This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

참고 :이 프로토콜에 설명 된 모든 동물 절차가 건강 (26)의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 프로토콜 (MO13M391)는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 신생아 마우스 희생, 해부 및 고정 <ol><li> CO 2 흡입 신생아 마우스를 희생. </li><li> 바로 무릎 위의 사지를 잘라. 약 출생 후 7 일까지, 다리 뼈는 저온 유지 장치에 연속적으로 섹션에 큰 실험실 가위 날카로운 칼날을 극복 할만큼 부드럽고합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 인산 완충 식염수 (PBS)에 차가운 얼음 4 % 파라 포름 알데히드 10 ㎖의 뒷다리를 놓습니다. </li><li> 집중은 4 ℃에서 4-24 시간 동안 파라 포름 알데히드의 사지를 고정합니다. 배아 조직은 여러 시간이 필요합니다고정의의. <ol><li> 이 TUNEL 분석 효율을 감소시킬 수 있으므로 24 시간보다 더 오래 고정을하지 마십시오. </li></ol></li><li> 자당 용액에 침지하여 뒷다리를 Cryoprotect. <ol><li> 같은 15 ML 튜브에 PBS의 10 % 자당에 파라 포름 알데히드를 변경, 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. </li><li> PBS 30 % 수크로오스로 변경, 4 ° C에서 또는 튜브의 바닥 뒷다리 싱크까지 밤새 배양한다. 조직을 수크로오스 멸균 여과되었음을 제공, 긴 기간 동안 30 % 수크로오스에 남아있을 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 포함] <ol><li> 매체를 포함와 레이블이 포함 금형 절반 방법을 채 웁니다. </li><li> 몰드의 한쪽 벽에 최대한 가깝게 잘라면이 매립 매체 위에 배치 뒷다리. 금형의 외부에 뒷다리의 방향을 표시합니다. <ol><li> 여러 뒷다리를 포함하고 같은 블록으로 잘라. 그러나, 모든 힌을 확인하는 것이 중요하다블록 dlimbs은 사지의 축 방향과 일치하는 수준에서 섹션을 얻기 위해 서로에 대해 평행하게 배향된다. </li></ol></li><li> 매체를 포함와 뒷다리를 커버. 매체를 붓는 동안 뒷다리가 이동하는 경우, 무딘 팁 집게 또는 이쑤시개로 다시 방향. </li><li> 적어도 15 분 동안 실온에서 조직에 침투되는 매립 매체 허용. </li><li> 직접 드라이 아이스 또는 드라이 아이스에 이소 펜탄에 넣어 금형은 매체를 포함 동결. 항상 금형 수준을 유지하고 내장 조직의 이동을 방지해야합니다. </li><li> 몇 달까지 들어 잘라 준비까지 -80 ℃에서 냉동 금형을 보관하십시오. </li></ol> 3. 냉동 절편 임베디드 사지 <ol><li> -20 ° C로 설정 저온 유지 챔버 온도, -18 ° C에서 객체 온도; 필요에 따라 개체를 아래로 온도를 조절합니다. </li><li> 적어도 30 분 동안 저온 유지 챔버 내부 조직 블록을 평형. 올바른 블록 온도erature 섹션의 품질에 대한 중요합니다. </li><li> 10 ㎛ 이하의 두께로 잘라 횡단면도. 두꺼운 섹션은 완전히 TUNEL 시약에 의해 침투되지 않습니다. 안티 - 롤 플레이트, 블레이드, 블레이드 각도를 사용하여 (일반적으로 5 °)는 저온 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 실온에서 젤라틴 또는 vectabond 코팅 된 유리 슬라이드 위에 섹션을 수집합니다. 드라이 아이스에서 슬라이드 상자에 바로 놓습니다. 팔의 손이 닿는 곳에 저온 유지 장치 부근에 드라이 아이스와 별도의 용기에 슬라이드 상자를 보관하십시오. <ol><li> 100 ~ 200 μm의 생략, 사지의 장축을 통해 가로 시리얼 부분을 잘라. 각 시리얼 수준에서 최소 3 인접한 섹션을 수집합니다. </li></ol></li></ol> 상업적으로 사용 가능한 키트를 사용하여 뒷다리 섹션 4. TUNEL 분석 (실온에서 모든 단계를 언급하지 않는) <ol><li> 실내 온도와 건조 야간 또는 주말 섹션이 슬라이드를 해동. </li><li> immersin로 섹션을 재수코 플린 항아리에 2 × 10 분 동안 PBS에서 g 슬라이드. 실험실 건조 가능한 부분 주위에 많은 액체를 제거 닦아냅니다. </li><li> Permeabilize 하시려면 섹션 <ol><li> 비 단백질 분해, 사포닌 기반 상용 시약 0.5 % 트윈 20 0.05 % PBS에 트리톤 X100를 사용합니다. </li><li> 습도 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 충분한 물이 상자의 바닥을 추가로 포함하도록 간단한 습도 챔버는 뚜껑이 꽉 빈 피펫 팁 상자이다. </li><li> 섹션을 충당하기 위해 슬라이드에 피펫 충분한 시약 (50 μl의 신생아 마우스 사지에 충분하다). 반복 교반 슬라이드를 떠 섹션의 원인이 될 수 섹션에 직접 피펫하지 마십시오. </li><li> 무딘 팁 집게 사용 시약의 드롭을 확산 섹션의 상단에 파라 필름의 작은 사각형을 배치하고 완전히 섹션 커버. 모든 거품이 파라 필름에서 형성되면, 부드럽게 건조, 들어 올릴 및 다시 적용합니다. </li><li> permeabili와 슬라이드를 품어덮여 습도 챔버에서 1 시간 동안 아네트 시약. 섹션 슬라이드에서 떠 시작하면, 투과성으로 시간은 30 분으로 감소 할 수있다. </li><li> 코 플린 항아리 2 × 5 분에 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 파라 필름 사각형 상단에 떠 있어야하고 제거 및 폐기 될 수있다. </li><li> 실험실을 사용하면, 가능한 한 섹션 주위에 많은 액체를 닦아 건조. </li></ol></li><li> TdT에 매개 DNA 휴식 라벨링 <ol><li> (50 μL 신생아 마우스 사지에 충분하다) 조직 부분을 충당하기 위해 슬라이드에 1 배 가열 치사 라벨 버퍼, 피펫 충분히 라벨 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 또한, 코 플린 항아리에 가열 치사 라벨 버퍼에 슬라이드를 담가. </li><li> 가열 치사 라벨 믹스를 만들기 위해 키트 지침을 따르십시오. 키트는 코발트, 마그네슘, 망간 및 양이온을 포함한다; 망간 양이온은 골격 근육, 신경계, 담배 마는 포함, 다양한 조직에 잘 작동합니다UE들, 간, 피부, 뼈. </li><li> 양성 대조군의 경우, 가열 치사 라벨 믹스의 DNase (키트에 표시된 &quot;클레아 제&quot;)를 추가합니다. 대안 적으로, 키트 설명서에 따라, 37 ° C에서 1 시간 동안 클레아 버퍼와 DNase를 포지티브 제어부 미리 치료. 교차 오염을 방지하기 위해 멀리 다른 실험 섹션에서 DNase의 솔루션과 DNase를 처리 섹션을 유지합니다. </li><li> 음성 대조군의 경우, 라벨 믹스에서 가열 치사 효소를 생략합니다. </li><li> 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 가열 치사 라벨 버퍼를 제거 와이프 ​​사용합니다. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 가열 치사 라벨 믹스, 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 1 시간 동안 37 ° C에서 습도 챔버에 품어. </li><li> 1X 정지 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 슬라이드에서 가열 치사 라벨링 믹스를 닦아 제거하는 랩을 사용하여 조직 절편을 커버하도록 200-300 μL 정지 완충액을 추가 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 알<html> 대체적으로, 코 플린 항아리에 정지 버퍼에 슬라이드를 담가. </li><li> PBS에서 슬라이드 2 × 2 분을 씻으십시오. 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용. </li></ol></li><li> 형광 라벨 <ol><li> DNA 나누기에 dNTPs를 레이블을 형광 라벨 용액을 제조 키트 지침을 따르십시오. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 솔루션은 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 20 분 동안 습도 챔버에 품어. </li><li> 코 플린 항아리에 PBS에서 2 분 동안 세척 슬라이드. 연구소는 슬라이드에서 가능한 한 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용. </li><li> 슬라이드에 1 μg의의 /의 PBS에서 ml의 피펫에 훽스트 33258 핵 얼룩을 희석 (100 ~ 200 μl의 부분을 커버하기에 충분하다). 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. </li><li> PBS에서 5 분 동안 배를 씻으십시오. </li><li> antifade 형광 장착 미디어 커버 슬립과 매니큐어와 가장자리를 밀봉. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. 디지털 화상 취득 <ol><li> DAPI, FITC, 텍사스 레드 필터 (또는 동급)와 기존의 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 라벨이 성공과 핵 (손상 또는 조각)가 표시되었는지 확인하기 위해 높은 배율의 목표 (20 배 또는 40 배)를 사용합니다. 10X 목적은 TUNEL 양성 puncta의 정량에 충분하다. </li><li> 하나의 이미지로 결합 별도의 세 가지 거짓 컬러 채널로 훽스트 염색, TUNEL 염색 및 autofluorescent 신호의 이미지를 수집합니다. TUNEL의 형광 라벨과 적색 필터, 이미지 autofluorescent 신호, 녹색이면 그 반대로. <ol><li> 이후 임계 값 및 정량 슬라이드 사이에 해당하는 모든 이미지 설정을 유지합니다. 각 필터, 사전 설정 및 녹화 노출 시간, 게인 및 비닝 (binning)을 위해 (더 비닝 (binning)는 최고의 없음); 자동 노출 또는 게인 설정을 사용하지 마십시오. </li><li> 가장 INTEN의 범위를 캡처 노출 및 게인 설정을 찾기 위해 시행 착오를 사용하여모든 스테인드 슬라이드에 걸쳐 잇고. 획득 된 이미지에는 포화 픽셀이 의지 바이어스 정량으로,이 없는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 관심의 전체 근육 그룹의 이미지를 가져 가라. 이것은 함께 &quot;스티치&quot;할 여러 이미지를 필요로 할 수있다. </li></ol> 6. 이미지 분석 <ol><li> TUNEL 염색의 디지털 이미지를 분석하는 상용 이미지 분석 프로그램을 사용합니다. 상용 소프트웨어를 사용하여 분석 여기에 표시됩니다. 대안 적으로, NIH로부터 자유 소프트웨어가 ImageJ에 TUNEL 염색을 분석하는데 사용될 수있다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)와 TUNEL 염색 섹션에 인접한 섹션을 얼룩과 기존의 시야 현미경으로 전체 섹션 디지털 이미지를 촬영합니다. 정량화 할 수있는 해부학 적 구조를 추적 해부학 아틀라스 5,18,19와 조합이 H &amp; E 이미지를 사용합니다. </li><li> TUNEL 채널을 끈 상태에서 수동으로 사용하여 정량 영역의 윤곽을 추적훽스트 (Hoechst)와 안내자가 형광 채널. 마스크로 추적 영역 변환 (선택한 화소의 세트를 분석 할 좌표). </li><li> TUNEL 채널을 켭니다. 이미지 분석 프로그램 기능을 임계 화 강도를 사용하여, 모든 자기 형광 신호를 제외하는 임계 값을 낮게 설정한다. </li><li> 연구 세트의 모든 이미지에 동일한 임계 값 설정을 적용합니다. 마스크로 역치 선택을 변환합니다. </li><li> 예를 들어, 각각의 이미지가 근육 영역 마스크와 마스크 TUNEL을 결합한다. 새로운 조합 마스크는 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호를 나타냅니다. </li><li> 객체의 수를 확인하고 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호의 영역을 객체로 조합 마스크에 마스크 정량을 수행합니다. ImageJ에있는 입자 분석기 기능을 사용하여이 작업을 수행합니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

방법은 감지하고 정량적으로 설명 마우스 골격 근육에서 DNA 손상 관련 세포 사멸을 분석합니다. 절차는 조직 수확, TUNEL 염색, 디지털 이미지 수집 및 이미지 분석을 포함한다. 일반적인 조직 학적 용품 및 도구가 필요하고, 특수 TUNEL 상업용 키트가 필요하다. 필요한 필수적인 큰 장비 항목은 저온 유지 장치, 디지털 영상 능력 epifluorescent 현미경 및 이미지 분석을위한 컴퓨터 시스템이다. <p class...

터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 TDT () 된 dUTP 닉 엔드 라벨 (TUNEL)이 dUTP를 3를 연결합니다 가열 치사 효소를 사용하는 과정은 &#39;단일 및 이중 가닥 DNA가 12, 23 나누기 끝입니다. 세포 사멸 및 DNA 손상의 검출을위한 TUNEL 방법은 첫째 Gavrieli 등. 1,12,24 20 년 전에보고되었다. 그것은 이후 평가와 다른 조직 준비 7,23,27,40에 최적화되었습니다. TUNEL 뉴런 6,14,29 및 43, 44 심근 허혈에 의한 세포 죽음, 흥분성 신경 세포 사멸 (30, 31)을 연구하는 데 사용하고, 관절염 치료 (39)의 바이오 마커로하고있다. 또한, 다양한 인간 암에서 2,3,15,32,37,38,42 예후 인자 및 종양 세포 마커로 사용되었다. 다른 방법은 DNA 손상 및 세포 사멸 검출을 위해 존재하지만, 그들은 기술적 인 문제와주의 사항이 있습니다. 서던 블랏 quantif하는데 사용될 수있다Y DNA 전체 조직 해물 7,9-11 손상,하지만이 방법은 세포 수준의 해상도를 제공하고 정량화하기 어려운되지 않습니다. 혜성 분석은 세포 4,20,28,36에서 보존 핵을 추출 필요로하는 다른 셀 기반 방법입니다. 혜성 분석법 격리 배양 세포에서 잘 작동하지만, 골격근 조직 8,21에서 그대로 핵을 제조하는 것이 훨씬 더 곤란하다. 서던 블랏과 마찬가지로 혜성 분석은 전체의 근육 조직 파쇄 액으로부터 세포 유형 특정 정보를 제공하지 않는다. TUNEL 방법에 대한 또 다른 대안은 단일 가닥 DNA 25,33,41에 대해 또는 DNA 손상 반응과 세포 사멸 경로에 (예를 들어 p53을, H2AX, 그리고 카스파) 13,17,22,40 참여 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학이다. 이러한 항체 - 기반 방법은 높은 신호 대 백그라운드 비율을 수득 항체의 철저한 특성이 우수한 항체 특이성을 필요로한다. 경우에도 사양IFIC 항체들은 항원 검색 절차 (34, 35)을 통해 목적 단백질의 변성을 요구할 수있는. 우리가 여기에서 토론 할 때, 허용 할 수 없을 정도로 높은자가 형광의 근육 조직 결과에 항원 검색. 다른 방법과 달리, TUNEL 간단 양성 및 음성 대조군, 우수한 조직 침투 항원 검색을 필요로하지 않으며, 세포 수준의 해상도로 테스트 될 수있는 높은 신호, 낮은 백그라운드, 우수한 특이성 DNA 손상 검출을 달성한다. 다른 방법은 전형적으로 밤새 항온 처리를 요구하는 반면, 또한, TUNEL 방법은 완료하는 데 약 4 시간이 걸린다. 우리는 리튬 - Hsieh의 동료 (16)에 의해 생성 된 척수 근위축증 (SMA) (10)의 마우스 모델에서 골격근 세포 사멸 연구. 근육 세포 사멸을 정량화하기 위해, 우리는 다른 skele 걸쳐 견고 작동 티슈 제조, 염색 및 정량하는 방법을 개발했다마우스에서 발달 상이한 시점에서 탈 근육 그룹. 우리는 시중에서 판매하는 TUNEL 라벨링 키트 및 상용 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 또한 성공적으로 척수 (10)에 면역 형광 염색법과 함께 TUNEL 분석을 사용했다. 여기에 설명 된 방법은 골격 근육에서 조직 병리, 질병의 메커니즘, 노화의 메커니즘과 발달 (사전 및 산후) 세포 사멸을 평가하려는 연구자 유용합니다. TUNEL 기술은 세포의 서브 세트 만이 영향을 세포 수준의 해상도가 필요하다 모델 시스템에서의 DNA 손상과 수리 및 세포 사멸 연구에 특히 유용하다. 이 동영상은 해부, 조직 처리, 절편, 마우스 골격 근육의 형광 기반의 TUNEL 라벨을 설명합니다. 또한 반자동 TUNEL 신호 정량 방법을 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:460px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19202</td>
			<td style="width:460px;">For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &#176;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:460px;">Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O.C.T. compound&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td>Embedding medium for cryosectioning.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:121px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM 3050S</td>
			<td style="width:460px;">A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &#956;m sections may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td>Slides from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-9391</td>
			<td style="width:460px;">Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 &#176;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">243361</td>
			<td style="width:460px;">Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectabond tissue adhesion reagent</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SP-1800</td>
			<td style="width:460px;">Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease buffer</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">780</td>
			<td style="width:460px;">Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase-free water</td>
			<td style="width:121px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">351-029-131</td>
			<td>Water from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">94403</td>
			<td style="width:460px;">Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:121px;">multiple</td>
			<td style="width:119px;">807</td>
			<td style="width:460px;">Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent microscope with digital camera</td>
			<td style="width:121px;">&#160;--</td>
			<td style="width:119px;">&#160;--</td>
			<td style="width:460px;">Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield antifade media</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td>Antifade media from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, No.1 thickness</td>
			<td style="width:121px;">Brain Research Labs</td>
			<td style="width:119px;">2222-1</td>
			<td style="width:460px;">Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22x22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">114-8</td>
			<td style="width:460px;">Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

성공적인 조직 화학 염색, TUNEL 양성 신호 강도 임계치를 설정하여자가 형광 물질로부터 격리 할만큼 밝은해야한다. 낮은 배율에서 TUNEL 양성 개체는 골격 근육 (그림 1A)에 밝은 불규칙한 조각을 나타날 수 있습니다. 관련된 세포 사멸 유형은 세포 사멸 (도 1b) 인 경우에는 고배율, 고전 사멸 형태 일부 TUNEL 양성 개체 관찰되어야한다. 양성 대조군 (DNase를 추가) 섹션 (...

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K 조회수.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

비디오: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

연구

생물학

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

골격근에서 Progenitors의 정화

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

쥐 절차<em&gt; 현장에서</em&gt; 골격근 수축 등록

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석

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