We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

כל הנהלים מבוצעים מאושרים על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה מוסדית טיפול בבעלי חי ועדת שימוש ופעלו מכון הלאומי לבריאות הנחיות. 1. טכניקה כירורגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טכניקת aseptic במהלך הליך זה על ידי שימוש בכפפות סטריליות, מכשירים, ותחום כירורגית סטרילית על פי הנחיות NIH 25. לעקר כלים לפני תחילת ניתוח על ידי המעוקר (ראה טבלה של חומרים כימיים / ציוד ספציפי לרשימה מלאה). השתמש מעקר חרוז זכוכית לעקר כלים במהלך המבצע. </li></ol> 2. הרדמה והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בתיבת הרדמה בתערובת של 0.9 L חמצן / דקה וisoflurane 2.5% באמצעות מערכת אידוי isoflurane וטרינרים. ודא שהעכבר אינו מגיב לשינויים בתנוחת גוף לפני הסרתו מהתיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחת עיניים לmouעיניו של se כדי להגן עליהם מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את זרימת הגז מהתיבה לחרטום. מניחים את העכבר ישירות על צדו השמאלי על משטח לוהט מכוסה עם כרית כירורגית ונייר סופג ספסל עם האף שלה ופה בתוך חרוט. לפקח באופן רציף קצב הנשימה של העכבר ושיעור ולהתאים את רמות isoflurane לפי צורך (בין 2.5 - 3% isoflurane) כדי לשמור על רמה נאותה של הרדמה, ולהשתמש ברפלקס קמצוץ הבוהן כדי לאשר הרגעה כוללת. </li></ol> 3. גישה ניתוחית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר ולהתמקד stereoscope עם את שדה הניתוח. התאם את החרטום וקלט אותו כך שהוא נמצא בעמדה בשולי שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם העכבר שוכב על צידו השמאלי, תדביק את קצה אוזן ימין לחרטום, וחושף את האזור שמאחורי האוזן שבו החתך ייעשה. ודא שוריד אוזן האחורי נוסע אופקי על פני האוזן. שימו לב כי המיקום הנכון של tהוא חיה ומקליטה של ​​האוזן הן קריטיות כדי למצוא עצב הפנים במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את הפרווה ובמאחורי האוזן עם 70% אתנול ו לגלח את האתר כירורגית באמצעות סכין גילוח או אזמל. טרום להרטיב את הפרווה הופך גילוח קל יותר במיקום האנטומי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את העור עם תמיסת יוד, כגון לשפשף פולידין כירורגית (7.5% povidone- יוד), ואחריו אתנול 70%. חזור על ניקוי זה פעמים נוספות כדי לחטא את האזור ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע היכן לבצע את החתך, לעקוב אחר וריד אוזן האחורי מהאוזן caudally לאזור האחורי לבליטת האוזן. בעזרת מספריים האביב, לעשות חתך 4 מ&quot;מ - 2 מ&quot;מ אחורי 3 לבליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח באמצעות השומן תת עורי וfascia באמצעות לנתיחה בוטה. הימנע חיתוך ישיר עם המספריים כי כלי דם או רקמת שריר יכולים להיפגע בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דימום מתרחש, להפעיל לחץ לאתר כירורגית עם מקלון צמר גפן סטרילילפחות 30 שניות. אם אובדן נוזלים משמעותי מתרחש, להזריק את העכבר intraperitoneally עם עד 0.5 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית 0.9% באמצעות 25 או 27 מחט G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכמה ציוני דרך מרכזיות, עצב אבזר השדרה, תעלת אוזן, וקדמיים שריר הדו-בטנים (שיפורט להלן), כדי לאתר את עצב הפנים. לנתח סביב ציוני הדרך הללו עד הסניפים של עצב הפנים הם דמיינו. העצב יופיע כמבנה לבן מוצק משמעותי כאשר הוא נחשף ושכבת fascia שומרת אותו למבנים שבבסיס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את עצב אבזר השדרה, אשר נוסע מחלק הזנב של הגולגולת למעצבב את שריר הטרפז, ברגע שהשומן תת עורי וfascia כבר גזור. עצב הפנים עמוק לעצב אבזר השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תעלת אוזן הסחוסים שנראית פנינים לבנה וניתן לראות מקורי לעצב הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את שריר הבטן של השריר הדו-הבטנים הקדמית שנמצאת על גבי וגaudal לעצב הפנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הענפים העיקריים של עצב הפנים הם דמיינו, לעקוב אחר אותם dorsally למצוא מוצאם מנקב stylomastoid. באמצעות קנס היטה מלקחיים דומון # 5/45 להחזיק אתר כירורגית פתוח, לקדם את הטיפים מספריים האביב הבא הנתיב של העצב, ולאחר מכן להעביר את המלקחיים dorsally לשמור על האזור המתקדם החדש פתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את תא המטען של עצב הפנים עם הזיגומטית, buccal, וסניפים בלסת תחתונים, שוליים בנקודה זו. הערה: הסניף הזמני יימצא קרוב יותר לforamen. ענפי עצב הלסת תחתונים, השוליים לחלקיו העליונים ותחתונים קרובים ללסת, וכך בענפי עצב אלה לא יהיו גלויים ברמה זו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצוע חיתוך רוחב עצב, לייצב את העצב בעדינות עם המלקחיים טיפ הנאה וחתך את העצב עם המספריים באביב. הימנע מהפעלה יותר מדי מתיחה בעצב עם המלקחיים כדי למנוע avulsing העצבי מהמוח. Pushהגדמים אחד מהשני, או לחתוך ולהסיר חלק מהעצב הדיסטלי כדי לוודא ששום חיבור מחדש יכול להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצוע פציעה למעוך, להשתמש דומון # 5/45 במלקחיים כדי לדחוס את העצב למשך 30 שניות באמצעות לחץ מתמיד לנתק את כל האקסונים, ולאחר מכן לחזור למחוץ זה בזווית שנייה בניצב לאתר למעוך הראשון. הימנע מהפעלת כמויות משתנות של לחץ במהלך למעוך 30 שניות, אחרת הפציעה תהיה עקבית בין בעלי החיים. </li></ol></li></ol> 4. סגירה ושחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם מחדש את השומן ושרירים על מבני היסוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקירוב את הקצוות של החתך ולסגור את הפצע באמצעות קליפ פצע 7.5 מ&quot;מ. תפרים או דבק מקובלים גם לסגירת פצעים. יכולים להיות מסופקים על משככי כאבים לאחר ניתוח בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הסרט מאוזנו של העכבר. כבה את זרימת isoflurane ולאפשר העכבר כדי לנשום חמצן טהור למשך 30 שניות לדקות 1. Plאס העכבר בכלוב ריק ללא מצע להתאושש מהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העכבר הוא התאושש, לבחון את ההתנהגות שלה בחיפוש אחר סימנים לאישוש של שיתוק פנים. השפם יהיה משותק והזווית חזרה לכיוון הלחי, האף יהיה חרג, והעין לא למצמץ בתגובה למשב אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים במשותף הבית לאחר ניתוח אם הם ממין נקבה. הימנע דיור עכברי זכרים במשותף כי הם אגרסיביים יותר ונוטים להעביר בכפיית קליפים הפצע של cagemate, מה שמוביל לזיהום. לספק משככי כאבים לאחר ניתוח בשלב זה, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על העכברים פעם ביום במשך כמה ימים לאחר הניתוח כדי לוודא ששום זיהום או סיבוך אחר מתרחש לאחר הניתוח. הסר קליפים פצע 7-10 ימים לאחר הניתוח, אם הם לא נפלו החוצה בכוחות עצמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הסיכה משחה העין לעין המושפעת מדי יום כדי למנוע סיבוכים בקרנית, או עד שרפלקס מצמוץ העין הוא מחדשמכוסה או עד המתת חסד. </li></ol>

יש לי המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

נתונים שהוצג בפרוטוקול החלטת תשואות בסיס-זוג מתילציה ציטוזין באזורים הגנומי ביולוגי-רלוונטיים. הפרוטוקול כפי שנכתב הוא מותאם עבור 50 ng של חומר מוצא, לעומת זאת, זה יכול להיות מותאם לטיפול במגוון רחב של חומר הזנה (ng 5 או יותר) 26. זה ידרוש התאמות של חלק מצעדי הפרוטוקול כפי שניתן לראות בטבלה 6. ספריות ERRBS נוחות לסידור הסוף לזווג וכיסוי הגנומי נוסף יכול גם להתבצע על ידי רצף קוראת יותר מ 51 מחזורים. רצף ריבוב יציע פרוטוקול עלות נמוך יותר לדגימה, לעומת זאת, זה יגרום לכיסוי מופחת לאתר CPG המיוצג בנתונים (איור 5 ולוח 8), ולא יניב עומק מספק של כיסוי לביצוע ניתוחים אשר דורשים כיסוי גבוה ל אתר CPG (למשל כפי שתואר על ידי הנדן et al. 33). לבסוף, פרוטוקול זה (או כל protoco מבוסס bisulfiteיב) לא יכול להבחין בין מתיל-ציטוזין וhydroxymethyl-ציטוזין 46,47. עם זאת, הנתונים שנוצרו יכול להיות משולב עם פרוטוקול אחר תוצאות 48,49 להתוות שינויים השונים, ושינויי ציטוזין אחרים דיווחו לאחרונה 50, הם צריכים להיות עניין. ספריות באיכות גבוהות תופיע כפי שמוצג באיור 3 א-C, וברגע שאסף עבור סידור מניב עקבות כפי שמוצג באיור 3G (זכר אדום) המייצג את התרומות טוחנות שווה משני השברים הספרייה. כישלון הכנת ספרייה יכול לנבוע מכל צעד במהלך ההליך. אם DNA המושפל מעובד זה יגרום לספריות שאינם מועשרים שבברי MspI ומכאן בכיסוי CPG הנמוך באמצעות פרמטרי הרצף המתוארים בפרוטוקול זה. אם אנזים הוא שאינם פונקציונלי או לא נכלל בטעות מאחד מהתגובות, הפרוטוקול לא יניב הספרייה הצפויה. אם המחשבה קשירהction אינו יעיל, המתאמים נמצאים בריכוז גבוה מהצפוי, ו / או ריכוז פריימרים המשמש הוא מגיב להגבלת צעדי ההגברה הסופיות, כישלון ספרייה יכול להתרחש. מתאמים עודפים (נתפסו כפסגות בנ&quot;ב ~ 150 בתוצאות bioanalyzer; איור 3D-F) בספרייה גם תפריע רצף בשל האשכולות חסרי הבחנה של שתי הספרייה ומתאמים עודפים. בעוד ספרייה כזו עשויה רצף כנראה בדרך כלל, חלק משמעותי מקורא יהיו רצפים רק מתאם. אם מתאמים עודפים הם נצפו בספרייה, דרך טובה ביותר הוא לחזור על הכנת הספרייה אם חומר נגיש באמצעות חומר הזנה אופטימלי למתאם יחס כמויות. לבסוף, על מנת להבטיח הגברה PCR יעילה של הספריות, השברים ספרייה הנמוכים וגבוהים נשמרים כדגימות נפרדות ברחבי המרת bisulfite וצעדי העשרת PCR. אם לא יעשה זאת מניבה יעילות ההפרש של הגברה בPתגובת CR של שברים גבוהים יותר ונמוכים יותר (כפי שניתן לראות באיור עקבות כחולות 3G) והפוטנציאל לייצוג שוויוני של הלוקוסים הגנומי בהתאמה מכוסות בכל שבריר ספרייה במהלך רצף. המשתמש יכול לבחור לכלול צעד PCR כמותי מייד לאחר המרת bisulfite לטיטרציה נוספת של מחזורי PCR אופטימליים הנחוצים כדי להגביר את הספריות שנוצרו. יש פרוטוקול הכנת ספריית ERRBS כמה שלבים עיקריים שבי חומרים כימיים מסוימים מומלצים. בשלב הסוף-תיקון, השימוש בתערובת dNTP ארבעה נוקליאוטידים מאפשרת לקצה תיקון של כל מוצרים שאינו מכילים את הסככה CG, כגון אלה הנובעים מפעילות האנזימטית כוכב MspI ושברי DNA טעון בדגימת DNA המקורית. התוצאה היא ייצוג CPG שיפור בתוצאות. בשלב קשירה זה קריטי להשתמש האנזים ריכוז גבוה (2,000,000 יחידות / מיליליטר) ומתאמים מפוגלים כדי להבטיח שReacti קשירהבהוא יעיל ושמרת bisulfite אינה משפיעה על רצפי המתאם חיוניים ליישור נתונים מדויק. בצעד PCR, באמצעות פולימראז מסוגל הגברת שברי DNA GC-עשיר שטופל bisulfite הוא הכרחי עבור סגוליות גבוהה. לבסוף, כדי להבטיח חיסול מתאמים ופריימרים עודפים, טיהור SPRI חרוז (לדוגמא: Agencourt AMPure XP) מומלצת ולא מבוססים מבחני טור לקשירה ובידודי מוצר ה- PCR. על מנת להפיק נתונים באיכות גבוהה, חשוב להבטיח המרת bisulfite יעילה. השליטה מוצגת מציעה למשתמש את היכולת לקבוע את יעילות המרה לפני הרצף. כחלופה, DNA שאינו בני אדם כמו למבדה DNA יכול לשמש כבקרה פנימית (ספייק-ב). בשל ההבדלים במין, זה סוג של שליטה יכול להיכלל ישירות ברצף במורד הזרם (למשל כפי שYu, et al. 34). עם זאת, אם אני ספייק-בs מנוצל, זה לא יכול לשמש כדי לקבוע את יעילות המרה לפני רצף ספרייה, אלא אם כן מוגבר באופן ייחודי ועצמאי רצף לפני רצף ספרייה. שיעורי ההמרה נקבעו מבוססים על מעמד מתילציה באתרים לא CPG. זה לא יכול להיות מתאים לשימוש בהקשר של מתילציה ציטוזין הגבוהה שבאינו CPG הקשר (למשל בתאי גזע עובריים) ודוגמאות מקבילות או באמצעים אחרים של הערכה ליעילות המרה יכולה להיות מנוצל למטרה זו. יש כמה אזהרות לכתובת זו הנן ייחודיות לרצף של ספריות ERRBS. שלושה הבסיסים הראשונים של השברים ספריית רצף כמעט אחיד שאינו אקראי בשל אתר MspI הכרת החתך (C ^ CGG, ראו איור 4, C). תוצאות זה בפוטנציאל לאובדן נתונים משמעותי בשל איכות נמוכה קורא כתוצאה מלוקליזציה אשכול עני למרות צפיפות אשכול גבוהה לכאורה ברצף. כדי להתגבר על המכשול הזה,כולל ספריית מורכבות גבוהה בנתיב עצמאי (שליטת PhiX או סוג ספרייה אחר) כנתיב שליטה ייעודי. יש ספריות מורכבות גבוהות קצוות המכילים ייצוג מאוזן של A, C, T ו- G בארבעת הבסיסים הראשונים רצף. נתיבי בקרה נאותים כוללים ספריות כגון RNA-seq, שבב seq, רצף הגנום כולו, או שליטה המוצעת על ידי היצרן המכונה רצף (למשל PhiX בקרת v3). כאשר יועד כנתיב שליטה לריצת הרצף המתאים, היא יכולה לשמש כבסיס לדור המטריצה ​​המנוצל בארבעת הבסיסים הראשונים של רצף כדי לזהות עמדות אשכול. האיכות גבוהה יותר קוראה נתפסה תעלה את ממוצע הכיסוי לכל אתר על ידי CPG 5.2 (n = 4). לחלופין, קושי טכני זה יכול להיות גם להתגבר באמצעות גישת רצף כהה כפי שתואר קודם לכן 23. קריטריונים לקביעת רצף אחרים בצעו נהלי עבודה לפרוטוקולים של היצרן. לבסוף, הכיסוי לCPG גחוסן לניתוח נתונים ותונחה על ידי המשתמש ובחלקו על ידי השאלות הביולוגיות של עניין. סף כיסוי 10x מאפשר גישת ניתוח כיסוי גבוה, אולם סף זה יכול להיות הוריד צריך שיהיה העניין. דיון מלא בניתוח נתונים ERRBS הוא מעבר להיקף של מאמר זה, עם זאת, באופן דיפרנציאלי cytosines ואזורים מפוגלים ניתן לקבוע באמצעות כלים קוד פתוח 31,51-53. שיקולי ניתוח נוספים וגישות שתוארו היטב 54,55, והקורא מוזמן לחפש הספרות בכלים המתאימים ביותר לניתוח המתוכנן. בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו, ERRBS מציע פרוטוקול בן ארבעה ימים שכאשר הופיע כתשואות מתוארות שיעור גבוה של שחזור. שיטה זו הוכחה בהשוואה לזהב הסטנדרטי MassARRAY EpiTYPER 26, הוא חסכוני לנתוני כיסויים גבוהים, וניתן להתאמה לחומר הזנה שונותכמויות (נוחים לסוגי עיבוד מדגם קליני ותאים אחרים של תדירות נמוכה) וגישות רצף. הוא מציע רזולוציה בסיסית-זוג בלוקוסים רלוונטיים מבחינה ביולוגית וניתן להשתמש בו באינטגרטיבית מנתח עם טכניקות אחרות פרופיל גורם הגנום שעתוק מחייב, שיפוץ הכרומטין, סימנים אפיגנטיים ושינויי ציטוזין אחרים בעלי עניין. שימוש בנתוני ERRBS במחקרים מסוג זה יכול לתרום לגישה מולקולרית מקיפה ולאפשר לממדים גבוהים ניתוחים במחקר של מודלים ביולוגיים ומחלות של בני אדם.

מתילציה DNA בציטוזין (5-methylcytosine) היא סימן אפיגנטיים קריטי בתאי יונקים עבור מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל אך לא מוגבל להחתמה, איון כרומוזום X, פיתוח, ורגולציה של ביטוי גני 1-8. המחקר של דפוסי מתילציה DNA בממאירים ואחרות הפרעות קבע דפוסים מסוימים מחלה ותרם להבנה של היווצרות מחלה ותגליות סמן ביולוגי פוטנציאליות 9-17. יש פרוטוקולים רבים שחקרו את epigenome למעמד מתילציה DNA. אלה יכולים להיות מחולקים הלמבוססים על זיקה, המבוסס אנזים הגבלה, ומבחנים מבוססי המרת bisulfite לנצל פלטפורמות microarray או רצף במורד הזרם. יתר על כן, יש כמה פרוטוקולים שלגשר קטגוריות הכלליות אלה כוללים, אך לא מוגבלים ל, ניתוח הגבלת Bisulfite משולב 18 וצמצום ייצוג Bisulfite רצף (RRBS 19). </p&gt; RRBS תואר במקור על ידי et al מייסנר. 19,20. הפרוטוקול הציג צעד להעשיר אזורים הגנומי GC-העשיר ואחריו רצף bisulfite, שהביא לנתונים ברזולוציה בסיס-זוג כמותי שהוא עלות אפקטיבית 21,22. אזורי GC העשיר ממוקדים על ידי אנזים הגבלת MspI (C ^ CGG), ומתילציה ציטוזין נפתרה על ידי המרת bisulfite של cytosines (דיאמינציה של cytosines ללא שינוי לאורציל), ואחריו תגובת השרשרת של פולימראז הגברה (PCR). RRBS כיסה את רוב יזמי גן ואיי CPG בשבריר של הרצף הדרוש לגנום שלם; היה לי עם זאת RRBS כיסוי מוגבל של חופי CPG ואזורים חוץ-אחרים רלוונטיים ביולוגי. כמה קבוצות פרסמו מעודכנות פרוטוקולי RRBS מאז הדוח המקורי שלשפר את המתודולוגיה וכיסוי כתוצאה של אזורים הגנומי אלה 23-25. משופר ייצוג מופחת Bisulfite Sequencing (ERRBS) כולל שינויי ספריית הכנה ויישור נתונים חלופי גישה 26 בהשוואה לRRBS. ERRBS הביא מספר גבוה יותר של CpGs המיוצג בנתונים שנוצרו וגדל כיסוי של כל האזורים הגנומי נחקר 26. שיטה זו נעשתה שימוש כדי לפתור דפוסי מתילציה DNA במטופל אדם ודגימות בעלי חיים אחרים 26-30. פרוטוקול ERRBS תאר פרטי הצעות על כל צורך להשלמה ולנתונים שנוצרו באמצעות DNA האנושי נציג הצעדים (דגימות נלקחו מדגימות שדווחו בעבר, מזוהה de חולה 31, ודגימת מוח CD34 + עצם מתורם אנושי נורמלי). הפרוטוקול כולל תהליך אוטומטי גודל בחירה, אשר מפחית את זמן עיבוד לדגימה ומאפשר לדיוק מוגבר בבחירת גודל ספרייה. הפרוטוקול משלב סדרה של טכניקות ביולוגיה מולקולריות הוקמו. DNA משקל המולקולרי הגבוה מתעכל wה- i-אנזים הגבלת מתילציה רגישה (MspI) ואחריו הסוף-תיקון, A-עוקב, וקשירה של מתאמים מפוגלים. בחירת גודל של שברי GC-העשיר ואחריו המרה bisulfite והגברת PCR לפני הריצוף. המרת Bisulfite כבר בעבר תיארה 32 וסקירה מפורטת של ניתוח נתונים ויישומים היא מעבר להיקף של מאמר זה, עם זאת המלצות והפניות כלולות לשימושם של הקוראים. הפרוטוקול יכול להתבצע על פני ארבעה ימים, והוא ניתן לקלט קטן (50 ng או פחות) בסכומים מהותיים. הפרוטוקול כנתונים תשואות מתוארות עם כיסוי גבוה לאתר CPG מספיק לא רק לקביעות אתר מתילציה ואזור ההפרש אלא גם לזיהוי פולימורפיזם אפיגנטיים כפי שתואר על ידי לנדן, et al. 33.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:497px;">URL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">MspI</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">R0106M</td>
			<td style="width:193px;">100,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/r0106-mspi</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">NEBuffer 2</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B7002S</td>
			<td style="width:193px;">Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:269px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P4557</td>
			<td style="width:193px;">Equilibrated with 10&#160;mM Tris HCl, pH&#160;8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C2432</td>
			<td style="width:193px;">See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Glycogen</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">G1767</td>
			<td style="width:193px;">19-22 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">NaOAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td style="width:193px;">3M pH 5.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E7023</td>
			<td style="width:193px;">200 proof, for molecular biology</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Buffer EB</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">19086</td>
			<td style="width:193px;">10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T1503</td>
			<td style="width:193px;">prepare a 1M pH 8.5 solution</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T9285</td>
			<td style="width:193px;">Dilute to 1X buffer solution per manufacturer&#39;s recommendations</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B0202S</td>
			<td style="width:193px;">10X concentration</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">N0447L</td>
			<td style="width:193px;">10 mM each nucleotide</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0203L</td>
			<td style="width:193px;">3,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0210L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0201L</td>
			<td style="width:193px;">10,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28104</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 2.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;-deoxyadenosine 5&#39;-triphosphate (dATP)</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">U1201</td>
			<td style="width:193px;">100 mM</td>
			<td style="width:497px;">http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0212L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28004</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 3.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202M</td>
			<td style="width:193px;">2,000,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Methylation Adapter Oligo Kit</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td style="width:104px;">ME-100-0010</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:269px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:153px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63881</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use</td>
			<td style="width:497px;">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td style="width:104px;">CDF2010</td>
			<td style="width:193px;">with internal standards</td>
			<td style="width:497px;">http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Certified Low Range Ultra Agarose</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-3106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4415</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:193px;">10 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Loading Dye, Orange (6X)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7022S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpel&#160;Blade&#160;No.&#160;11</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&#38;tab=Items&#38;productId=11876776</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5001</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5030</td>
			<td style="width:193px;">Alternative for step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">Universal Methylated Human DNA Standard</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td>D5011</td>
			<td style="width:193px;">Used as bisulfite conversion control</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">FastStart High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">03553426001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:269px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:193px;">A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1</td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:104px;">5067-4626</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&#38;tabId=AG-PR-1069</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&#38;tabId=AG-PR-1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pippin Prep</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>GD-401-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq SBS Kit v3-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-401-3002</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">TruSeq RNA Sample prep</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td style="width:193px;">Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol</td>
			<td style="width:497px;">http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Block Heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Electrophoresis power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel doc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">UV or blue light transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution

מיפוי תבנית המתילציה של הדנ&quot;א הוא למד בכבדות ברקמות בריאות וחולות. מגוון רחב של שיטות הוקמו כדי לחקור את דפוסי מתילציה ציטוזין בתאים. ייצוג מופחת של רצף הגנום כולו bisulfite פותח כדי לזהות דפוסי מתילציה ציטוזין הרזולוציה זוג בסיס הכמותי בלוקוסים הגנומי GC-עשיר. המטרה זו מושגת על ידי שילוב של השימוש באנזים הגבלה ואחרי המרת bisulfite. משופר ייצוג מופחת Bisulfite רצף (ERRBS) מגדיל את הלוקוסים הגנומי רלוונטיים מבחינה ביולוגית המכוסים ומאז משמש לפרופיל מתילציה ציטוזין בDNA מאדם, עכבר ואורגניזמים אחרים. ERRBS יוזם עם עיכול אנזים הגבלה של DNA כדי ליצור שברי משקל מולקולריים נמוכים לשימוש בהכנת ספרייה. שברים אלה נתונים לבניית ספרייה סטנדרטית עבור סידור הדור הבא. המרת Bisulfite של cytosines unmethylated לפני amplificati הסופיבצעד מאפשר רזולוציה בסיס כמותי של רמות מתילציה ציטוזין בלוקוסים הגנומי מכוסים. הפרוטוקול ניתן להשלים בתוך ארבעה ימים. למרות מורכבות נמוכות בשלושת הבסיסים הראשונים רצף, ספריות ERRBS להניב נתונים באיכות גבוהה בעת שימוש בנתיב שליטת רצף מיועד. ניתוח מיפוי וביואינפורמטיקה מתבצע לאחר מכן ונתוני תשואות שניתן לשלב בקלות עם מגוון רחב של פלטפורמות הגנום. ERRBS יכול לנצל כמויות חומר הזנה קטנות שהופך אותו אפשרי על מנת לעבד דגימות קליניות בבני אדם וישימים במגוון רחב של יישומי מחקר. הסרטון שהופק מדגים שלבים קריטיים של פרוטוקול ERRBS.

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution at JoVE.com

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Views.  Weill Cornell Medical College. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Video: Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

הפגנות חומרת הסביבה מופחתת כובד של טכנולוגיה cytometer זרימה וCompanion Microfluidic אב טיפוס מוקטנת ערבוב

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ&quot;א עם Precision סמוך לבסיס זוג

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...