We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

実行されるすべての手順は、医療機関動物実験委員会のインディアナ大学大学院によって承認され、健康ガイドラインの国立研究所に従っている。 1.手術手技<ol><li> NIHガイドライン25に従って無菌滅菌手袋を使用して、この手順の間に技術、機器、および無菌手術野を維持します。 （完全なリストに特異的な試薬/機器の表を参照）、それらをオートクレーブで手術を開始する前に、ツールを滅菌する。動作中のツールを殺菌するためにガラスビーズ滅菌器を使用してください。 </li></ol> 2.麻酔と準備<ol><li>獣医イソフルラン気化器システムを用いて、0.9リットル/分の酸素と2.5％のイソフルランの混合物で麻酔ボックス内にマウスを麻酔。マウスを箱から取り出す前に、身体の位置の変化に応答しないことを確認してください。 </li><li> MOUに眼軟膏を適用します乾燥からそれらを保護するために、それ自体の目。 </li><li>ノーズコーンにあるボックスからのガスの流れを切り替えます。コー​​ンの内側の鼻と口を備えた外科用パッドと吸収ベンチ紙で覆われて加熱されたパッドの上に真正面からその左側にマウスを置きます。継続的にマウスの呼吸のリズムと速度を監視し、必要に応じてイソフルランレベルを調整 - 麻酔の適切なレベルを維持するために、（2.5の間で3％イソフルラン）、および総鎮静を確認するために、つま先ピンチ反射を使用しています。 </li></ol> 3.外科的アプローチ<ol><li>合わせて、手術野でステレオスコープを集中。それは視野の端に沿って配置されるように、ノーズコーンとテープを上下に調整する。 </li><li>マウスは、その左側に横たわっていると、切開が行われる耳の後ろの領域を露出させ、ノーズコーンに右耳の端をテープで固定します。後耳介静脈が耳全体に水平に移動することを確認してください。 Tの正しい配置に注意してください彼は耳の動物とテーピングはすぐに顔面神経を見つけるために重要である。 </li><li>にし、70％エタノールで耳の後ろに毛皮を湿らせ、かみそりまたは外科用メスの刃を使用して、手術部位を剃る。毛皮を事前に湿潤この解剖学的位置に簡単に剃ることができます。 </li><li> 70％エタノールに続くようなベタジン外科スクラブ（7.5％ポビドンヨード）などのヨウ素溶液、で皮膚をきれいにしてください。徹底的に領域を消毒するために、この清掃をさらに2回繰り返します。 </li><li> 、切開する耳の突起にエリア後方に尾側耳から後耳介静脈をトレースする場所を決定する。隆起に3ミリメートルの後部 - 春のはさみを使用して、4ミリメートル切開2を作る。 </li><li>鈍的切開を使用して皮下脂肪および筋膜を通して解剖。 、血管または筋肉組織を簡単に破損する可能性があるため、ハサミで直接切断しないでください。 </li><li>出血が発生した場合は、無菌の綿棒で手術部位に圧力を適用する少なくとも30秒間。重要な流体損失が発生した場合、25または27 G針を使用して0.9％滅菌生理食塩水までの0.5mlを腹腔​​内にマウスを注入する。 </li><li>顔面神経を見つけるために、いくつかの主要なランドマーク、脊髄副神経、外耳道を使用し、（後述）二腹筋を前方。顔面神経の枝が可視化されるまで、これらのランドマークの周りに解剖。それは明らかにし、筋膜の層が下にある構造に付着されたときに神経が重要な白色固体構造として表示されます。 <ol><li>皮下脂肪と筋膜が解剖された後、僧帽筋を支配するために頭蓋骨の尾の部分から移動する脊髄副神経を検索します。顔面神経は、脊髄アクセサリ神経に深い。 </li><li>真珠のような白に見え、顔面神経への吻側見ることができる軟骨外耳道を探す。 </li><li>の上部とC上に位置し、前二腹筋の筋腹を探す顔面神経にaudal。 </li></ol></li><li>顔面神経の主枝を可視化されると、茎乳突孔からその起源を見つけるために背側にそれらをトレースします。細かい使用すると、開いて新しく高度な面積を維持するために背側鉗子を移動した後、開いた手術部位を保持する神経のパス以下の春のはさみのヒントを進めるためにデュモン鉗子＃45分の5をひっくり返した。 </li><li>この時点で、頬骨と顔面神経の幹、頬、および限界下顎枝を可視化する。 注：一時的な分岐が孔に近い見つかります。近い顎にその上下に限界下顎神経の枝、従って、これらの神経枝は、このレベルでは表示されません。 <ol><li>神経切断を行う場合は、先端の細い鉗子で軽く神経を安定させ、春のはさみで神経を切った。脳幹から神経をavulsing防ぐために、ピンセットで神経にあまりにも多くのトラクションを適用することは避けてください。押す互いに離れる切り株、または全く再接続が発生しないことを保証するために、遠位神経の部分をカットし、削除する。 </li><li>挫滅損傷を実行した場合は、すべての軸索を切断する一定の圧力を用いて30秒間の神経を圧縮するデュモン＃45分の5鉗子を使用し、最初のクラッシュサイトに直交する第2の角度でこのクラッシュを繰り返します。そうでなければ怪我は動物の間一貫性がなくなります、30秒のクラッシュ時の圧力の可変量を適用することは避けてください。 </li></ol></li></ol> 4.閉会と回復<ol><li>下にある構造上の脂肪と筋肉を再配置します。 </li><li>切開のエッジを近似すると7.5ミリメートルの創傷クリップを使用して傷を閉じます。縫合糸または接着剤は、創傷閉鎖のためにも許容される。術後の鎮痛薬は、この時点で提供することができる。 </li><li>マウスの耳からテープを外します。イソフルランの流れをオフにして、マウスが1分30秒純酸素を呼吸することができます。 PL麻酔から回復する寝具で空のケージにマウスをエース。 </li><li>マウスが回復されると、顔面神経麻痺の確証的兆候がその挙動を調べる。ウィスカーが麻痺して戻って頬に向かって傾斜してなり、鼻がずれてしまう、との目は、空気のパフに応じて点滅しません。 </li><li>ハウス動物共同で、彼らが女性である場合は、手術後。彼らはより積極的であり、強制的に感染につながる、彼らのcagemateの創傷クリップを削除する傾向があるため、共同で雄マウスを収納しないでください。必要であれば、この時点では術後の鎮痛薬を提供します。 </li><li>全く感染または他の合併症は術後に発生していないことを確認するために操作した後、数日間一日一回のマウスを監視します。彼らは自分の上で落ちていない場合は、10日手術後 - 7創傷クリップを外します。 </li><li>目のまばたき反射が再いずれかになるまで、毎日の角膜合併症を防ぐために、罹患した眼に眼軟膏を潤滑適用カバーまたは安楽死まで、。 </li></ol>

著者らは、開示する利害の競合がない。

生体関連ゲノム領域におけるシトシンのメチル化のプロトコル提示収量の塩基対解像度データ。出発物質の50 ngのために最適化されて書かれたプロトコルは、しかし、それは、入力材料の範囲（5ngのまたは複数）26を処理するように適合させることができる。 表6に見られるように、これは、プロトコルのステップのいくつかの調整が必要となる。ERRBSライブラリはペアエンド配列決定およびさらなるゲノムカバーに適しているシング長い51サイクルより読み込むことによっても達成することができる。多重化された配列決定は、サンプルあたりのコストプロトコルを提供するが、これはデータに表さCpG部位当りの縮小範囲（ 図5および表8）になり、かつ当たり高いカバー力を必要とする分析を実行するために、カバレッジの十分な深さが得られないであろうCpG部位（Landan ら 33で説明した例のように）。最後に、このプロトコル（または重亜硫酸塩ベースのprotocol）はメチル-シトシンとヒドロキシメチルシトシン46,47を区別することができません。しかしながら、他のプロトコルと統合することができる生成されたデータは、異なる修飾を線引きする48,49をもたらし、他のシトシン修飾は最近、関心があるべきであり、50を報告した。 図3A-Cに示されており、一回シークエンシングのためにプールのような高品質のライブラリが表示されます両方のライブラリ留分から等しいモルの寄与を表す図3Gに示すようにトレース（赤トレース）が得られる。ライブラリ調製障害は手順中の任意の工程から生じ得る。分解したDNAが処理される場合は、このプロトコルで説明シングパラメータを使用してのMspI断片が濃縮され、したがって、低いのCpGカバレッジされていないライブラリになります。酵素は、非機能的または不注意の反応のいずれかから除外された場合、プロトコルが期待ライブラリをもたらさないであろう。ライゲーションREAた場合ctionは非効率的であり、アダプタは、予想よりも高濃度であり、および/または使用したプライマー濃度は、ライブラリー、障害が発生することができ、最終的な増幅工程のための制限試薬である。 （バイオアナライザ結果の〜150 bpのピークと見られ; 図3D-F）過剰アダプタは、ライブラリ内にも、ライブラリと過剰のアダプターの両方の無差別クラスタリングにシークエンシングを妨害する。そのようなライブラリは、明らかに正常にシーケンスかもしれないが、読み込みのかなりの部分は、単にアダプタのシーケンスになります。過剰のアダプタがライブラリに認められた場合、それは材料が数量比をアダプタために最適な入力素材を使用して利用可能な場合、ライブラリの準備を繰り返すのがベストです。最後に、ライブラリの効率的なPCR増幅を確実にするために、より低いおよびより高いライブラリ画分を亜硫酸水素塩変換し、PCR濃縮ステップを通して別々の試料として維持されている。これを怠ると、Pの間に、増幅の微分効率を生み出すのCR（ 図3G青のトレースに見られるように）上位と下位画分の反応および配列決定の際に、各ライブラリの画分に覆われたそれぞれのゲノム遺伝子座の不均等な表現の可能性。ユーザーがすぐに生成されているライブラリーを増幅するために必要な最適なPCRサイクルのさらなる滴定亜硫酸水素塩変換後に定量的PCRステップを含むように選択してもよい。 ERRBSライブラリ調製プロトコルは、特定の試薬が推奨されているいくつかの重要なステップがあります。エンドリペア工程では、四ヌクレオチドdNTPミックスの使用は、MspIで酵素スター活性に起因するものと、元のDNAサンプルに存在する剪断DNA断片として、CGオーバーハングを含有していない製品の最終修復を可能にする。これが結果に改善されたのCpG表現になる。連結工程では、ライゲーションをReactiことを保証するために高濃度リガーゼ（200万単位/ ml）およびメチル化アダプターを使用することが重要である上は効率的であり、亜硫酸水素塩変換が正確なデータの位置合わせのための不可欠なアダプター配列に影響しないこと。 PCR工程では、亜硫酸水素塩処理したGCリッチなDNA断片を増幅することができるポリメラーゼを用いて、高い特異性のために必要である。最後に、過剰のアダプターおよびプライマーの除去を確実にするために、（例：アジェンコートAMPure XP）SPRIビーズ精製は、連結およびPCR産物の単離のために列に基づいたアッセイではなく、推奨されます。 高品質のデータを生成するためには、効率的な亜硫酸水素塩変換を保証することが重要である。提示制御は、ユーザーにシークエンシングに先立って変換効率を決定する能力を提供しています。代替として、そのようなラムダDNAなどの非ヒトDNA、内部対照（スパイクイン）として使用することができる。による種の違いにより、このタイプの制御は、直接下流の配列決定に含めることができる（ 例えば、ユーによって使用されるような、 ら 34）。しかし、スパイク-iの場合利用sの、それを一意に増幅され、独立して、ライブラリーの配列決定の前に配列決定されない限り、ライブラリの配列決定に先立って変換効率を決定するために使用することができない。決定された換算率は、非CpG部位でのメチル化状態に基づいている。これは、非CpGコンテキストで高いシトシンメチル化の文脈で使用するのに適切でないかもしれない（例えば、胚性幹細胞）と平行サンプルまたは変換効率を評価する他の手段は、この目的のために利用することができる。 ERRBSライブラリの配列に固有であるアドレスには、いくつかの注意事項があります。配列決定されたライブラリの画分の最初の3つの塩基が原因のMspI認識切断部位にほぼ一様に非ランダムである（C ^ CGG; 図4B、Cを参照のこと）。低い品質に重要なデータの損失の可能性で、この結果は、シークエンシング時に見かけ上高いクラスター密度にもかかわらず、貧しいクラスタのローカリゼーションの結果を読み込みます。この障壁を克服するために、専用の制御​​車線として独立したレーン（PHIX制御や他のライブラリタイプ）の高い複雑さのライブラリが含まれています。高い複雑さのライブラリーは、配列決定され、最初の4つの塩基は、A、C、TおよびGのバランスの表現を含む端部を有する。適切なコントロールレーンは、RNA-seqの、チップ配列、全ゲノム配列決定、または配列決定機メーカー（ 例えば PHIXコントロールV3）によって提供されるコントロールなどのライブラリが含まれています。各配列決定実行の対照レーンとして指定する場合は、クラスタの位置を検出するために配列決定の最初の4つの塩基の間に利用される行列生成のための基礎として役立つことができる。高い品質が5.2によりCpG部位あたりの平均カバレッジを上げる（n = 4）をしますキャプチャさ読み込む。代替的に、この技術的な困難は、以前23に記載のようにダーククエンシングアプローチを用いて克服することができる。その他のシーケンシング基準は製造業者のプロトコルごとの標準操作手順に従ってください。のCpG Cあたりの最後に、報道データ分析のための芳泉は、目的の生物学的質問によってユーザによって部分的に案内される。 10倍のカバレージ閾値は、関心のものであるべきであるが、このしきい値を下げることができ、高いカバレッジ分析アプローチを与える。 ERRBSデータ解析の完全な議論はしかし、差別的メチル化シトシンと地域は、オープンソースツール31,51-53を用いて決定することができる、この記事の範囲を超えています。追加の分析の考慮事項とアプローチは54,55を十分に記載されており、読者は計画された分析に最も適切なツールについての文献を検索することが奨励されている。 他の公開方法と比較して、ERRBSは再現性の記載された歩留まり率が高いように行う4日間のプロトコルを提供しています。それのMassARRAY EpiTYPER 26標準金に比べて検証された、費用対効果の高いカバレッジデータ用であり、各種の入力材料に適応可能であるおよび配列決定アプローチ（臨床サンプル処理及び他の低周波の細胞型に有利な）量。これは、ゲノムワイドな結合転写因子、クロマチンリモデリング、エピジェネティックマークと関心のある他のシトシン修飾プロファイリング他の技術と分析、生物学的に関連する遺伝子座での塩基対の分解能を提供し、統合的に使用することができる。データがこのような研究で使用ERRBSは、総合的な分子的アプローチに貢献し、生物学的なモデルとヒト疾患の研究では、高次元解析を可能にすることができる。

シトシン（5-メチル）におけるDNAメチル化インプリンティング、X染色体不活性化、開発、および遺伝子発現1-8の調節を含むがこれらに限定されない生物学的過程、種々の哺乳動物細胞において重要なエピジェネティックなマークである。悪性および他の疾患におけるDNAメチル化パターンの研究は、疾患特異的パターンを決定し、疾患の病因と潜在的なバイオマーカーの発見9-17の理解に貢献してきました。 DNAのメチル化状態のためのエピゲノムを調べる多くのプロトコルがある。これらは、親和性に基づく、制限酵素ベース、および下流マイクロアレイまたは配列決定プラットフォームを利用して亜硫酸水素塩変換ベースのアッセイに分けることができる。さらに、複合重亜硫酸塩制限分析18および減少表現重亜硫酸塩シークエンシング（のCFM.rrb 19）、を含むがこれらに限定されますが、いないこれらの一般的なカテゴリを埋めるいくつかのプロトコルがあります。 </P&gt; のCFM.rrbはもともとマイスナーらによって記載された。19,20。プロトコルは、費用対効果の高い21,22で定量的な塩基対の解像度データが得られた重亜硫酸塩シークエンシング、続くGCリッチなゲノム領域を豊かにする手順を紹介しました。 GCに富む領域はMspIを（C ^ CGG）制限酵素によって標的化される、およびシトシンのメチル化は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、続いてシトシンの重亜硫酸塩変換（ウラシルに修飾されていないシトシンの脱アミノ化）によって解決される。のCFM.rrbは、遺伝子のプロモーターおよび全ゲノム配列決定のために必要な画分におけるCpGアイランドの大部分をカバー。しかしのCFM.rrbは、CpGの海岸と生物学的関連性の他の遺伝子間領域の限られた範囲を持っていた。いくつかのグループは、これらのゲノム領域23-25 ​​の方法論と結果の報道に改良元のレポート以降に更新のCFM.rrbプロトコルを公開している。強化されたの減少表現重亜硫酸塩Sequencing（ERRBSは）のCFM.rrbに比べライブラリ準備の修正および代替データ整列アプローチ26を含む。 ERRBSは生成されたデータで表現CpGの高い数をもたらし、26を尋問すべてのゲノム領域のカバレッジを増加させた。この方法は、ヒト患者及び他の動物標本26-30におけるDNAメチル化パターンを解決するために使用されている。 ERRBSプロトコルが完了し、代表的なヒトDNAを使用して生成されたデータに必要なすべてのステップにオファーの詳細を説明した（サンプルは、以前に報告され、非識別患者サンプル31から得られ、正常なヒトのドナーからのCD34 +骨髄サンプルされた）。プロトコルは、サンプルあたりの処理時間が短縮され、ライブラリーサイズの選択において高い精度を可能にする自動化されたサイズ選択プロセスを含む。プロトコルは、確立された分子生物学技術のシリーズを組み合わせた。高分子量DNAはワット消化エンド修理、-テーリング、およびメチル化されたアダプターの連結に続いてメチル化非感受性制限酵素（MspIで）i番目。 GCリッチフラグメントのサイズ選択は、亜硫酸水素塩変換し、配列決定の前にPCR増幅に続いている。重亜硫酸塩変換は、以前に32に記載されているとデータ分析やアプリケーションの詳細なレビューはお薦めや参照が読者の使用のために含まれていますが、この論文の範囲を超えている。プロトコルは、4日間にわたって行われ、小さな入力（50 NG以下）材料量に適していることができます。差動メチル化部位と領域決定のためだけでなく、エピジェネティックな多型検出のためだけでなく、十分なCpG部位当りの高いカバレッジ記載収量データなどのプロトコルは、 ら 33 Landanに記載されているように。

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100,000 units/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2</td></tr><tr><td>Phenol solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Equilibrated with 10&amp;nbsp;mM Tris HCl, pH&amp;nbsp;8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5.2</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, for molecular biology</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>prepare a 1 M, pH 8.5 solution</td></tr><tr><td>Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Dilute to 1x buffer solution per manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10x concentration</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM each nucleotide</td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3,000 units/ml</td></tr><tr><td>DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5,000 units/ml</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Used for DNA product purification in protocol step 2.3</td></tr><tr><td>2&#039;-deoxyadenosine 5&#039;-triphosphate (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;&amp;rarr;5&#039; exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5,000 units/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Used for DNA product purification in protocol step 3.3</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2,000,000 units/ml</td></tr><tr><td>Methylation Adapter Oligo Kit</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use.</td></tr><tr><td>Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>with internal standards</td></tr><tr><td>Certified Low Range Ultra Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, Orange (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;Blade&amp;nbsp;No.&amp;nbsp;11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Used in protocol step 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternative for step 6.2</td></tr><tr><td>Universal Methylated Human DNA Standard</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>Used as bisulfite conversion control</td></tr><tr><td>FastStart High Fidelity PCR System</td><td>Roche</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Sample prep</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Block Heater</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power supply</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV or blue light transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution

DNAメチル化パターンのマ​​ッピングが重く正常および疾患組織中で検討されている。種々の方法は、細胞中のシトシンメチル化パターンを調べるために確立されている。全ゲノムバイサルファイトシークエンシングの減少表現は、GCリッチなゲノム遺伝子座での定量的な塩基対の分解能シトシンメチル化パターンを検出するために開発された。これは、亜硫酸水素塩変換に続いて、制限酵素の使用を組み合わせることによって達成される。強化縮小表現重亜硫酸塩シークエンシング（ERRBS）が覆われ、生物学的に関連するゲノム遺伝子座を増加し、ヒト、マウス、および他の生物由来のDNA中のシトシンのメチル化をプロファイルするために使用されている。 ERRBSは、ライブラリーの調製において使用するための低分子量フラグメントを生成するために、DNAの制限酵素消化を開始する。これらの断片は、次世代配列決定のための標準ライブラリ構築にかけられる。最終amplificati前の非メチル化シトシンの重亜硫酸塩変換ステップに覆われたゲノム遺伝子座におけるシトシンのメチル化レベルの定量的なベースの解像度を可能にします。プロトコルは、4日以内に完了することができる。指定されたシーケンシング対照レーンを使用した場合、配列決定最初の3つの塩基で低複雑度にもかかわらず、ERRBSライブラリは、高品質のデータを得る。マッピングおよびバイオインフォマティクス解析は、次に実行され、歩留まりのデータを容易にゲノムワイドな様々なプラットフォームと一体化することができる。 ERRBSは、実現可能な研究用途の範囲内で、ヒト臨床サンプルおよび適用を処理すること小さな入力材料量を利用することができる。生成されたビデオは、ERRBSプロトコルの重要なステップを示しています。

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Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

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Biology

25.4K ビュー.  Weill Cornell Medical College. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

遺伝学

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these animal models. The rat is one particular model animal where an epigenetic tool can complement many pharmacological and behavioral studies to provide insightful mechanistic information. To this end, we adapted the SureSelect Target Capture System (referred to as Methyl-Seq) for the rat, which can assess DNA methylation levels across the rat genome. The rat design targeted promoters, CpG islands, island shores, and GC-rich regions from all RefSeq genes. 
To implement the platform on a rat experiment, male Sprague Dawley rats were exposed to chronic variable stress for 3 weeks, after which blood samples were collected for genomic DNA extraction. Methyl-Seq libraries were constructed from the rat DNA samples by shearing, adapter ligation, target enrichment, bisulfite conversion, and multiplexing. Libraries were sequenced on a next-generation sequencing platform and the sequenced reads were analyzed to identify DMRs between DNA of stressed and unstressed rats. Top candidate DMRs were independently validated by bisulfite pyrosequencing to confirm the robustness of the platform.
Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is a useful epigenetic tool that can capture methylation changes induced by exposure to stress.

Here, we describe the protocol and implementation of Methyl-Seq, an epigenomic platform, using a rat model to identify epigenetic changes associated with chronic stress exposure. Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is capable of detecting methylation differences that arise from stress exposure in rats.

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラット メチル Seq プラットフォーム

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

生化学

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

神経科学

Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid storage processes contributing to the development of the disease. We demonstrate a complete protocol from selection to epigenetic data analysis of patients with and without obesity. All steps from the protocol were tested and validated in a pilot study. 32 women participated in the study, in which 15 individuals were classified with obesity according to Body Mass Index (BMI) (45.1 &#177; 5.4 kg/m2); and 17 individuals were classified without obesity according to BMI (22.6 &#177; 1.8 kg/m2). In the group with obesity, 564 CpG sites related to fat mass were identified by linear regression analysis. The CpG sites were in the promoter regions. The differential analysis found 470 CpGs hypomethylated and 94 hypermethylated sites in individuals with obesity. The most hypomethylated enriched pathwayswere in the RUNX, WNT signaling, and response to hypoxia. The hypermethylated pathways were related to insulin secretion, glucagon signaling, and Ca2+. We conclude that the protocol effectively identified DNA methylation patterns and trait-related DNA methylation. These patterns could be associated with altered gene expression, affecting adipogenesis and lipid storage. Our results confirmed that an obesogenic lifestyle could promote epigenetic changes in human DNA.

The present study describes the workflow to manage DNA methylation data obtained by microarray technologies. The protocol demonstrates steps from sample preparation to data analysis. All procedures are described in detail, and the video shows the significant steps.

DNAメチル化のバイオインフォマティクス分析へのサンプル調製:肥満および関連形質研究の関連戦略

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

生物学

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

DNA Methylation Analysis

Methylation at CpG dinucleotides is a chemical modification of DNA hypothesized to play important roles in regulating gene expression. In particular, the methylation of clusters of methylation sites, called &#8220;CpG islands&#8221;, near promoters and other gene regulatory elements may contribute to the stable silencing of genes, for example, during epigenetic processes such as genomic imprinting and X-chromosome inactivation. At the same time, aberrant CpG methylation has been shown to be associated with cancer.In this video, the biological functions and mechanisms of DNA methylation will be presented, along with various techniques used to identify methylation sites in the genome. We will then examine the steps of bisulfite analysis, one of the most commonly used methods for detecting DNA methylation, as well as several applications of this technique.

DNA メチル化解析

Methylation at CpG dinucleotides is a chemical modification of DNA hypothesized to play important roles in regulating gene expression. In particular, the ...

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

要約

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この動画の章

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラットメチル Seq プラットフォーム

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

DNAメチル化のバイオインフォマティクス分析へのサンプル調製:肥満および関連形質研究の関連戦略

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

DNA メチル化解析

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