Name: detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
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This work was supported by NIH-NINDS grant RO1-NS065895 and NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
We thank JHU SOM Microscope Facility for the use of the cryostat.

注：このプロトコルで説明されているすべての動物手順は、健康26の国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って行った。プロトコル（MO13M391）はジョンズホプキンス大学動物実験委員会によって承認された。 1.新生児マウスの犠牲、解剖、および固定<ol><li> CO 2吸入によって新生児マウスを生け贄に捧げる。 </li><li>すぐに膝上後肢を切断。約生後7日目までは、足の骨は、大きな実験室のハサミや鋭利な刃でカットスルーとクライオスタットで、その後のセクションにするのに十分なソフトです。 </li><li> 15mlチューブ中でリン酸緩衝食塩水（PBS）中の氷冷4％パラホルムアルデヒドを10mlの後肢を置く。 </li><li>浸漬は4℃で4-24時間、ホルムアルデヒド中で後肢を修正。胚組織は数時間を必要とする固定のS。 <ol><li>これはTUNELアッセイの効率を低下させる可能性がある、24時間よりも長い固定をしないでください。 </li></ol></li><li>ショ糖溶液中に浸漬することにより後肢をCryoprotect。 <ol><li>同一の15mlチューブにPBS中の10％スクロースにパラホルムアルデヒドを変更し、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li> PBS中30％のショ糖への変更は、4℃で、またはチューブの底に後肢沈むまで、一晩インキュベートする。組織は、スクロースに滅菌濾過されていることを条件とする、より長い期間、30％スクロース中に残してもよい。 </li></ol></li></ol> 2.組織の埋め込み<ol><li>メディアを埋め込むで標識埋め込むの金型ハーフウェイを埋める。 </li><li>金型の一方の壁にできるだけ近いカット側で、包埋媒体の上に後肢を置きます。金型の外側に後肢の向きをマークします。 <ol><li>いくつかの後肢を埋め込むと同じブロックにカット。しかし、それはすべてのホアヒンことを確認することが重要ですブロックdlimbsは肢の軸に沿ってレベルマッチングにセクションを取得するために、互いに平行に配向されている。 </li></ol></li><li>メディアを埋め込むと後肢をカバーしています。メディアを注ぎながら、後肢がずれた場合は、鈍先端が鉗子や爪楊枝で再配向する。 </li><li>少なくとも15分間室温で組織に浸潤する媒体を埋め込むことができます。 </li><li>メディアを埋め込む凍結し、ドライアイス上で直接ドライアイス上またはイソペンタン中で金型を置きます。すべての回での金型のレベルを維持し、埋め込まれた組織の移動を避けるようにしてください。 </li><li>数ヶ月までのため、カットする直前まで、-80℃で凍結した金型を保管してください。 </li></ol> 3.凍結切片組み込み手足<ol><li> -20°Cに設定され、クライオスタットチャンバ温度、-18℃の物体温度。必要に応じて、オブジェクトの温度を下に調整します。 </li><li>少なくとも30分間、クライオスタットチャンバ内の組織ブロックを平衡化する。正しいブロックの一時eratureは、セクションの品質のために重要である。 </li><li> 10μm以下の厚さで横断切片をカットします。厚い部分は、完全にTUNEL試薬によって貫通されることはありません。アンチロールプレート、ブレード、およびブレードの角度を使用します（通常は5°）はクライオスタットにお勧め。 </li><li>室温で、ゼラチンまたはvectabond被覆ガラススライド上にセクションを収集します。ドライアイス上でスライドボックスにすぐに配置します。腕の手の届くところにクライオスタットの近くに置かドライアイスで別々の容器にスライドボックスに保管してください。 <ol><li> 100〜200ミクロンをスキップし、手足の長い軸を横断連続切片をカットします。各シリアルレベルで少なくとも3隣接するセクションを収集します。 </li></ol></li></ol>市販のキットを用い後肢セクション4. TUNELアッセイ（室温でのすべてのステップ記述のない限り） <ol><li>室温と一晩乾燥するか、週末のセクションでスライドを解凍する。 </li><li> immersinによってセクションを再水和gがコプリンジャー中で2×10分間、PBS中でスライドする。ラボの乾燥は、可能な限りセクションの周りにできるだけ多くの液体を除去し、拭く。 </li><li>透過性のセクション<ol><li>非タンパク質分解、サポニンベースの市販の試薬または0.5％のTween20、PBS中の0.05％トリトンX100のいずれかを使用してください。 </li><li>湿度チャンバ内にスライドを置きます。シンプルな湿度室は、箱の底をカバーするために追加されただけで十分な水との緊密な蓋付きの空のピペットチップボックス、です。 </li><li>セクションをカバーするためにスライド上のピペット十分な試薬（50μL、新生児マウスの手足で十分である）。繰り返し攪拌がスライドをリフトオフするセクションの原因となり、セクションに直接ピペットないでください。 </li><li>鈍先端が鉗子を使用して、試薬の滴を広げ、完全にセクションをカバーする部分の上にパラフィルムの小さな長方形を配置します。すべての泡がパラフィルムの下で形成した場合、軽く乾いた、それを持ち上げて、再適用します。 </li><li> permeabiliでスライドをインキュベートカバーされた湿度室で1時間zation試薬。切片をスライドから持ち上げ始めた場合、透過処理時間が30分に短縮することができる。 </li><li>コプリンジャー2×5分でPBSでスライドを洗浄します。パラフィルムの長方形は、トップにフロートする必要があり、その後除去し、廃棄することができます。 </li><li>ラボを使用すると、可能な限りのセクションの周りにできるだけ多くの液体を拭いて乾かしてください。 </li></ol></li><li> TdTを媒介DNAブレークラベリング<ol><li> （50μlを新生児マウスの四肢のために十分である）組織切片をカバーするためにスライド上に1倍のTdTラベリングバッファー、ピペット十分なラベリングバッファを作るために、キットの指示に従ってください。 5分間の湿度チャンバー内でインキュベートする。また、コプリンジャーでのTdT標識バッファーでスライドを浸す。 </li><li>のTdT標識ミックスを作るために、キットの指示に従ってください。キットは、コバルト、マグネシウム、マンガンカチオンを含み、マンガンカチオンは、骨格筋、神経系のTISSを含め、様々な組織に適していますUEは、肝臓、皮膚、および骨。 </li><li>陽性対照のために、TdTをラベリングミックスにDNアーゼ（キット中の標識「ヌクレアーゼ」）を追加します。あるいは、キットの使用説明書に従って、37℃で1時間ヌクレアーゼ緩衝液中のDNアーゼポジティブコントロールセクションを事前処置する。交差汚染を防ぐために離れて他の実験的な部分からのDNase溶液とDNase処理セクションを保管してください。 </li><li>ネガティブコントロールのために、ラベリングミックスからTdT酵素を省略します。 </li><li>ラボを使用して、可能な限りスライドからできるだけ多くのTdTラベリング緩衝液を除去するために拭く。スライド（セクションあたり50μl）上にピペットのTdT標識ミックスは、パラフィルムの新しい長方形でカバーし、1時間、37℃で湿度チャンバ内でインキュベートする。 </li><li> 1X停止緩衝液を作るために、キットの指示に従ってください。スライドからのTdT標識ミックスを除去するワイプ実験室を使用して、組織切片をカバーするために200〜300μlの停止バッファーを添加し、5分間加湿チャンバー内でインキュベートする。アル<html> ternatively、コプリンジャーで停止緩衝液でスライドを浸す。 </li><li> PBSにスライド2×2分を洗ってください。ラボを使用して、可能な限りスライドからできるだけ多くのPBSを除去して拭いてください。 </li></ol></li><li>蛍光標識<ol><li> DNA破壊でdNTPを標識するためにフルオレセイン標識溶液を準備し、キットの指示に従ってください。スライド（セクションあたり50μl）上にピペット溶液は、パラフィルムの新しい長方形でカバーし、そして20分間湿度チャンバー内でインキュベートする。 </li><li>コプリンジャーでPBS中で2分間洗浄スライド。ラボを使用して、スライドからできるだけ多くのPBSを除去して拭いてください。 </li><li> （100〜200μlをセクションをカバーするのに十分である）スライド上にPBSおよびピペット中1μg/ mlにヘキスト33258核染色を希釈する。 5分間の湿度チャンバー内でインキュベートする。 </li><li> PBSで5分間3回洗浄。 </li><li>退色蛍光マウンティングメディアでカバースリップし、マニキュアとの縁をシールする。 </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5。デジタル画像取得<ol><li> DAPI、FITC、テキサスレッドフィルター（または同等品）と、従来の蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。ラベル付けが成功したと核（完全なまたは断片化）が標識したことを確認するために、より高い倍率の対物レンズ（20Xまたは40X）を使用します。 10倍の目的は、TUNEL陽性涙点の定量のために十分である。 </li><li>一つの画像に合わせて3つの別々の偽色チャネルとしてヘキスト染色、TUNEL染色、及び自家蛍光信号の画像を収集します。 TUNELのフルオロフォア標識が緑の場合、赤フィルタの画像自家蛍光信号、およびその逆。 <ol><li>その後の閾値化と定量化のためのスライドの間の等価すべての画像の設定をしてください。各フィルタ、プリセットとレコード露光時間、ゲイン、ビニングのために（無ビニングがベストではない）;自動露出またはゲイン設定を使用しないでください。 </li><li>最高のINTENの範囲をキャプチャします露出とゲイン設定を見つけるために試行錯誤を使用してくださいすべての染色スライド全体でsities。この意志バイアス定量として、取得された画像には飽和画素が存在しないことを確認してください。 </li></ol></li><li>関心の全体の筋肉群の画像を取る。これは一緒に &quot;ステッチ&quot;される複数の画像が必要な場合があります。 </li></ol> 6.画像解析<ol><li> TUNEL染色のデジタル画像を分析するために、市販の画像解析プログラムを使用する。商用ソフトウェアを用いた解析は、ここに示されています。あるいは、NIHからのフリーソフトウェアImageJがTUNEL染色を分析することができる。 </li><li>ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）とTUNEL染色切片に隣接する部分を染色し、従来の明視野顕微鏡でフルセクションデジタル画像を取る。定量化する解剖学的構造をトレースする解剖学アトラス5,18,19と組み合わせてこのH＆E画像を使用してください。 </li><li> TUNELチャネルは使用し、定量化する領域の輪郭をトレースし、手動でオフにしヘキストと指導のための自己蛍光チャンネル。マスク内にトレース領域に変換する（選択された画素の集合が、分析されるべき座標）。 </li><li> TUNELチャネルをオンにします。画像解析プログラムにおける強度閾値関数を使用して、すべての自己蛍光信号を除外するために低い閾値を設定する。 </li><li>研究·セット内のすべての画像に同じしきい値設定を適用します。マスクに閾値化の選択を変換します。 </li><li>各画像には、筋肉の領域マスクとTUNELマスクを組み合わせる。新しい組み合わせのマスクのみトレース筋肉領域内TUNEL信号を表す。 </li><li>トレース筋肉領域内TUNEL信号のオブジェクトとオブジェクト領域の数を決定するために組み合わせてマスク上にマスク定量を行う。 ImageJの中の粒子分析機能を使用してこれを実行します。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

マウス骨格筋におけるDNA損傷に関連するアポトーシスを検出し、定量的に分析する方法について説明する。手順は、組織採取、TUNEL染色、デジタル画像取得および画像解析を含む。一般的な組織学的部品やツールが必要であり、特別な商業TUNELキットが必要です。必要とされる必須の大きな装置品目はクライオスタット、デジタル画像機能を有する落射蛍光顕微鏡および画像解析のためのコンピュータシステムである。 実験者は潜在的な落とし穴に注意する必要があります。組織自己蛍光は、蛍光イメージングにおける主要な関心事である。 unperfused動物では、残りの赤血球は、かなり高い自家蛍光信号に寄与するであろう。内皮細胞はまた、かなりの自己蛍光であってもよい。そのため、自家蛍光がTUNEL陽性シグナルと間違えないことを確認することが重要である。この評価は、容易になしフルオロでチャネルの画像を撮影することによって達成されるuorophore、TUNEL陽性チャネルから比較可能な減算に使用する。このように、蛍光ベースのTUNEL法は、バックグラウンド染色のための内部統制を提供しない比色明視野顕微鏡法よりも優れている。 組織固定は、TUNEL標識の成功に大きな影響を持つことになります。これは、24時間を超えない、パラホルムアルデヒドで固定時間を最小限にすることが最善である。胚および新生児の組織を24時間より大幅に短い固定時間を必要とします。 TUNEL標識が成功すると、その信号は、容易に画像解析ソフトウェアを用いて強度閾値ゲーティングによって単離することができるように、TUNEL陽性シグナルは、バックグラウンドの自己蛍光よりもはるかに高くなければならない。加熱時間は、最小値（5分）に保つが、この前処理10されている場合、クエン酸緩衝液中で27,35の加熱の標準プロトコルを使用して、抗原回復はやや低いTUNEL信号を改善することができる加熱（95℃、 例えば 20分）より長い期間の延長された場合dsはTUNEL信号を低減する。抗原回復は、バックグラウンド自己蛍光および偽陽性を増加し、従って、増大したTUNEL信号から信号対雑音比の任意の利益を否定することができる。 TUNEL信号測定値を定量化し、総筋肉領域にまたは定量面積あたりの核の数のいずれかに正規化する必要があります。 TUNELはアポトーシス核を測定するので、理想的な正規化は、全体の核となる。しかし、比較的薄い（10μm）を筋肉切片で、筋線維および核はとても多く、それは自動的に閾値化および粒子分離アルゴリズムによってヘキスト染色した核をカウントすることは不可能であるので、密に充填された。手動カウントはまた、非常に労働集約的かつ不正確である。実現可能な代替案は、総筋肉面積に正規化することである。 適切な組織処理に使用されるTUNELアッセイ技術および陽性および陰性対照組織におけるDNA損傷および細胞死を検出するための比較的速く、再現性のある、定量的な方法である。これは、病理学的なメカニズムとしてのアポトーシスを確認するために、影響を受けた細胞型を同定するため、および治療的処置の有効性を評価するために用いることができる。この手順は、SMA、ALS、筋ジストロフィー、毒素誘導性ミオパシー、および運動生理学などの骨格筋疾患と傷害の分野の研究者に価値がある。

ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）dUTPニック末端標識（TUNEL）は12,23を破る二本鎖及び一本鎖DNAの3 &#39;末端へのdUTPを付加するTdT酵素を使用するプロセスである。アポトーシスとDNA損傷を検出するためのTUNEL法は、最初にGavrieli らによって20年以上前に報告された。1,12,24。それ以来異なる組織標本7,23,27,40で評価し、最適化されています。 TUNELは、虚血誘導性のニューロン6,14,29及び心筋43,44の細胞死、興奮毒性神経細胞死30,31、および関節炎の治療39においてバイオマーカーとしての研究に使用されている。また、様々なヒト癌において予後因子および腫瘍細胞マーカーとして使用されてきた2,3,15,32,37,38,42。 代替的な方法は、DNA損傷および細胞死の検出のために存在するが、それらは技術的な課題と警告している。サザンブロッティングはquantifするために使用することができるYのDNA全組織溶解物における損傷7,9-11が、この方法は、細胞のレベルの分解能を提供し、定量化が困難であるされません。コメットアッセイは、細胞4,20,28,36から保存核を抽出する必要が別の細胞に基づいた方法である。コメットアッセイは、培養された単離された細胞にうまく機能するが、それは、骨格筋組織8,21から無傷の核を調製するためにはるかに困難である。サザンブロットと同様に、コメットアッセイは、全筋肉組織ホモジネートからの細胞型特異的な情報を提供しない。 TUNEL法の別の方法としては、一本鎖DNA 25,33,41に対して、又はDNA損傷応答及び細胞死経路（ 例えば、p53は、H2AX、カスパーゼ）13,17,22,40に関与するタンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学である。このような抗体ベースの方法は、高いシグナル対バックグラウンド比を得るために、抗体の完全な特徴付けおよび優​​れた抗体の特異性を必要とする。場合であってもスペックIFIC抗体は、抗原回復手順34,35を介して標的タンパク質の変性を必要とすることが、存在する。私たちはここで議論したように、容認できないほど高い自己蛍光における筋肉組織結果の抗原検索。代替方法とは異なり、TUNEL、高い信号及び低いバックグラウンドを有するDNA損傷の検出、単純陽性および陰性対照を用いて試験することができる優れた特異性、抗原回復、および細胞レベルの分解能を必要としない、良好な組織浸透を達成する。代替の方法は、通常、一晩のインキュベーションを必要とするのに対し、また、TUNEL法は、完了するのに約4時間かかります。 我々は謝-Liおよび同僚16によって生成された脊髄性筋萎縮症（SMA）10のマウスモデルにおける骨格筋細胞死を研究する。筋肉におけるアポトーシス細胞を定量するために、我々は、異なるskeleにわたってロバスト働く組織調製、染色、および定量化の方法を開発したマウスでの異なる発生時点での境筋肉群。我々は、市販のTUNEL標識キットと市販の画像解析ソフトウェアを使用。また、正常に脊髄10で免疫蛍光染色と組み合わせて、TUNELアッセイを使用している。 ここに記載される方法は、骨格筋における組織病理学、疾患のメカニズム、老化のメカニズム、および発生（前および出生後）、細胞死を評価する研究者のために有用である。 TUNEL法は、細胞のサブセットのみが、影響を受けた細胞レベルの分解能が必要であるモデル系におけるDNA損傷および修復および細胞死の研究のために特に有用である。 このビデオでは、解剖、組織の処理、切片、およびマウス骨格筋の蛍光ベースのTUNEL標識を説明しています。また、半自動TUNEL信号定量する方法を記載する。

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 &amp;deg;C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Embedding medium for cryosectioning.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 &amp;mu;m sections may be used.</td></tr><tr><td>Glass slides, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Slides from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 &amp;deg;C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.</td></tr><tr><td>Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.</td></tr><tr><td>Vectabond tissue adhesion reagent</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescein &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; apoptosis detection kit</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease buffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(included with kit)</td></tr><tr><td>10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>DNase-free water</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Water from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope with digital camera</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.</td></tr><tr><td>Vectashield antifade media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade media from any supplier may be used.</td></tr><tr><td>glass coverslips, No.1 thickness</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.</td></tr></tbody></table>

detection and analysis of dna damage in mouse skeletal muscle in situ using the tunel method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

成功した染色、TUNEL陽性シグナルは、強度しきい値を設定することにより、自己蛍光から分離するのに十分な明るすべきである。低倍率でのTUNEL陽性のオブジェクトは、骨格筋（ 図1A）で明るい不規則な断片として表示されることがあります。関与する細胞死のタイプはアポトーシス（ 図1B）である場合は、より高い倍率で、古典的なアポトーシス形態といくつかのTUNEL陽性のオブジェクトは、観察されるべきである。ポジティブコントロール（DNアーゼが追加された）部分（ 図1C）ですべての組織全体に均一に分布する、豊富なTUNEL陽性シグナルを示すべきである。ネガティブコントロール（反応から省略TdT酵素）は、低強度の背景と自家蛍光信号のみ（ 図1D）を得る必要があります。この組織は、正常なアポトーシス（ 図1A）の率が高く、皮膚は、全体の脚部における内部陽性対照を提供する。 レッド血細胞は、骨、および内皮細胞は、有意な自己蛍光シグナル（ 図2）が寄与することができる。それは、自己蛍光が正のTUNELシグナリングと間違えないことを確実にするために無蛍光標識付きの独立チャネル内の各セクションの画像にお勧めします。それは画像強度閾値（ 図2A、中段）を設定することにより単離することができるように、真のTUNEL陽性シグナルは、自己蛍光よりもはるかに高い強度を有するべきである。代替的に、自己蛍光チャネルデジタルTUNEL陽性シグナル（ 図2A、下の行）を得TUNELチャネルから減算するようにしてもよい。 ここで説明するTUNEL標識方法は、SMA 10のマウスモデルにおける骨格筋細胞死を定量化するために使用されている。 TUNEL標識は、同腹子対照（ 図3A）と比較して、5日齢のSMAマウスからの足の筋肉におけるアポトーシス性プロファイルの数の増加を示す。アポトーシスの増加である法による定量化は、複数の筋群（ 図3B）で統計的に有意な差を示し、上述した。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" width="600" /> 図1：マウスの後肢の筋肉の代表的なTUNEL標識。 （A）前脛骨筋、脛骨、および皮膚を示すマウスの後肢のTUNEL標識横断面。 TA - 前脛骨筋、FDL - 屈筋長指、EDL - 長指伸筋。グリーン - TUNEL、青 - 核、赤 - 自家蛍光信号。点線は、定量化のために、筋肉の領域の輪郭を描く。後肢の筋肉に隣接する皮膚は、TUNEL標識のための内部陽性対照を提供しています。胚におけるTUNEL陽性構造（緑）を識別= 200ミクロンスケールバー。（B）代表の高倍率画像<html>アポトーシス核として13日目のマウスの骨格筋。 Fayzullinaとマーティン2014 10から変更されたスケールバー=10μmである。A、Bは 。マウスの後肢の（C）横断面ポジティブコントロールとして機能するようにDNアーゼ処理後のTUNEL標識。ほとんどの核は明るいTUNEL標識を持っている。スケールバー=50μmである。（D）（C）に示すように、同じマウスの後肢の横部（Cセクションに半隣接）を陰性対照として使用するために省略TdT酵素とTUNEL標識。全く明るいTUNEL陽性シグナルはありません。赤チャンネルの信号との共局在化によって検出されるような唯一の緑色の信号が自己蛍光である。スケールバー=50μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52211/52211fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2「FO：コンテンツ幅= &quot;6インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg&quot;幅= &quot;600&quot; /&gt; 図2：組織自己蛍光を考慮し、TUNEL標識を分析する際に、定量から除外されなければならない。 （A）マウスTUNEL標識と自家蛍光との後肢横断面：元のイメージ（一番上の行）、調整後の閾値（中段）と同じ画像、同じ画像自家蛍光を持つ（赤）チャンネルは、（下の行）を差し引い。閾値は、ほとんどの赤血球及び内皮細胞の自家蛍光ではなく染色アーチファクト（矢じり、中段）を排除する。チャンネル減算はまた、染色アーティファクト（矢じり、一番下の行）を排除します。グリーン - TUNEL、赤 - 自己蛍光、青 - 核。スケールバー=100μmである。灰色の長方形は、Bに拡大されたエリアの輪郭を描く。（B）赤自家蛍光パネルの高倍率画像をインチ赤血球およびいくつかの内皮細胞（矢印）、およびTISS両方の赤と緑の蛍光フィルターにおけるUE染色アーティファクト（矢じり）autofluoresce。スケールバー=50μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52211/52211fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" width="600" /> 図3：TUNEL標識は新生児SMAマウスの骨格筋における細胞死を示す生後5日目SMAマウスから下位後肢筋肉がTUNEL法により標識した（A）TUNEL標識がSMAのマウスに複数の筋群に複数のアポトーシスプロフィールを示す。同腹子対照（左）に比べて筋肉（右）。グリーン - TUNEL、青 - ヘキスト（核）、赤 - 自己蛍光。点線は、定量化され、筋肉の領域の輪郭を描く。 TA - 前脛骨筋、FDL - 屈筋掘るitorumの長母、EDL - 長指伸筋。スケールバー=200μmである。（B）TUNEL標識は、筋肉の全画素面積に対して正規TUNEL信号の全画素面積として定量した。 ±標準誤差が示されていることを意味、N = 4から5匹のマウス。各筋肉群（片側t検定）のためのSMAと対照との間の統計的有意性：* はp &lt;0.05、** はp &lt;0.01、*** はp &lt;0.001。この図は、Fayzullinaとマーティン2014 10から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52211/52211fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

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Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

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ビデオ: Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

発生生物学

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

筋肉疾患の構造的基礎を研究するためのツールとしての無傷のマウス骨格筋のX線回折

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

マウスの前期停止卵子におけるDNA損傷の同定

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

著者スポットライト:哺乳類の卵母細胞および着床前胚におけるDNA損傷応答の理解 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

生物学

CUT&#38;Tagを用いたマウス筋芽細胞のゲノムヒストンマークのプロファイリング

Using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myoblast Research

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile the genomic locations of chromatin binding factors, histone marks, and histone variants. CUT&amp;Tag protocols function very well with mouse myoblasts and freshly isolated muscle stem cells (MuSCs). They can easily be applied to many other cell types as long as the cells can be immobilized by Concanavalin-A beads. Compared to CUT&amp;Tag, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are time-consuming experiments. ChIP assays require the pre-treatment of chromatin before the chromatic material can be used for immunoprecipitation. In cross-linking ChIP (X-ChIP), pre-treatment of chromatin involves cross-linking and sonication to fragment the chromatin. In the case of native ChIP (N-ChIP), the fragmented chromatins are normally achieved by Micrococcal nuclease (MNase) digestion. Both sonication and MNase digestion introduce some bias to the ChIP experiments. CUT&amp;Tag assays can be finished within fewer steps and require much fewer cells compared to ChIPs but provide more unbiased information on transcription factors or histone marks at various genomic locations. CUT&amp;Tag can function with as few as 5,000 cells. Due to its higher sensitivity and lower background signal than ChIPs, researchers can expect to obtain reliable peak data from merely several millions of reads after sequencing.

著者スポットライト:筋幹細胞研究における課題と革新のナビゲート

Researchers new to the epigenetic field will find CUT&amp;Tag a significantly easier alternative to ChIP assays. CUT&amp;Tag has tremendously benefited the epigenetic studies on rare and primary cell populations, generating high-quality data from very few cells. This protocol describes performing H3K4me1 CUT&amp;Tag assays on mouse myoblasts isolated from mouse hindlimb muscles.

Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&#38;Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

This protocol paper aims to provide the new researchers with the full details of using Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&amp;Tag) to profile ...

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle mass and strength in healthy individuals and in patient populations. There is a need for precision rehabilitation tools to test the safety and effectiveness of PRT to maintain and/or restore muscle mass and strength in preclinical studies on small and large animal models. The PRT methodology and device described in this article can be used to perform dosage-adjusted resistance training (DART). The DART device can be used as a standalone dynamometer to objectively assess the concentric contractile torque generated by the ankle dorsiflexors in mice or can be added to a pre-existing isokinetic dynamometry system. The DART device can be fabricated with a standard 3D printer based on the instructions and open-source 3D print files provided in this work. The article also describes the workflow for a study to compare contraction-induced muscle damage caused by a single bout of DART to muscle damage caused by a comparable bout of isometric contractions (ISOM) in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy type 2B/R2 (BLAJ mice). The data from eight BLAJ mice (four animals for each condition) suggest that less than 10% of the tibialis anterior (TA) muscle was damaged from a single bout of DART or ISOM, with DART being less damaging than ISOM.

The present protocol describes a unique technique called dosage-adjusted resistance training (DART), which can be incorporated into precision rehabilitation studies performed in small animals, such as mice.

筋肉損傷のリスクを低減したマウスにおける用量調整されたレジスタンストレーニング

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析

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傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

筋肉疾患の構造的基礎を研究するためのツールとしての無傷のマウス骨格筋のX線回折

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

マウス卵母細胞におけるDNA二本鎖切断の検出

使用してMG53を介した細胞膜修復の可視化 in vivoでと in vitroでシステム

Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) Assay in Mouse Myobblast Researchにおける活用

筋肉損傷のリスクを低減したマウスにおける用量調整されたレジスタンストレーニング