&quot; en el kit) a la mezcla de marcaje TdT. Alternativamente, pre-tratar una sección de control positivo con DNasa en tampón de nucleasa durante 1 hora a 37 ° C, de acuerdo con las instrucciones del kit. Mantenga solución de DNasa y secciones tratado con DNasa lejos de otras secciones experimentales para prevenir la contaminación cruzada. </li><li> Para un control negativo, omita la enzima TdT de la mezcla de marcaje. </li><li> Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad de tampón TdT etiquetado de la diapositiva como sea posible. Mezcla de marcaje pipeta TDT en el portaobjetos (50 l por sección), cubrir con un nuevo rectángulo de parafina, y se incuba en la cámara de humedad a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Siga las instrucciones del juego para hacer tampón de detención 1x. Utilice un paño de laboratorio para eliminar mezcla de marcaje TdT de la diapositiva, y añadir tampón de parada 200-300 l para cubrir la sección de tejido, e incubar en la cámara de humedad durante 5 min. Al<html> ternatively, sumerja el portaobjetos en tampón de detención en una jarra Coplin. </li><li> Lavar el portaobjetos 2 x 2 min en PBS. Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad de PBS de la diapositiva como sea posible. </li></ol></li><li> Fluorescente etiquetado <ol><li> Siga las instrucciones del kit para preparar solución de etiquetado con fluoresceína para etiquetar dNTPs en ADN se rompe. Solución de la pipeta en el portaobjetos (50 l por sección), cubrir con un nuevo rectángulo de parafina, y se incuba en la cámara de humedad durante 20 min. </li><li> Lave los portaobjetos durante 2 minutos en PBS en una jarra Coplin. Utilice un paño de laboratorio para eliminar la mayor cantidad posible de PBS la diapositiva. </li><li> Diluir Hoechst 33258 tinción nuclear a 1 g / ml en PBS y pipeta sobre la corredera (100-200 l es suficiente para cubrir la sección). Incubar en la cámara de humedad durante 5 min. </li><li> Lavar 3x durante 5 min en PBS. </li><li> Cubreobjetos con Antifade medio de montaje de fluorescencia y sellar los bordes con esmalte de uñas. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Adquisición de Imagen Digital <ol><li> Adquirir imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia convencional con DAPI, FITC, y los filtros de Texas Red (o equivalente). Utilice un objetivo mayor aumento (20X o 40X) para verificar que el etiquetado tuvo éxito y los núcleos (intactas o fragmentados) se marcaron. Un objetivo de 10X es suficiente para la cuantificación de puntos lagrimales TUNEL-positiva. </li><li> Recoger imágenes de la tinción de Hoechst, la tinción TUNEL, y la señal de autofluorescent como tres canales de color falso separadas combinadas en una sola imagen. Si la etiqueta fluoróforo TUNEL es verde, señal de imagen autofluorescent en el filtro rojo, y viceversa. <ol><li> Mantenga todos los ajustes de imagen equivalente entre diapositivas para su posterior umbral y cuantificación. Para cada filtro, tiempos preestablecidos y exposición récord, ganancia y hurgar en la basura (sin hurgar en la basura es el mejor); no utilice exposición o ganancia ajustes automáticos. </li><li> Utilice ensayo y error para encontrar la exposición y los ajustes de ganancia que mejor capturar el rango de intendades en todas las diapositivas manchadas. Asegúrese de que no hay píxeles saturados en las imágenes obtenidas, ya que esta cuantificación sesgo voluntad. </li></ol></li><li> Tome fotografías del grupo muscular entera de interés. Esto puede requerir varias imágenes que se &quot;cosido&quot; juntos. </li></ol> Análisis 6. Imagen <ol><li> Utilice los programas de análisis de imágenes disponibles en el mercado para analizar imágenes digitales de la tinción de TUNEL. Análisis utilizando software comercial se muestra aquí. Alternativamente, el software ImageJ libre de NIH se puede utilizar para analizar la tinción de TUNEL. </li><li> Teñir una sección adyacente a la sección de TUNEL-teñidas con hematoxilina y eosina (H &amp; E) y tomar una imagen digital de sección completa con un microscopio de campo claro convencional. Utilice esta imagen H &amp; E en combinación con un atlas de anatomía 5,18,19 trazar las estructuras anatómicas que ser cuantificados. </li><li> Con el canal TUNEL apagado, trazar manualmente el contorno de la zona a ser cuantificado, utilizandoHoechst y canales de autofluorescencia de orientación. Convertir el área de trazado en una máscara (un conjunto de coordenadas de píxel seleccionado para ser analizados). </li><li> Encienda el canal TUNEL. Uso de la función de umbral de intensidad en el programa de análisis de imagen, ajustar el umbral más bajo para excluir toda señal de autofluorescencia. </li><li> Aplicar la misma configuración de umbral para todas las imágenes de la unidad de estudios. Convertir selecciones de umbral en máscaras. </li><li> Para cada imagen, combinar la máscara área muscular y la máscara de TUNEL. La nueva máscara combinación representará señal de TUNEL en el área del músculo trazado solamente. </li><li> Realizar cuantificación máscara de la máscara combinación para determinar el número de objetos y el área de la señal de TUNEL en el área del músculo trazado objeto. Realice este utilizando la función de analizador de partículas en ImageJ. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un método para detectar y analizar cuantitativamente la apoptosis asociada a daño del ADN en el músculo esquelético de ratón se describe. El procedimiento incluye la recolección del tejido, tinción TUNEL, la adquisición de imagen digital, y análisis de imagen. Se necesitan suministros y herramientas histológicos comunes, y un kit comercial especial TUNEL es necesario. Los grandes elementos esenciales de equipos necesarios son un criostato, microscopio de epifluorescencia con capacidad de imagen digital, y un s...

Terminal desoxinucleotidil transferasa (TdT) dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) es el proceso de utilización de la enzima TdT para adjuntar dUTP a extremos 3 &#39;de doble y de cadena sencilla de ADN rompe 12,23. El método TUNEL para la detección de la apoptosis y daño del ADN se informó por primera vez hace más de 20 años por Gavrieli et al. 1,12,24. Desde entonces se ha evaluado y optimizado en diferentes preparaciones de tejidos 7,23,27,40. TUNEL se ha utilizado para estudiar la isquemia inducida por la muerte celular de las neuronas 6,14,29 y 43,44 cardiomiocitos, la muerte celular neuronal excitotóxica 30,31, y como biomarcador en el tratamiento de la artritis 39. También se ha utilizado como un factor de pronóstico y marcador de células del tumor en varios cánceres humanos 2,3,15,32,37,38,42. Existen métodos alternativos para el daño del ADN y detección de muerte celular, pero tienen dificultades técnicas y advertencias. Transferencia de Southern se puede usar para quantifdaños en el ADN y en el tejido lisados ​​enteros 7,9-11, pero este método no proporciona resolución a nivel celular y es difícil de cuantificar. El ensayo cometa es un método basado en células alternativa que requiere la extracción de núcleos de células conservadas 4,20,28,36. Aunque el ensayo cometa funciona bien en células aisladas en cultivo, es mucho más difícil de preparar núcleos intactos a partir de tejido muscular esquelético 8,21. Al igual que con Southern blot, el ensayo cometa no proporciona información específica del tipo de célula de todo un homogeneizado de tejido muscular. Otra alternativa para el método TUNEL es inmunohistoquímica utilizando anticuerpos contra ADN monocatenario 25,33,41 o en contra de las proteínas que participan en la respuesta al daño del ADN y la muerte celular vías (por ejemplo, p53, H2AX, y caspasas) 13,17,22,40. Tales métodos basados ​​en anticuerpos requieren caracterización exhaustiva de anticuerpos y excelente especificidad del anticuerpo para producir una alta relación de señal a fondo. Incluso cuando specexisten anticuerpos IFIC, podrán exigir la desnaturalización de la proteína diana a través de los procedimientos de recuperación de antígeno 34,35. Mientras discutimos aquí, la recuperación de antígenos en los resultados de tejido muscular en inaceptablemente alta autofluorescencia. A diferencia de los métodos alternativos, TUNEL logra detectar el daño del ADN con una señal de alto y bajo fondo, excelente especificidad que se puede probar con simples controles positivos y negativos, buena penetración en los tejidos que no requiere la recuperación de antígenos, y la resolución a nivel celular. Además, el método TUNEL tarda unas 4 horas en completarse, mientras que los métodos alternativos suelen requerir incubaciones durante la noche. Estudiamos la muerte celular del músculo esquelético en un modelo de ratón de la atrofia muscular espinal (SMA) 10 que se ha generado por Hsieh-Li y sus colegas 16. Para cuantificar las células apoptóticas en el músculo, hemos desarrollado un método de preparación de tejido, tinción y cuantificación que funciona con firmeza a través de diferentes skeleTal grupos musculares en diferentes puntos de tiempo de desarrollo en ratones. Utilizamos un kit TUNEL etiquetado disponible en el mercado y el software de análisis de imágenes disponible en el mercado. También hemos usado con éxito el ensayo de TUNEL en combinación con la tinción de inmunofluorescencia en la médula espinal 10. Los métodos descritos aquí son útiles para los investigadores que desean evaluar la patología del tejido, mecanismos de la enfermedad, los mecanismos del envejecimiento y del desarrollo (pre y post-natal) la muerte celular en el músculo esquelético. La técnica de TUNEL es especialmente útil para los estudios de daño y reparación del ADN y la muerte celular en sistemas modelo en el que sólo un subconjunto de las células es de resolución a nivel celular afectada y es necesario. Este video describe la disección, el procesamiento de tejidos, seccionamiento, y TUNEL etiquetado basado en la fluorescencia del músculo esquelético del ratón. También se describe un método de semi-automatizado señal de cuantificación TUNEL.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &amp;deg;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Embedding medium for cryosectioning.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &amp;mu;m sections may be used.</td></tr><tr><td>Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Slides from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 &amp;deg;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td></tr><tr><td>Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td></tr><tr><td>Vectabond tissue adhesion reagent</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescein &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; apoptosis detection kit</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease buffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>DNase-free water</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Water from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope with digital camera</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td></tr><tr><td>Vectashield antifade media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade media from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>glass coverslips, No.1 thickness</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.</td></tr></tbody></table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Con la tinción de éxito, señal de TUNEL-positivas debe ser lo suficientemente brillante como para aislarlo de autofluorescencia estableciendo umbrales de intensidad. Objetos TUNEL-positivas a bajo aumento pueden aparecer fragmentos irregulares brillantes en el músculo esquelético (Figura 1A). Sin embargo, a mayor aumento, se deben observar algunos objetos TUNEL-positivas con la morfología apoptótica clásico, si el tipo de muerte celular en cuestión es la apoptosis (Figura 1B). ...

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K vistas.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

Video: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

En la Asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del ADN

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Investigación

Bioingeniería

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Biología del Desarrollo

Identificación del daño en el ADN en ovocitos de ratones con profase detenida

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor destacado: Comprensión de la respuesta al daño del ADN en ovocitos de mamíferos y embriones preimplantacionales 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Biología

Perfil de marcas genómicas de histonas en mioblastos de ratón mediante CUT&#38;Tag

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

Autor destacado: Navegando por los desafíos y las innovaciones en los estudios de células madre musculares

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.

Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&#38;Tag) en la investigación de mioblastos de ratón

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético

Resumen

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Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) en la investigación de mioblastos de ratón

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Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos