We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنفذها مدرسة جامعة إنديانا للطب المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة ومتابعة المعهد الوطني للصحة المبادئ التوجيهية. 1. تقنية جراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على تقنية العقيم أثناء هذا الإجراء باستخدام القفازات المعقمة، والصكوك، وحقل جراحي معقم وفقا للمبادئ التوجيهية NIH 25. تعقيم الأدوات قبل البدء في عملية جراحية قبل التعقيم لهم (انظر الجدول من الكواشف محددة / معدات لائحة كاملة). استخدام التعقيم الزجاج حبة لتعقيم الأدوات خلال العملية. </li></ol> 2. التخدير والتحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس في مربع التخدير مع خليط من 0.9 لتر / دقيقة الأكسجين و 2.5٪ الأيزوفلورين باستخدام نظام المرذاذ isoflurane البيطرية. تأكد من أن الماوس لا يستجيب للتغيرات في وضع الجسم قبل إزالته من مربع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم للعين لمذكرة التفاهمعيون حد ذاتها لحمايتها من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل تدفق الغاز من مربع إلى مخروط الأنف. ضع الماوس بشكل مباشر على جانبها الأيسر على وسادة ساخنة مغطاة سادة الجراحية ورقة ماصة مقاعد البدلاء مع أنفها والفم داخل مخروط. باستمرار مراقبة التنفس إيقاع الماوس، ومعدل وضبط مستويات الأيزوفلورين حسب الحاجة (مابين 2.5 - 3٪ الأيزوفلورين) للحفاظ على مستوى كاف من التخدير، واستخدام إصبع القدم قرصة رد الفعل لتأكيد الكلي التخدير. </li></ol> 3. المنهج الجراحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة والتركيز على المجسام مع الجراحي الميداني. ضبط مخروط الأنف والشريط عليه بحيث يتم وضعه على طول حافة المجال البصري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الماوس ملقاة على جانبها الأيسر، والشريط حافة الأذن اليمنى إلى مخروط الأنف، وتعريض منطقة خلف الأذن حيث سيتم إجراء شق. ضمان الوريد الأذني الخلفي يسافر أفقيا عبر الأذن. لاحظ أن الموضع الصحيح للرانه حيوان وتسجيل اللقطات من الأذن حاسمة من أجل العثور بسرعة على العصب الوجهي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب الفراء على وخلف الأذن مع 70٪ من الإيثانول ويحلق موقع الجراحية باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط شفرة. قبل ترطيب الفراء يجعل حلق أسهل في هذا الموقع التشريحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف البشرة مع محلول اليود، مثل بتدين فرك الجراحية (7.5٪ بوفيدون اليود)، تليها 70٪ من الإيثانول. كرر هذه التنظيف مرتين أخريين لتطهير شاملة للمنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد مكان لجعل شق، وتتبع الوريد الأذني الخلفي من الأذن نحو caudally إلى المنطقة الخلفية للالناشزة الأذن. باستخدام مقص الربيع، وجعل شق 4 مم 2-3 ملم الخلفي إلى الناشزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح من خلال الدهون تحت الجلد واللفافة باستخدام تشريح حادة. تجنب القطع المباشر مع مقص لأن الأوعية الدموية أو الأنسجة العضلية يمكن أن تتلف بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان النزيف يحدث، والضغط لموقع الجراحية مع مسحة القطن المعقمةلا يقل عن 30 ثانية. إذا كان يحدث فقدان السوائل كبيرة، وضخ الماوس البريتونى مع ما يصل إلى 0.5 مل من معقم 0.9٪ محلول ملحي باستخدام 25 أو 27 G الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام العديد من المعالم الرئيسية، العصب الشوكي التبعي، قناة الأذن، والأمامي عضلة ذات البطنين (موضح أدناه)، لتحديد موقع العصب الوجهي. تشريح حول هذه المعالم حتى يتم تصور فروع العصب الوجهي. ستظهر العصب كهيكل الأبيض الصلبة كبير عندما تبين وطبقة من اللفافة تلتزم إلى الهياكل الأساسية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عن العصب الشوكي التبعي، الذي يسافر من الجزء الذيلية من الجمجمة إلى يعصب العضلة شبه المنحرفة، مرة واحدة وقد تم تشريح الدهون تحت الجلد واللفافة. العصب الوجهي هو عميق في العصب الشوكي الإكسسوارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عن قناة الأذن الغضروفية التي تبدو بيضاء لؤلؤية ويمكن أن ينظر إليه منقاري إلى العصب الوجهي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على بطن عضلة عضلة ذات البطنين الأمامية التي تقع على رأس وجaudal إلى العصب الوجهي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم تصور الفروع الرئيسية من العصب الوجهي، وتتبع لهم ظهريا للعثور على أصلهم من الثقبة الإبرية الخشائية. باستخدام يميل غرامة دومون ملقط # 5/45 لعقد موقع الجراحية المفتوحة، تقدم النصائح الربيع مقص التالية مسار العصب، ثم نقل ملقط ظهريا للحفاظ على المنطقة المتقدمة حديثا مفتوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور جذع العصب الوجهي مع الوجني، الشدق، وفروع الفك السفلي هامشية في هذه المرحلة. ملاحظة: سيتم العثور فرع الزمني أقرب إلى الثقبة. فروع العصب الفك السفلي الهامشية إلى أجزائه العلوية والسفلية أقرب إلى الفك، وبالتالي هذه الفروع العصبية لن تكون مرئية على هذا المستوى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا يؤدون transection العصب، وتثبيت العصب بلطف مع ملقط غيض غرامة وقطع العصب مع مقص الربيع. تجنب تطبيق الكثير من الجر في العصب مع ملقط لمنع avulsing العصب من الدماغ. إدفعجذوعها بعيدا عن بعضها البعض، أو قطع وإزالة جزء من العصب البعيدة للتأكد من أن يمكن أن يحدث أي إعادة الاتصال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان أداء اصابة في سحق، استخدم دومون # 5/45 ملقط لضغط العصب لمدة 30 ثانية باستخدام الضغط المستمر لقطع جميع المحاور، ثم كرر هذا الزحام على زاوية الثانية عمودي على الموقع سحق الأول. تجنب استخدام كميات متفاوتة من الضغوط خلال سحق 30 ثانية، وإلا فإن الإصابة سوف تكون غير متناسقة بين الحيوانات. </li></ol></li></ol> 4. الإنتهاء والإنعاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الدهون والعضلات على الهياكل الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقريب حواف الجرح وإغلاق الجرح باستخدام 7.5 ملم الجرح كليب. الغرز أو الغراء هي أيضا مقبولة لإغلاق الجرح. ويمكن تقديم المسكنات بعد الجراحة في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريط من الأذن الفأر. إيقاف تدفق الأيزوفلورين والسماح الماوس لتنفس الأكسجين النقي لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة. ررالآس الماوس في قفص فارغ مع أي الفراش للتعافي من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم استرداد الماوس، ودراسة سلوكها عن علامات مؤكدة من شلل في الوجه. ستصاب بالشلل شعيرات والزاوية مرة أخرى نحو الخد، سيتم انحرف الأنف، وسوف العين لا وميض ردا على نفخة من الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حيوانات المنزل معا بعد الجراحة إذا كانت الإناث. تجنب تأوي الفئران الذكور معا لأنها أكثر عدوانية وتميل إلى إزالة قسرا مقاطع الجرح cagemate الخاصة بهم، الأمر الذي يؤدي إلى العدوى. تقديم المسكنات بعد الجراحة في هذا الوقت، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الفئران مرة واحدة يوميا لعدة أيام بعد العملية لضمان عدم وجود عدوى أو مضاعفات أخرى يحدث بعد العمل الجراحي. إزالة مقاطع الجرح 7 - 10 أيام بعد الجراحة إن لم تكن قد سقطت من تلقاء نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق التشحيم مرهم العين إلى العين المصابة يوميا لمنع مضاعفات القرنية، سواء حتى لا ارادي طرفة العين هو إعادةمغطاة أو حتى القتل الرحيم. </li></ol>

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

بروتوكول عرض البيانات قرار عائدات قاعدة زوج من السيتوزين مثيلة في المناطق الجينومية بيولوجيا ذات الصلة. بروتوكول كما هو مكتوب هو الأمثل لمدة 50 نانوغرام من المواد ابتداء، ومع ذلك، فإنه يمكن تكييفها للتعامل مع مجموعة واسعة من المواد المدخلات (5 نانوغرام أو أكثر) 26. وهذا سيتطلب تعديلات لبعض الخطوات البروتوكول كما رأينا في الجدول 6. والمكتبات ERRBS قابلة لليقترن التسلسل نهاية ومزيد من تغطية الجينومية ويمكن أيضا أن يتحقق عن طريق التسلسل يقرأ أطول من 51 دورات. تسلسل المضاعفة سوف نقدم بروتوكول تكلفة أقل لكل عينة، ولكن هذا سوف يؤدي إلى انخفاض تغطية لكل موقع الدليل السياسي الشامل ممثلة في البيانات (الشكل 5 والجدول 8)، وسوف لن تحقق عمق كاف من التغطية لإجراء تحليلات التي تحتاج إلى تغطية عالية في الموقع الدليل السياسي الشامل (على سبيل المثال كما وصفها Landan وآخرون. 33). وأخيرا، هذا البروتوكول (أو أي protoco القائم على بيسلفيتل) لا يمكن التمييز بين ميثيل السيتوزين وhydroxymethyl السيتوزين 46،47. ومع ذلك، فإن البيانات التي يمكن أن تكون متكاملة مع بروتوكول اخرى النتائج 48،49 لتحديد التعديلات مختلفة، والتعديلات السيتوزين أخرى ذكرت مؤخرا 50، ينبغي أن تكون ذات فائدة. ستظهر المكتبات ذات جودة عالية كما هو مبين في الشكل 3A-C، ومرة واحدة مجمعة للتسلسل ينتج أي أثر كما هو مبين في الشكل الجيل الثالث 3G (تتبع الأحمر) تمثل مساهمات المولي متساوية من كل من الكسور المكتبة. فشل إعداد مكتبة يمكن أن تنجم عن أي خطوة أثناء العملية. إذا تم معالجة DNA المتدهورة انه سيؤدي الى المكتبات التي لم يتم التخصيب في شظايا MspI وبالتالي في تغطية الدليل السياسي الشامل منخفضة باستخدام المعلمات التسلسل الوارد وصفها في هذا البروتوكول. إذا انزيم هو غير وظيفية أو استبعادها عن غير قصد من واحدة من ردود الفعل، فإن البروتوكول لن تسفر المكتبة المتوقع. إذا كان الجرمية ربطction غير فعالة، ومحولات هي بتركيز أعلى من المتوقع، و / أو تركيز الاشعال المستخدم هو كاشف الحد للخطوات التضخيم النهائية، يمكن أن يحدث فشل المكتبة. محولات الزائدة (ينظر إليها على أنها قمم في ~ 150 شركة بريتيش بتروليوم في نتائج bioanalyzer، الشكل 3D-F) في المكتبة سوف تتداخل أيضا مع التسلسل بسبب تجميع العشوائي للكل من المكتبة ومحولات الزائدة. وفي حين أن هذا قد مكتبة تسلسل يبدو عادة، وجزء كبير من يقرأ سيكون تسلسل محول مجرد. إذا لوحظ محولات الزائدة في مكتبة، فمن الأفضل أن يكرر إعداد مكتبة اذا المواد متاحة باستخدام مواد المدخلات المثلى لمحول نسب الكمية. وأخيرا، لضمان كفاءة التضخيم PCR من المكتبات، ويتم الاحتفاظ الكسور المكتبة الدنيا والعليا كعينات منفصلة في جميع أنحاء تحويل بيسلفيت والخطوات تخصيب PCR. عدم القيام بذلك ينتج كفاءة التفاضلية من التضخيم خلال Pرد فعل CR الكسور العليا والدنيا (كما رأينا في الشكل الجيل الثالث 3G أثر الأزرق) وإمكانية التمثيل غير العادل للمواضع الجيني المعنية المشمولة في كل جزء المكتبة خلال التسلسل. يمكن للمستخدم اختيار لتشمل خطوة PCR الكمي مباشرة بعد تحويل بيسلفيت لمزيد من المعايرة دورات PCR المثلى اللازمة لتضخيم المكتبات التي يتم توليدها. ERRBS بروتوكول إعداد مكتبة لديها العديد من الخطوات الرئيسية التي ينصح الكواشف محددة. في خطوة نهاية إصلاح، واستخدام مزيج dNTP أربعة النوكليوتيدات-يسمح للنهاية إصلاح أي منتجات لا تحتوي على عبء CG، مثل تلك الناجمة عن النشاط MspI نجوم الأنزيمية وشظايا الحمض النووي المنفصمة الموجودة في عينة DNA الأصلية. وهذا يؤدي إلى تحسين التمثيل الدليل السياسي الشامل في النتائج. في خطوة ربط فمن الأهمية بمكان أن استخدام يغاز تركيز عال (2،000،000 وحدة / مل)، ومحولات مميثل للتأكد من أن reacti ربطعلى غير كفاءة وأن تحويل بيسلفيت لا يؤثر على تسلسل محول الأساسية للدقيقة محاذاة البيانات. في خطوة PCR، وذلك باستخدام البلمرة قادرة على تضخيم-GC الغنية شظايا الحمض النووي المعالجة بيسلفيت هو ضروري لخصوصية عالية. وأخيرا، لضمان القضاء على محولات الزائدة والاشعال، سبري حبة تنقية (على سبيل المثال: Agencourt AMPure XP) يوصى بدلا من المقايسات مقرها عمود لربط والعزلة المنتج PCR. من أجل توليد بيانات عالية الجودة، من المهم لضمان كفاءة تحويل بيسلفيت. سيطرة قدمت وتقدم للمستخدم القدرة على تحديد كفاءة التحويل قبل التسلسل. وكبديل لذلك، وهو DNA غير البشرية مثل امدا DNA يمكن أن تستخدم بمثابة الرقابة الداخلية (ارتفاع في). بسبب الاختلافات في الأنواع، وهذا النوع من عنصر تحكم يمكن إدراجها مباشرة في التسلسل المصب (على سبيل المثال كما يستخدمه يو، وآخرون. 34). ومع ذلك، إذا أنا وارتفاع فيق المستخدمة، فإنه لا يمكن أن تستخدم لتحديد كفاءة التحويل السابقة لتسلسل مكتبة إلا إذا تضخمت بشكل فريد والتسلسل قبل التسلسل مكتبة مستقل. وتستند أسعار التحويل تحديدها عن حالة مثيلة في مواقع غير الدليل السياسي الشامل. هذا قد لا يكون مناسبا للاستخدام في سياق ارتفاع السيتوزين مثيلة في عدم الدليل السياسي الشامل للسياق (على سبيل المثال الخلايا الجذعية الجنينية) وعينات موازية أو غيرها من وسائل تقييم لكفاءة التحويل يمكن استخدامها لهذا الغرض. هناك بعض المحاذير إلى عنوان التي هي فريدة من نوعها لتسلسل المكتبات ERRBS. الأسس الثلاثة الأولى من الكسور مكتبة التسلسل هي تقريبا بشكل موحد غير عشوائية بسبب MspI الاعتراف الموقع قطع (C ^ CGG؛ انظر الشكل 4B، C). هذه النتائج في إمكانية فقدان البيانات الهامة نظرا لجودة منخفضة يقرأ الناجمة عن سوء توطين العنقودية على الرغم من كثافة واضحة العنقودية عالية خلال التسلسل. للتغلب على هذا الحاجز،تشمل مكتبة تعقيد عالية في حارة المستقلة (السيطرة PhiX أو غيرها من نوع المكتبة) كما حارة مخصصة للتحكم. المكتبات تعقيد عالية لها نهايات تحتوي على التمثيل المتوازن للA، C، T وG في أول أربع قواعد التسلسل. وتشمل الممرات السيطرة مناسبة المكتبات مثل RNA وما يليها، ورقاقة وما يليها، كله تسلسل الجينوم، أو عنصر تحكم المقدمة من قبل الشركة المصنعة آلة التسلسل (على سبيل المثال مراقبة PhiX V3). عندما توصف بأنها ممر السيطرة على المدى تسلسل منها، يمكن أن تكون بمثابة أساس للجيل المصفوفة التي استخدمت أثناء القواعد الأربعة الأولى من تسلسل للكشف عن مواقف المجموعة. جودة أعلى يقرأ اعتقلت سيرفع التغطية المتوسط ​​لكل موقع الدليل السياسي الشامل بنسبة 5.2 (ن = 4). بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن هذه الصعوبة الفنية يمكن التغلب عليها باستخدام نهج التسلسل الظلام كما هو موضح سابقا 23. معايير أخرى تتبع تسلسل إجراءات التشغيل القياسية في البروتوكولات المصنعة. وأخيرا، فإن التغطية في الدليل السياسي الشامل جستوجه هوزن لتحليل البيانات من قبل المستخدم وجزئيا على الأسئلة البيولوجية من الفائدة. 10X عتبة تغطية تتيح نهج تحليل التغطية العالية، ولكن هذه العتبة يمكن خفض يجب أن تكون ذات فائدة. مناقشة الكاملة لتحليل البيانات ERRBS هي خارج نطاق هذا المقال، ومع ذلك، تفاضلي cytosines والمناطق ميثليته يمكن تحديد باستخدام أدوات مفتوحة المصدر 31،51-53. تم اعتبارات التحليل إضافية والنهج وصفها جيدا 54،55، ويشجع القارئ للبحث في الأدب لأكثر الأدوات المناسبة لتحليل المخطط لها. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المنشورة، ERRBS يقدم البروتوكول لمدة أربعة أيام والتي عندما يؤديها كما غلة وصف ارتفاع معدلات التكاثر. تم التحقق من صحة ذلك مقارنة مع معيار الذهب MassARRAY EpiTYPER 26، هو للبيانات تغطية عالية فعالة من حيث التكلفة، وغير قابلة للتكيف لمختلف المواد المدخلاتكميات (مواتية لأنواع تجهيز العينات السريرية وخلية أخرى من التردد المنخفض) ونهج التسلسل. ويقدم قرار قاعدة الزوج عند مواضع ذات الصلة بيولوجيا، ويمكن استخدامها في تحليل تكاملية مع تقنيات أخرى التنميط الجينوم على نطاق عامل النسخ ملزمة، لونين إعادة عرض، وعلامات جينية والتعديلات السيتوزين الأخرى ذات الاهتمام. استخدام البيانات ERRBS في مثل هذه الدراسات يمكن أن تسهم في نهج شامل والجزيئية تسمح عالية الأبعاد يحلل في دراسة النماذج البيولوجية والأمراض التي تصيب البشر.

الحامض النووي في السيتوزين (5-ميثيل سيتوزين) هو علامة جينية حاسمة في خلايا الثدييات لمجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر يطبع، X كروموسوم تعطيل، والتنمية، وتنظيم التعبير الجيني 1-8. حددت دراسة أنماط الحامض النووي في اضطرابات الخبيثة وغيرها من أنماط محددة من الأمراض وساهمت في فهم المرض والتسبب في والاكتشافات العلامات البيولوجية المحتملة 9-17. هناك العديد من البروتوكولات التي استجواب epigenome للحصول على مركز الحامض النووي. ويمكن تقسيم هذه إلى أساس تقارب، المستندة إلى إنزيم التقييد، والمقايسات القائم على تحويل بيسلفيت التي تستخدم ميكروأري أو التسلسل منصات المصب. وعلاوة على ذلك، هناك عدد قليل من البروتوكولات التي سد هذه الفئات العامة بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، جنبا إلى جنب تحليل تقييد بيسلفيت 18 وخفض التمثيل بيسلفيت تسلسل (RRBS 19). </P&gt; وقد وصفت RRBS في الأصل من قبل ميسنر وآخرون 19،20. عرض البروتوكول خطوة لإثراء المناطق الجينومية-GC الغنية تليها التسلسل بيسلفيت، مما أدى إلى قرار الكمي بيانات قاعدة الزوج التي هي فعالة 21،22 التكلفة. وتستهدف المناطق GC الغنية التي MspI (C ^ CGG) انزيم التقييد، ويتم حل السيتوزين مثيلة عن طريق تحويل بيسلفيت من cytosines (نزع الأمين من cytosines معدلة لاليوراسيل)، تليها تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) والتضخيم. غطت RRBS غالبية المروجين الجين والجزر الدليل السياسي الشامل في جزء من تسلسل المطلوبة لالجينوم كله؛ وكان مع ذلك RRBS التغطية المحدودة للشواطئ الدليل السياسي الشامل والمناطق بين الأخرى ذات الصلة البيولوجية. وقد نشرت العديد من المجموعات تحديث بروتوكولات RRBS منذ التقرير الأصلي الذي تحسين بناء على منهجية والتغطية الناتجة من هذه المناطق الجينومية 23-25. تعزيز انخفاض التمثيل بيسلفيت Sequencing (ERRBS) يتضمن تعديلات إعداد مكتبة ومحاذاة البيانات البديلة نهج 26 بالمقارنة مع RRBS. أدى ERRBS في عدد أكبر من CpGs ممثلة في البيانات التي تم إنشاؤها وزيادة تغطية جميع المناطق الجينومية استجوبت 26. وقد استخدمت هذه الطريقة لحل أنماط الحامض النووي في المريض البشري والعينات الحيوانية الأخرى 26-30. وصف بروتوكول ERRBS تفاصيل العروض على جميع الخطوات اللازمة لاستكمال والبيانات تم إنشاؤها باستخدام الحمض النووي البشري ممثل (تم الحصول على عينات من ذكرت سابقا، والعينات التي تم تحديدها دي المرضى 31، وCD34 + العظام عينة نخاع من متبرع الإنسان العادي). ويتضمن البروتوكول عملية اختيار حجم الآلي، مما يقلل من الوقت اللازم لتجهيز لكل عينة ويسمح لزيادة الدقة في اختيار حجم المكتبات. بروتوكول يجمع سلسلة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية المعمول بها. يتم هضم عالية DNA الوزن الجزيئي ثإيث ل-مثيلة حساسة تقييد انزيم (MspI)، يليه نهاية إصلاح، A-المخلفات، وربط محولات مميثل. ويتبع اختيار حجم الشظايا-GC غنية عن طريق تحويل بيسلفيت PCR والتضخيم قبل التسلسل. وقد تم تحويل بيسلفيت سابقا ووصف 32 و استعراض مفصل لتحليل البيانات والتطبيقات خارج نطاق هذه الورقة، ومع ذلك يتم تضمينها التوصيات والمراجع للاستخدام القراء. لا يمكن أن يؤديها البروتوكول على مدى أربعة أيام وغير قابلة للمدخلات صغير (50 نانوغرام أو أقل) كميات المواد. بروتوكول كما غلة وصف البيانات مع تغطية عالية لكل موقع الدليل السياسي الشامل كافية ليس فقط لموقع مثيلة والمنطقة التفاضلية قرارات ولكن أيضا للكشف عن تعدد الأشكال جينية كما وصفها Landan، وآخرون. 33.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:497px;">URL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">MspI</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">R0106M</td>
			<td style="width:193px;">100,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/r0106-mspi</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">NEBuffer 2</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B7002S</td>
			<td style="width:193px;">Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:269px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P4557</td>
			<td style="width:193px;">Equilibrated with 10&#160;mM Tris HCl, pH&#160;8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C2432</td>
			<td style="width:193px;">See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Glycogen</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">G1767</td>
			<td style="width:193px;">19-22 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">NaOAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td style="width:193px;">3M pH 5.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E7023</td>
			<td style="width:193px;">200 proof, for molecular biology</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Buffer EB</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">19086</td>
			<td style="width:193px;">10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T1503</td>
			<td style="width:193px;">prepare a 1M pH 8.5 solution</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T9285</td>
			<td style="width:193px;">Dilute to 1X buffer solution per manufacturer&#39;s recommendations</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B0202S</td>
			<td style="width:193px;">10X concentration</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">N0447L</td>
			<td style="width:193px;">10 mM each nucleotide</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0203L</td>
			<td style="width:193px;">3,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0210L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0201L</td>
			<td style="width:193px;">10,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28104</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 2.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;-deoxyadenosine 5&#39;-triphosphate (dATP)</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">U1201</td>
			<td style="width:193px;">100 mM</td>
			<td style="width:497px;">http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0212L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28004</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 3.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202M</td>
			<td style="width:193px;">2,000,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Methylation Adapter Oligo Kit</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td style="width:104px;">ME-100-0010</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:269px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:153px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63881</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use</td>
			<td style="width:497px;">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td style="width:104px;">CDF2010</td>
			<td style="width:193px;">with internal standards</td>
			<td style="width:497px;">http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Certified Low Range Ultra Agarose</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-3106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4415</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:193px;">10 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Loading Dye, Orange (6X)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7022S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpel&#160;Blade&#160;No.&#160;11</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&#38;tab=Items&#38;productId=11876776</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5001</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5030</td>
			<td style="width:193px;">Alternative for step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">Universal Methylated Human DNA Standard</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td>D5011</td>
			<td style="width:193px;">Used as bisulfite conversion control</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">FastStart High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">03553426001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:269px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:193px;">A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1</td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:104px;">5067-4626</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&#38;tabId=AG-PR-1069</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&#38;tabId=AG-PR-1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pippin Prep</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>GD-401-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq SBS Kit v3-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-401-3002</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">TruSeq RNA Sample prep</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td style="width:193px;">Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol</td>
			<td style="width:497px;">http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Block Heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Electrophoresis power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel doc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">UV or blue light transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution

تدرس DNA رسم الخرائط نمط مثيلة بكثافة في الأنسجة الطبيعية والمريضة. وقد وضعت مجموعة متنوعة من الأساليب لاستجواب أنماط السيتوزين مثيلة في الخلايا. وقد وضعت التمثيل انخفاض كله تسلسل الجينوم بيسلفيت للكشف عن الكمية زوج قاعدة أنماط قرار السيتوزين مثيلة في-GC الغنية مواضع الجيني. يتم ذلك عن طريق الجمع بين استخدام انزيم تقييد تليها تحويل بيسلفيت. تعزيز انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل (ERRBS) يزيد من مواضع الجيني بيولوجيا تغطيتها واستخدمت لمحة السيتوزين مثيلة في DNA من البشر، والماوس وغيرها من الكائنات. ERRBS يبدأ مع تقييد انزيم هضم الحمض النووي لتوليد منخفضة شظايا الوزن الجزيئي لاستخدامها في إعداد مكتبة. وتتعرض هذه الشظايا إلى بناء مكتبة القياسية للجيل القادم التسلسل. تحويل بيسلفيت من cytosines unmethylated مسبق للamplificati نهائيعلى خطوة تسمح للقرار قاعدة الكمي لمستويات الحامض السيتوزين في مواضع الجيني مغطى. بروتوكول يمكن أن تكتمل في غضون أربعة أيام. على الرغم من التعقيد منخفض في القواعد الثلاثة الأولى التسلسل والمكتبات ERRBS تسفر عن بيانات عالية الجودة عند استخدام ممر السيطرة التسلسل المعين. ثم يتم تنفيذ ورسم الخرائط والمعلوماتية الحيوية تحليل البيانات والعوائد التي يمكن دمجها بسهولة مع مجموعة متنوعة من المنصات على نطاق الجينوم. ERRBS يمكن الاستفادة كميات المواد المدخلات صغيرة مما يجعل من الممكن لمعالجة العينات السريرية البشرية وقابلة للتطبيق في مجموعة من التطبيقات البحثية. الفيديو المنتجة يوضح الخطوات الحاسمة للبروتوكول ERRBS.

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution at JoVE.com

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Views.  Weill Cornell Medical College. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Video: Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

انخفاض الجاذبية المظاهرات الأجهزة البيئة في نموذج المنمنمة تدفق عداد الكريات ورفيق ميكروفلويديك تقنية خلط

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

أسلوب الشذرة إكسو: تحديد التفاعلات البروتين الحمض النووي مع قرب قاعدة زوج الدقة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

توليد مكتبات الإدراج Transposon في البكتيريا السلبية الغرامية لتسلسل عالي الإنتاجية

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...