This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

注：このプロトコルで説明されているすべての動物手順は、健康26の国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って行った。プロトコル（MO13M391）はジョンズホプキンス大学動物実験委員会によって承認された。 1.新生児マウスの犠牲、解剖、および固定<ol><li> CO 2吸入によって新生児マウスを生け贄に捧げる。 </li><li>すぐに膝上後肢を切断。約生後7日目までは、足の骨は、大きな実験室のハサミや鋭利な刃でカットスルーとクライオスタットで、その後のセクションにするのに十分なソフトです。 </li><li> 15mlチューブ中でリン酸緩衝食塩水（PBS）中の氷冷4％パラホルムアルデヒドを10mlの後肢を置く。 </li><li>浸漬は4℃で4-24時間、ホルムアルデヒド中で後肢を修正。胚組織は数時間を必要とする固定のS。 <ol><li>これはTUNELアッセイの効率を低下させる可能性がある、24時間よりも長い固定をしないでください。 </li></ol></li><li>ショ糖溶液中に浸漬することにより後肢をCryoprotect。 <ol><li>同一の15mlチューブにPBS中の10％スクロースにパラホルムアルデヒドを変更し、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li> PBS中30％のショ糖への変更は、4℃で、またはチューブの底に後肢沈むまで、一晩インキュベートする。組織は、スクロースに滅菌濾過されていることを条件とする、より長い期間、30％スクロース中に残してもよい。 </li></ol></li></ol> 2.組織の埋め込み<ol><li>メディアを埋め込むで標識埋め込むの金型ハーフウェイを埋める。 </li><li>金型の一方の壁にできるだけ近いカット側で、包埋媒体の上に後肢を置きます。金型の外側に後肢の向きをマークします。 <ol><li>いくつかの後肢を埋め込むと同じブロックにカット。しかし、それはすべてのホアヒンことを確認することが重要ですブロックdlimbsは肢の軸に沿ってレベルマッチングにセクションを取得するために、互いに平行に配向されている。 </li></ol></li><li>メディアを埋め込むと後肢をカバーしています。メディアを注ぎながら、後肢がずれた場合は、鈍先端が鉗子や爪楊枝で再配向する。 </li><li>少なくとも15分間室温で組織に浸潤する媒体を埋め込むことができます。 </li><li>メディアを埋め込む凍結し、ドライアイス上で直接ドライアイス上またはイソペンタン中で金型を置きます。すべての回での金型のレベルを維持し、埋め込まれた組織の移動を避けるようにしてください。 </li><li>数ヶ月までのため、カットする直前まで、-80℃で凍結した金型を保管してください。 </li></ol> 3.凍結切片組み込み手足<ol><li> -20°Cに設定され、クライオスタットチャンバ温度、-18℃の物体温度。必要に応じて、オブジェクトの温度を下に調整します。 </li><li>少なくとも30分間、クライオスタットチャンバ内の組織ブロックを平衡化する。正しいブロックの一時eratureは、セクションの品質のために重要である。 </li><li> 10μm以下の厚さで横断切片をカットします。厚い部分は、完全にTUNEL試薬によって貫通されることはありません。アンチロールプレート、ブレード、およびブレードの角度を使用します（通常は5°）はクライオスタットにお勧め。 </li><li>室温で、ゼラチンまたはvectabond被覆ガラススライド上にセクションを収集します。ドライアイス上でスライドボックスにすぐに配置します。腕の手の届くところにクライオスタットの近くに置かドライアイスで別々の容器にスライドボックスに保管してください。 <ol><li> 100〜200ミクロンをスキップし、手足の長い軸を横断連続切片をカットします。各シリアルレベルで少なくとも3隣接するセクションを収集します。 </li></ol></li></ol>市販のキットを用い後肢セクション4. TUNELアッセイ（室温でのすべてのステップ記述のない限り） <ol><li>室温と一晩乾燥するか、週末のセクションでスライドを解凍する。 </li><li> immersinによってセクションを再水和gがコプリンジャー中で2×10分間、PBS中でスライドする。ラボの乾燥は、可能な限りセクションの周りにできるだけ多くの液体を除去し、拭く。 </li><li>透過性のセクション<ol><li>非タンパク質分解、サポニンベースの市販の試薬または0.5％のTween20、PBS中の0.05％トリトンX100のいずれかを使用してください。 </li><li>湿度チャンバ内にスライドを置きます。シンプルな湿度室は、箱の底をカバーするために追加されただけで十分な水との緊密な蓋付きの空のピペットチップボックス、です。 </li><li>セクションをカバーするためにスライド上のピペット十分な試薬（50μL、新生児マウスの手足で十分である）。繰り返し攪拌がスライドをリフトオフするセクションの原因となり、セクションに直接ピペットないでください。 </li><li>鈍先端が鉗子を使用して、試薬の滴を広げ、完全にセクションをカバーする部分の上にパラフィルムの小さな長方形を配置します。すべての泡がパラフィルムの下で形成した場合、軽く乾いた、それを持ち上げて、再適用します。 </li><li> permeabiliでスライドをインキュベートカバーされた湿度室で1時間zation試薬。切片をスライドから持ち上げ始めた場合、透過処理時間が30分に短縮することができる。 </li><li>コプリンジャー2×5分でPBSでスライドを洗浄します。パラフィルムの長方形は、トップにフロートする必要があり、その後除去し、廃棄することができます。 </li><li>ラボを使用すると、可能な限りのセクションの周りにできるだけ多くの液体を拭いて乾かしてください。 </li></ol></li><li> TdTを媒介DNAブレークラベリング<ol><li> （50μlを新生児マウスの四肢のために十分である）組織切片をカバーするためにスライド上に1倍のTdTラベリングバッファー、ピペット十分なラベリングバッファを作るために、キットの指示に従ってください。 5分間の湿度チャンバー内でインキュベートする。また、コプリンジャーでのTdT標識バッファーでスライドを浸す。 </li><li>のTdT標識ミックスを作るために、キットの指示に従ってください。キットは、コバルト、マグネシウム、マンガンカチオンを含み、マンガンカチオンは、骨格筋、神経系のTISSを含め、様々な組織に適していますUEは、肝臓、皮膚、および骨。 </li><li>陽性対照のために、TdTをラベリングミックスにDNアーゼ（キット中の標識「ヌクレアーゼ」）を追加します。あるいは、キットの使用説明書に従って、37℃で1時間ヌクレアーゼ緩衝液中のDNアーゼポジティブコントロールセクションを事前処置する。交差汚染を防ぐために離れて他の実験的な部分からのDNase溶液とDNase処理セクションを保管してください。 </li><li>ネガティブコントロールのために、ラベリングミックスからTdT酵素を省略します。 </li><li>ラボを使用して、可能な限りスライドからできるだけ多くのTdTラベリング緩衝液を除去するために拭く。スライド（セクションあたり50μl）上にピペットのTdT標識ミックスは、パラフィルムの新しい長方形でカバーし、1時間、37℃で湿度チャンバ内でインキュベートする。 </li><li> 1X停止緩衝液を作るために、キットの指示に従ってください。スライドからのTdT標識ミックスを除去するワイプ実験室を使用して、組織切片をカバーするために200〜300μlの停止バッファーを添加し、5分間加湿チャンバー内でインキュベートする。アル<html> ternatively、コプリンジャーで停止緩衝液でスライドを浸す。 </li><li> PBSにスライド2×2分を洗ってください。ラボを使用して、可能な限りスライドからできるだけ多くのPBSを除去して拭いてください。 </li></ol></li><li>蛍光標識<ol><li> DNA破壊でdNTPを標識するためにフルオレセイン標識溶液を準備し、キットの指示に従ってください。スライド（セクションあたり50μl）上にピペット溶液は、パラフィルムの新しい長方形でカバーし、そして20分間湿度チャンバー内でインキュベートする。 </li><li>コプリンジャーでPBS中で2分間洗浄スライド。ラボを使用して、スライドからできるだけ多くのPBSを除去して拭いてください。 </li><li> （100〜200μlをセクションをカバーするのに十分である）スライド上にPBSおよびピペット中1μg/ mlにヘキスト33258核染色を希釈する。 5分間の湿度チャンバー内でインキュベートする。 </li><li> PBSで5分間3回洗浄。 </li><li>退色蛍光マウンティングメディアでカバースリップし、マニキュアとの縁をシールする。 </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5。デジタル画像取得<ol><li> DAPI、FITC、テキサスレッドフィルター（または同等品）と、従来の蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。ラベル付けが成功したと核（完全なまたは断片化）が標識したことを確認するために、より高い倍率の対物レンズ（20Xまたは40X）を使用します。 10倍の目的は、TUNEL陽性涙点の定量のために十分である。 </li><li>一つの画像に合わせて3つの別々の偽色チャネルとしてヘキスト染色、TUNEL染色、及び自家蛍光信号の画像を収集します。 TUNELのフルオロフォア標識が緑の場合、赤フィルタの画像自家蛍光信号、およびその逆。 <ol><li>その後の閾値化と定量化のためのスライドの間の等価すべての画像の設定をしてください。各フィルタ、プリセットとレコード露光時間、ゲイン、ビニングのために（無ビニングがベストではない）;自動露出またはゲイン設定を使用しないでください。 </li><li>最高のINTENの範囲をキャプチャします露出とゲイン設定を見つけるために試行錯誤を使用してくださいすべての染色スライド全体でsities。この意志バイアス定量として、取得された画像には飽和画素が存在しないことを確認してください。 </li></ol></li><li>関心の全体の筋肉群の画像を取る。これは一緒に &quot;ステッチ&quot;される複数の画像が必要な場合があります。 </li></ol> 6.画像解析<ol><li> TUNEL染色のデジタル画像を分析するために、市販の画像解析プログラムを使用する。商用ソフトウェアを用いた解析は、ここに示されています。あるいは、NIHからのフリーソフトウェアImageJがTUNEL染色を分析することができる。 </li><li>ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）とTUNEL染色切片に隣接する部分を染色し、従来の明視野顕微鏡でフルセクションデジタル画像を取る。定量化する解剖学的構造をトレースする解剖学アトラス5,18,19と組み合わせてこのH＆E画像を使用してください。 </li><li> TUNELチャネルは使用し、定量化する領域の輪郭をトレースし、手動でオフにしヘキストと指導のための自己蛍光チャンネル。マスク内にトレース領域に変換する（選択された画素の集合が、分析されるべき座標）。 </li><li> TUNELチャネルをオンにします。画像解析プログラムにおける強度閾値関数を使用して、すべての自己蛍光信号を除外するために低い閾値を設定する。 </li><li>研究·セット内のすべての画像に同じしきい値設定を適用します。マスクに閾値化の選択を変換します。 </li><li>各画像には、筋肉の領域マスクとTUNELマスクを組み合わせる。新しい組み合わせのマスクのみトレース筋肉領域内TUNEL信号を表す。 </li><li>トレース筋肉領域内TUNEL信号のオブジェクトとオブジェクト領域の数を決定するために組み合わせてマスク上にマスク定量を行う。 ImageJの中の粒子分析機能を使用してこれを実行します。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

マウス骨格筋におけるDNA損傷に関連するアポトーシスを検出し、定量的に分析する方法について説明する。手順は、組織採取、TUNEL染色、デジタル画像取得および画像解析を含む。一般的な組織学的部品やツールが必要であり、特別な商業TUNELキットが必要です。必要とされる必須の大きな装置品目はクライオスタット、デジタル画像機能を有する落射蛍光顕微鏡および画像解析のためのコン...

ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）dUTPニック末端標識（TUNEL）は12,23を破る二本鎖及び一本鎖DNAの3 &#39;末端へのdUTPを付加するTdT酵素を使用するプロセスである。アポトーシスとDNA損傷を検出するためのTUNEL法は、最初にGavrieli らによって20年以上前に報告された。1,12,24。それ以来異なる組織標本7,23,27,40で評価し、最適化されています。 TUNELは、虚血誘導性のニューロン6,14,29及び心筋43,44の細胞死、興奮毒性神経細胞死30,31、および関節炎の治療39においてバイオマーカーとしての研究に使用されている。また、様々なヒト癌において予後因子および腫瘍細胞マーカーとして使用されてきた2,3,15,32,37,38,42。 代替的な方法は、DNA損傷および細胞死の検出のために存在するが、それらは技術的な課題と警告している。サザンブロッティングはquantifするために使用することができるYのDNA全組織溶解物における損傷7,9-11が、この方法は、細胞のレベルの分解能を提供し、定量化が困難であるされません。コメットアッセイは、細胞4,20,28,36から保存核を抽出する必要が別の細胞に基づいた方法である。コメットアッセイは、培養された単離された細胞にうまく機能するが、それは、骨格筋組織8,21から無傷の核を調製するためにはるかに困難である。サザンブロットと同様に、コメットアッセイは、全筋肉組織ホモジネートからの細胞型特異的な情報を提供しない。 TUNEL法の別の方法としては、一本鎖DNA 25,33,41に対して、又はDNA損傷応答及び細胞死経路（ 例えば、p53は、H2AX、カスパーゼ）13,17,22,40に関与するタンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学である。このような抗体ベースの方法は、高いシグナル対バックグラウンド比を得るために、抗体の完全な特徴付けおよび優​​れた抗体の特異性を必要とする。場合であってもスペックIFIC抗体は、抗原回復手順34,35を介して標的タンパク質の変性を必要とすることが、存在する。私たちはここで議論したように、容認できないほど高い自己蛍光における筋肉組織結果の抗原検索。代替方法とは異なり、TUNEL、高い信号及び低いバックグラウンドを有するDNA損傷の検出、単純陽性および陰性対照を用いて試験することができる優れた特異性、抗原回復、および細胞レベルの分解能を必要としない、良好な組織浸透を達成する。代替の方法は、通常、一晩のインキュベーションを必要とするのに対し、また、TUNEL法は、完了するのに約4時間かかります。 我々は謝-Liおよび同僚16によって生成された脊髄性筋萎縮症（SMA）10のマウスモデルにおける骨格筋細胞死を研究する。筋肉におけるアポトーシス細胞を定量するために、我々は、異なるskeleにわたってロバスト働く組織調製、染色、および定量化の方法を開発したマウスでの異なる発生時点での境筋肉群。我々は、市販のTUNEL標識キットと市販の画像解析ソフトウェアを使用。また、正常に脊髄10で免疫蛍光染色と組み合わせて、TUNELアッセイを使用している。 ここに記載される方法は、骨格筋における組織病理学、疾患のメカニズム、老化のメカニズム、および発生（前および出生後）、細胞死を評価する研究者のために有用である。 TUNEL法は、細胞のサブセットのみが、影響を受けた細胞レベルの分解能が必要であるモデル系におけるDNA損傷および修復および細胞死の研究のために特に有用である。 このビデオでは、解剖、組織の処理、切片、およびマウス骨格筋の蛍光ベースのTUNEL標識を説明しています。また、半自動TUNEL信号定量する方法を記載する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="916">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:460px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:121px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19202</td>
			<td style="width:460px;">For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &#176;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:460px;">Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">O.C.T. compound&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td>Embedding medium for cryosectioning.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:121px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM 3050S</td>
			<td style="width:460px;">A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &#956;m sections may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td>Slides from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G-9391</td>
			<td style="width:460px;">Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 &#176;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">243361</td>
			<td style="width:460px;">Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectabond tissue adhesion reagent</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">SP-1800</td>
			<td style="width:460px;">Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9416</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:460px;">A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase/nuclease buffer</td>
			<td style="width:121px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">4812-30-K</td>
			<td>(included with kit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">780</td>
			<td style="width:460px;">Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNase-free water</td>
			<td style="width:121px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">351-029-131</td>
			<td>Water from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hoechst 33258</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">94403</td>
			<td style="width:460px;">Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Parafilm M</td>
			<td style="width:121px;">multiple</td>
			<td style="width:119px;">807</td>
			<td style="width:460px;">Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent microscope with digital camera</td>
			<td style="width:121px;">&#160;--</td>
			<td style="width:119px;">&#160;--</td>
			<td style="width:460px;">Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield antifade media</td>
			<td style="width:121px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td>Antifade media from any supplier may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">glass coverslips, No.1 thickness</td>
			<td style="width:121px;">Brain Research Labs</td>
			<td style="width:119px;">2222-1</td>
			<td style="width:460px;">Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22x22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nail polish</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">114-8</td>
			<td style="width:460px;">Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

成功した染色、TUNEL陽性シグナルは、強度しきい値を設定することにより、自己蛍光から分離するのに十分な明るすべきである。低倍率でのTUNEL陽性のオブジェクトは、骨格筋（ 図1A）で明るい不規則な断片として表示されることがあります。関与する細胞死のタイプはアポトーシス（ 図1B）である場合は、より高い倍率で、古典的なアポトーシス形態といくつかのTU...

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Research

JoVE Journal

Biology

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

16.2K ビュー.  Johns Hopkins School of Medicine. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling. 

ビデオ: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

生物学

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

2光子顕微鏡を用いたマウスの胸腺のその場イメージングで

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

骨格筋からの前駆体の精製

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

ラットのための手順<em&gt;その場で</em&gt;骨格筋収縮特性

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

長指伸筋の筋機能の評価<em&gt;エクスビボ</em&gt;と前脛骨筋<em&gt;その場</em&gt;マウスの

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...