Name: enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
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We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

실행 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 인디애나 대학의 승인을 건강 지침의 국립 연구소 따릅니다. 1. 수술 기법 <ol><li> 멸균 장갑, 악기, 그리고 NIH 가이드 라인 (25)에 따라 멸균 수술 필드를 사용하여이 절차를 수행하는 동안 무균 기술을 유지한다. 를 오토 클레이브에 의해 수술을 시작하기 전에 도구를 소독 (전체 목록은 특정 시약 / 장비의 표 참조). 작업 중에 도구를 소독 유리 구슬 살균기를 사용합니다. </li></ol> 2. 마취 및 준비 <ol><li> 수의학 이소 플루 란 기화기 시스템을 이용하여 0.9 L / 분의 산소 및 2.5 %의 이소 플루 란 혼합물로 마취 상자에 마우스를 마취. 마우스가 상자에서 제거하기 전에 몸의 위치 변화에 응답하지 않습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 양해 각서 (MOU)에 안과 연고를 적용그 자체의 눈이 마르지을 보호 할 수 있습니다. </li><li> 코 콘에있는 상자에서 가스 흐름을 전환합니다. 콘 내부의 코와 입으로 수술 패드와 흡수 벤치 종이로 덮여 가열 패드의 왼쪽에 정면으로 마우스를 놓습니다. 지속적으로 마우스의 호흡 리듬과 속도를 모니터링하고 필요에 따라 이소 플루 란 레벨을 조정 - 마취의 적절한 수준을 유지하기 위해 (2.5 사이의 3 % 이소 플루 란), 총 진정 작용을 확인하기 위해 발가락 핀치 반사를 사용합니다. </li></ol> 3. 수술 적 접근 <ol><li> 맞추고 수술 필드 입체경을 초점을 맞 춥니 다. 노즈콘을 조정하고이 시야의 가장자리에 위치하도록 아래로하는 테이프. </li><li> 마우스의 왼쪽에 누워, 절개 될 것이다 귀 뒤 영역을 노출 노즈콘을 우측 귀의 가장자리를 테이프. 후방 귀의 정맥 귀 가로로 이동하는 확인하십시오. 참고 t의 정확한 위치그 동물 귀의 테이핑 신속 안면 신경을 찾기 위해 매우 중요하다. </li><li> 에 70 % 에탄올 귀 뒤에 모피 적시고 면도기 또는 메스 블레이드를 사용하여 수술 부위를 면도. 사전 습윤 모피하는이 해부학 적 위치에 쉽게 면도 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올 다음과 같은 베타 딘 수술 스크럽 (7.5 % 포비돈 요오드)와 같은 요오드 용액,로 피부를 청소합니다. 철저하게 지역을 소독이 청소를 두 번 더 반복합니다. </li><li> , 절개를 귀 돌기에 지역의 후방에 꼬리 쪽 귀에서 후방 귀의 정맥을 추적해서 결정해야합니다. 돌기에 3mm 후방 - 봄 가위를 사용하여 4mm의 절개 (2)를 확인합니다. </li><li> 무딘 절개를 이용하여 피하 지방 및 근막을 절개하다. 혈관 또는 근육 조직이 쉽게 손상 될 수 있기 때문에 가위로 직접 절단하지 마십시오. </li><li> 출혈이 발생하는 경우, 멸균 면봉으로 수술 부위에 압력을 적용적어도 30 초. 유체 상당한 손실이 발생하면, 최대 25 또는 제 27 G 바늘을 사용하여 멸균 0.9 % 식염수 용액 0.5 ml를 복강 내 주사를 마우스. </li><li> 안면 신경의 위치를​​, 몇 가지 주요 랜드 마크, 척추 부신경, 외이도를 사용하여 (아래에 설명) digastric 근육을 전방. 안면 신경의 가지가 가시화 될 때까지 이러한 랜드 마크 주위를 해부하다. 이 공개 될 때 신경은 크게 백색 고체 구조로 표시됩니다 및 근막 층이 기본 구조를 준수합니다. <ol><li> 피하 지방과 근막이 해부 된 이후, 승모근의 근육에 분포하는 두개골의 꼬리 부분에서 이동 척추 액세서리 신경을 찾을 수 있습니다. 안면 신경은 척추 부신경에 깊은이다. </li><li> 진주 흰색 보이는 안면 신경에 주동이 볼 수있는 연골 귀 운하를 찾을 수 있습니다. </li><li> 의 상단과 C에 놓여 전방 digastric 근육의 근육 배꼽 찾기안면 신경에 audal. </li></ol></li><li> 안면 신경의 가지 주요 가시화되면 stylomastoid 난원에서 기원을 찾을 등쪽 그들을 추적. 개방형 수술 부위를 보유하고있는 신경의 경로를 따라 봄 가위 팁을 발전 연 다음, 새로 고급 영역을 유지하기 위해 등쪽 집게를 이동 뾰족한 뒤몽 포셉 # 45분의 5를 사용. </li><li> 이 시점에서 광대뼈, 구강과 안면 신경의 트렁크, 변연 하악 가지를 시각화. 주 : 시간 ​​분기 난원에 가까운 발견 될 것이다. 상부 및 하부에 한계 하악 신경 가지에 가까운 턱, 따라서 그 신경 지점이 수준에서 표시되지 않습니다. <ol><li> 신경 절개를 수행하는 경우, 미세 팁 포셉으로 부드럽게 신경을 안정시키고 스프링 가위로 신경을 잘라. 뇌간의 신경을 avulsing 방지하기 위해 집게와 신경에 너무 많은 견인을 적용하지 마십시오. 푸시멀리 서로, 또는 절단 및 말초 신경의 일부를 제거에서 젊고 아름다운 여자가 재 연결이 발생하지 않도록합니다. </li><li> 호감 부상을 수행하는 경우, 모든 축삭을 절단 첫 번째 호감 사이트에 수직 인 제 2 각도로이 호감을 반복 일정한 압력을 사용하여 30 초 동안 신경을 압축 뒤몽 #에게 45분의 5 집게를 사용합니다. 그렇지 않으면 부상 동물 사이에 일관성이 없습니다, 30 초 호감 동안 압력의 변수 금액을 적용하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 4. 결산 및 복구 <ol><li> 기본 구조를 통해 지방과 근육 위치를 조정합니다. </li><li> 절개의 가장자리를 대략적인 7.5 mm 상처 클립을 사용하여 상처를 닫는다. 봉합 또는 접착제는 또한 상처 폐쇄에 대한 허용됩니다. 수술후 진통제는이 시점에 제공 될 수있다. </li><li> 마우스의 귀에서 테이프를 제거합니다. 이소 플루 란 흐름을 끄고 마우스가 1 분 30 초 동안 순수한 산소를 흡입 할 수 있습니다. PL마취에서 회복 할 수없는 침구 빈 케이지에서 마우스 에이스. </li><li> 마우스가 복구 될 때, 안면 마비의 확증 흔적이 동작을 검사합니다. 수염이 마비 다시 뺨을 향해 각도됩니다, 코가 이탈되고, 눈은 공기의 퍼프에 대한 응답으로 깜박하지 않습니다. </li><li> 주택의 동물 공동 수술 후 그들은 여성의 경우. 그들은 더 공격적 강제 감염에 이르게 자신의 cagemate의 상처 클립을 제거하는 경향이 있기 때문에 공동으로 남성 쥐를 수용하지 마십시오. 필요한 경우,이 시점에서 수술후 진통제를 제공한다. </li><li> 어떤 감염 또는 기타 합병증은 수술 후 발생하지 않도록 수술 후 며칠 동안 하루에 한 번 마우스를 모니터링합니다. 그들은 자신에 타락하지 않은 경우 수술 10 일 - 상처 클립 (7)를 제거합니다. </li><li> 눈 깜빡임이 재 할 때까지, 매일 각막 합병증을 방지하기 위해 영향을받는 눈에 눈 연고를 윤활 적용적용 또는 안락사까지. </li></ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

생물학적으로 관련 게놈 영역에서 시토신 메틸화의 프로토콜을 제시 수익률의 염기쌍 해상도 데이터. 출발 물질 50 NG 최적화되어 작성된 프로토콜은, 그러나, 입력 범위의 재료 (5 NG 이상) (26)을 처리하도록 적응 될 수있다. 표 6에서 볼 수 있듯이이 프로토콜의 일부 단계의 조정을 필요로 할 것이다. ERRBS 라이브러리는 시퀀싱에 의해 달성 될 수있는 한 쌍의 단부 및 상기 게놈 시퀀싱 따르면 의무가있는 더 긴 51 회 이상의 판독한다. 샘플 당 낮은 비용 프로토콜을 제안 할 것이다 다중화 순서는, 그러나, 이것은 데이터 (도 5 및 표 8)에 표현 된 CpG 사이트 당 감소 따르면 초래할 것이며, 당 높은 커버리지를 요구 분석을 수행하기에 따르면 충분한 깊이를 산출하지 않을 (랜댄 등. (33)에 의해 설명 된 바와 같이 예 :)의 CpG 사이트. 마지막으로,이 프로토콜 (또는 중아 기반 protoco난) 메틸 시토신과 하이드 록시 메틸 시토신 (46, 47) 사이에 구별 할 수 없습니다. 그러나, 다른 프로토콜로 통합 될 수있는 데이터를 생성 다른 변형을 묘사하는 48,49 결과, 시토신 및 다른 변형들이 최근 관심이어야 50을보고했다. 그림 3 세대 (빨간색 추적) 모두 라이브러리 분수에서 동일한 몰 기여를 나타내는과 같이 그림 3A-C에 표시하고, 한 번 시퀀싱 풀 추적을 산출로 높은 품질의 라이브러리가 표시됩니다. 도서관 준비 실패는 절차를 수행하는 동안 모든 단계에서 발생할 수 있습니다. DNA 분해 처리되어 있으면이 프로토콜에 기재된 순서 변수를 이용하여 낮은 커버리지의 CpG 따라서 MspI 단편 및 농축되지 않은 라이브러리 초래할 것이다. 효소가 비 기능적 또는 부주의 한 반응에서 제외되면, 프로토콜은 예상 라이브러리를 산출하지 않는다. 결찰 것이란 경우ction의 비효율적이며, 어댑터는 예상보다 더 높은 농도로, 그리고 / 또는 사용 된 프라이머 농도가, 최종 증폭 단계에 대한 제한적인 시약이고, 라이브러리 오류가 발생할 수있다. 때문에 라이브러리와 과잉 어댑터 모두의 무차별 적 클러스터링 또한 시퀀싱을 방해 라이브러리 (도 3D-F bioanalyzer 결과에 ~ 150 BP에서 피크로 본) 초과 어댑터. 이러한 라이브러리 명백하게 정상적으로 시퀀스 수 있지만, 상당 부분은 단지 어댑터 서열 것이다 읽는다. 과량 어댑터 라이브러리에서 관찰되는 경우, 재료는 수량 비율 어댑 최적 입력 재료를 이용 가능한 경우 라이브러리 제조를 반복하는 것이 최상이다. 마지막으로, 라이브러리의 PCR 증폭 효율을 보장하기 위해, 상기 하부 및 높은 라이브러리 분획물 변환 비설 파이트 및 PCR 농축 단계에 걸쳐 별도의 샘플로 유지된다. 그렇게하지 ​​않으면 P 동안 증폭 차동 효율을 산출CR의 (그림 3G 파란색 추적에서 볼 수 있듯이) 높고 낮은 분수의 반응 및 시퀀싱 동안 각 라이브러리 부분에 언급 한 각각의 게놈 유전자 좌의 불평등 한 표현의 가능성. 사용자는 라이브러리가 생성되는 증폭하기 위해 필요한 최적의 PCR 사이클의 추가적인 적정 중아 변환 후 즉시 정량적 PCR 공정을 포함하는 것을 선택할 수있다. ERRBS 도서관 준비 프로토콜은 특정 시약을 권장하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 최종 수리 공정에서, 네 개의 뉴클레오티드의 dNTP 혼합의 사용은 MspI 효소 등급 활성 및 원래 DNA 샘플에 존재하는 전단 된 DNA 단편으로부터 얻어진 것과 CG 오버행을 함유하지 않는 임의의 제품의 최종 수리를 허용한다. 이 결과에서 개선의 CpG 표현 초래한다. 결찰 단계에서 그것은 보장 고농도 리가 제 (200 단위 / ml) 및 메틸화 어댑터를 사용하는 것이 중요하다는 결찰를 Reacti에 효율적이고 중아 변환은 정확한 데이터의 위치 맞춤을위한 필수적인 어댑터 서열에 영향을주지 않는다는 것을. PCR 단계에서 바이 설 파이트 처리 GC가 풍부한 DNA 단편을 증폭 할 수있는 중합 효소를 사용하여 높은 특이성에 대한 필요가있다. 마지막으로, 과량의 어댑터 및 프라이머의 제거를 보장하기 위해, (예 : Agencourt AMPure XP) SPRI 비드 정제 결찰 및 PCR 생성물 아이솔레이션 용 칼럼 기재 분석법 아닌 권장된다. 고품질의 데이터를 생성하기 위해서는, 바이 설 파이트 변환 효율을 보장하는 것이 중요하다. 표시 제어부는 유저에게 시퀀싱 전에 변환 효율을 결정하는 능력을 제공한다. 대안으로, 람다 DNA와 같은 비 - 인간 DNA는 내부 제어 (스파이크)에서 사용될 수있다. 인해 종의 차이에 따라, 이런 종류의 제어가 직접 시퀀싱 하류에 포함될 수있다 (예를 들면 유 의해 사용되는 바와 같이, 등. 34). 그러나, 스파이크의 난 경우이용 S, 이는 고유 증폭 독립적 라이브러리 시퀀싱 전에 서열화 않는 라이브러리 시퀀싱 이전에 변환 효율을 결정하기 위해 사용될 수 없다. 결정 전환율은 비의 CpG 사이트에서 메틸화 상태를 기준으로합니다. 이것은 (예를 들어 배아 줄기 세포) 이외의 CpG 컨텍스트와 평행 샘플 또는 이러한 목적을 위해 이용 될 수 변환 효율을 평가하는 다른 수단이 높은 사이토 신 메틸화의 맥락에서 사용하기에 적합하지 않을 수있다. ERRBS 라이브러리의 순서에 고유 한 주소로 몇 가지주의해야 할 점이있다. 서열 라이브러리 분획 처음 세 염기 인해 MspI 인식 컷 사이트를 거의 균일하게 비 - 랜덤 (C ^ CGG도 4B, C 참조). 때문에 낮은 품질에 중요한 데이터 손실의 가능성이 결과는 순서 동안 명백한 높은 클러스터 밀도에도 불구하고 가난한 클러스터 현지화로 인한 읽습니다. 이 장벽을 극복하기 위해,전용 제어 차선으로 독립적 인 레인 (PhiX 제어 또는 다른 라이브러리 유형)에서 높은 복잡성 라이브러리를 포함한다. 높은 복잡성 라이브러리는 서열 처음 네 기지에서 A, C, T와 G의 균형 표현을 포함한 끝이있다. 적절한 제어 차선은 RNA-SEQ, 칩 서열, 전체 게놈 시퀀싱, 또는 시퀀싱 장비 제조업체 (예 : PhiX 제어 V3)에 의해 제공되는 제어와 같은 라이브러리를 포함한다. 각각의 시퀀싱 런 제어 차선으로 지정되면, 클러스터 위치를 검출하는 순서의 최초의 DNA 염기 중에 이용되는 행렬 생성을위한 기초로서 기능 할 수있다. 높은 품질로 된 CpG 사이트 당 평균 범위를 올릴 캡처 읽기 5.2 (N = 4). 대안 적으로, 기술적 인 어려움이 또한 앞서 설명한 바와 같이 23 어두운 시퀀싱 방법을 사용하여 극복 될 수있다. 다른 염기 서열 기준은 제조사의 프로토콜에 따라 표준 운영 절차를 따르십시오. CpG 디 C 당 마지막 따르면데이터 분석을위한 호센 관심 생물학적 질문하여 사용자에 의해 부분적으로 유도 될 것이다. 10 배의 커버리지는 높은 임계 범위 분석 방법 그러나이 임계 값은 그 관심이어야 낮아질 수를 제공한다. ERRBS 데이터 분석의 전체 논의는하지만, 차별적 메틸화 된 시토신와 지역은 오픈 소스 도구 31,51-53를 사용하여 결정할 수있다,이 문서의 범위를 벗어납니다. 추가 고려 사항 및 분석 방법은 54, 55을 잘 설명되어 있고, 리더는 계획된 분석에 가장 적합한 도구 문헌을 검색 할 것을 권장한다. 게시 된 다른 방법에 비해, ERRBS 재현성의 설명 수익률 높은 속도로 수행 나흘 간 프로토콜을 제공합니다. 그것은 MassARRAY EpiTYPER 26 일 표준 금에 비교 검증되었습니다, 비용 효율적인 커버력이 높은 데이터이며, 다양한 입력 자료에 대한 적응력시퀀싱 방법 (낮은 주파수의 임상 샘플 처리 및 다른 세포 유형에 유리한) 양. 그것은 게놈 전체의 전사 조절 인자 결합, 크로 마틴 리모델링, 후생 유전 학적 마크와 관심의 다른 시토신 수정을 프로파일 링 다른 기술과 분석 생물학적으로 관련 유전자좌에서 염기쌍 해상도를 제공하며, 통합 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 ERRBS 데이터 사용은 포괄적 인 분자 접근에 기여 차원 생물학적 모델과 인간 질병의 연구에서 분석에 대한 높은 허용 할 수 있습니다.

시토신 (5- 메틸 시토신)에서 DNA 메틸화는 생물학적 과정의 다양한 포유 동물 세포에서 중요한 포함하지만 임프린트, X 염색체 불 활성화, 개발 및 유전자 발현 조절 1-8에 한정되지 후생 유전 학적 마크이다. 악성 질환 및 기타 질환에서의 DNA 메틸화 패턴의 연구는 질병 특정 패턴을 결정하고 질병의 발병 기전과 잠재적 인 바이오 마커 발견 9-17의 이해에 기여하고있다. DNA 메틸화 상태를 가지로 구분을 심문하는 프로토콜이있다. 이들은 선호도 기반으로 분할 될 수 있고, 제한 효소 기반 및 하류 마이크로 어레이 또는 시퀀싱 플랫폼을 활용 중아 변환 - 기반 분석법. 또한, 다음과 같은 일반적인 범주에 포함되지만, 결합 바이 설 파이트 제한 분석 (18)에 한정 표현 바이 설 파이트 시퀀싱 (RRBS 19) 감소하지 다리를 몇 가지 프로토콜이있다. </P&gt; RRBS는 원래 마이스너 등. (19, 20)에 의해 설명되었다. 이 프로토콜은 비용 (21, 22) 효과가 정량적 염기쌍 해상도 데이터 결과 바이 설 파이트 시퀀싱, 다음 GC 풍부한 게놈 영역을 풍부하게하는 단계를 소개했다. GC 풍부 영역들은 MspI (C ^ CGG) 제한 효소에 의해 대상으로하고 시토신 메틸화는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어 시토신의 중아 변환 (우라실 변성 시토신의 탈 아미 노화)에 의해 해결된다. RRBS 유전자 프로모터 및 전체 게놈에 필요한 순서의 일부에서의 CpG 섬의 대부분을 커버; 그러나 RRBS는 CpG 디 해안과 생물학적 관련성의 다른 유전자 간 지역의 제한 범위를했다. 몇몇 그룹은 이러한 게놈 지역 23 ~ 25의 방법론과 결과 범위를 개선 원래의 보고서 이후 RRBS 프로토콜을 업데이트 게시 한. 향상된 감소 표현 바이 설 파이트 Sequencing (ERRBS)는 RRBS에 비해 라이브러리 준비 수정 및 대체 데이터 정렬 방식 (26)를 포함한다. ERRBS는 생성 된 데이터로 표현 CpGs 더 많은 수의 결과와 모든 게놈 영역의 범위가 26 심문 증가했다. 이 방법은 인간 및 기타 동물 환자 검체 26-30에서 DNA 메틸화 패턴을 확인하는 데 사용되어왔다. ERRBS 프로토콜 완료 대표적인 인간 DNA를 이용하여 생성 된 데이터에 필요한 모든 단계에서 이벤트 정보를 기재 (샘플은 이전에보고 된, 디 식별 환자 샘플 (31)로부터 얻어지고, 정상적인 인간 공여자로부터의 CD34 + 골수 샘플 하였다). 프로토콜은 샘플 당 처리 시간을 감소시키고, 라이브러리 크기 선택의 정확도 향상을 가능하게하는 자동 사이즈 선택 프로세스를 포함한다. 프로토콜은 수립 분자 생물학 기법을 결합한 계열. 고 분자량의 DNA를 소화 w최종 수리, A-미행하고, 메틸화 된 어댑터의 결찰 다음에 메틸화를 구분하지 않는 제한 효소 (MspI) i 번째. GC 풍부한 단편의 사이즈 선택은 바이 설 파이트 변환 및 시퀀싱 전에 PCR 증폭 이어진다. 중아 변환 이전에 있었다 (32) 기술과 데이터 분석 및 응용 프로그램의 상세한 검토를 권고하고 참조가 독자를위한 부분 포함되어 있지만이 문서의 범위를 벗어했다. 이 프로토콜은 사일을 통해 수행과 작은 입력 (50 NG 이하) 재료 양의 의무가 될 수있다. 차동 메틸화 사이트 및 영역에 대한 결정뿐만 아니라 후생 유전 학적 다형성 검출뿐만 아니라 충분한 된 CpG 사이트 당에 따르면 높은 수율로 설명 데이터로서 프로토콜, 등. 33 랜댄 기재된 바와 같이.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100,000 units/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2</td></tr><tr><td>Phenol solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Equilibrated with 10&amp;nbsp;mM Tris HCl, pH&amp;nbsp;8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5.2</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, for molecular biology</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>prepare a 1 M, pH 8.5 solution</td></tr><tr><td>Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Dilute to 1x buffer solution per manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10x concentration</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM each nucleotide</td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3,000 units/ml</td></tr><tr><td>DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5,000 units/ml</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Used for DNA product purification in protocol step 2.3</td></tr><tr><td>2&#039;-deoxyadenosine 5&#039;-triphosphate (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3&#039;&amp;rarr;5&#039; exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5,000 units/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Used for DNA product purification in protocol step 3.3</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2,000,000 units/ml</td></tr><tr><td>Methylation Adapter Oligo Kit</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use.</td></tr><tr><td>Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>with internal standards</td></tr><tr><td>Certified Low Range Ultra Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, Orange (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;Blade&amp;nbsp;No.&amp;nbsp;11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Used in protocol step 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternative for step 6.2</td></tr><tr><td>Universal Methylated Human DNA Standard</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>Used as bisulfite conversion control</td></tr><tr><td>FastStart High Fidelity PCR System</td><td>Roche</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Sample prep</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Block Heater</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power supply</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV or blue light transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution

DNA 메틸화 패턴 매핑은 크게 정상 및 병에 걸린 조직에서 연구되고있다. 다양한 방법이 세포에서 시토신 메틸화 패턴을 심문하기 위해 설립되었다. 전체 게놈 서열의 중아 감소 표현 GC 풍부한 게놈 유전자좌 양적 염기쌍 해상도 시토신 메틸화 패턴을 검출하기 위해 개발되었다. 이 바이 설 파이트 변환이어서 제한 효소의 조합을 사용함으로써 달성된다. 향상된 감소 표현 바이 설 파이트 시퀀싱 (ERRBS)가 적용되는 생물학적으로 관련 게놈 궤적을 증가시키고 인간, 마우스 및 다른 생물의 DNA에서 시토신 메틸화을 프로파일 링하는 데 사용되었습니다. ERRBS 라이브러리 제조에 사용하기위한 저 분자량의 단편을 생성하는 DNA의 제한 효소 절단함으로써 시작된다. 이 조각은 차세대 시퀀싱을위한 표준 라이브러리 건설을 실시한다. 최종 amplificati 이전에 비 메틸화 된 시토신의 중아 변환단계에 덮여 게놈 유전자 좌에서 시토신 메틸화 수준의 양적 기본 해상도 수 있습니다. 이 프로토콜은 네 일 이내에 완료 할 수 있습니다. 지정된 시퀀싱 제어 레인 사용시 서열화 처음 세 염기 낮은 복잡성에도 불구 ERRBS 라이브러리는 고품질의 데이터를 얻었다. 매핑 및 생물 정보학 분석 수행된다 수율 데이터 용이 게놈 넓은 다양한 플랫폼과 통합 될 수있다. ERRBS는 가능한 연구 어플리케이션의 범위에서 인간 임상 샘플 및 해당 사항을 처리 할 수​​있게 작은 입력 재료 수량을 이용할 수있다. 생성 된 비디오는 ERRBS 프로토콜의 중요한 단계를 보여줍니다.

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Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.5K 조회수.  Weill Cornell Medical College. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

비디오: Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

생물학

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these animal models. The rat is one particular model animal where an epigenetic tool can complement many pharmacological and behavioral studies to provide insightful mechanistic information. To this end, we adapted the SureSelect Target Capture System (referred to as Methyl-Seq) for the rat, which can assess DNA methylation levels across the rat genome. The rat design targeted promoters, CpG islands, island shores, and GC-rich regions from all RefSeq genes. 
To implement the platform on a rat experiment, male Sprague Dawley rats were exposed to chronic variable stress for 3 weeks, after which blood samples were collected for genomic DNA extraction. Methyl-Seq libraries were constructed from the rat DNA samples by shearing, adapter ligation, target enrichment, bisulfite conversion, and multiplexing. Libraries were sequenced on a next-generation sequencing platform and the sequenced reads were analyzed to identify DMRs between DNA of stressed and unstressed rats. Top candidate DMRs were independently validated by bisulfite pyrosequencing to confirm the robustness of the platform.
Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is a useful epigenetic tool that can capture methylation changes induced by exposure to stress.

Here, we describe the protocol and implementation of Methyl-Seq, an epigenomic platform, using a rat model to identify epigenetic changes associated with chronic stress exposure. Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is capable of detecting methylation differences that arise from stress exposure in rats.

쥐 메 틸-Seq 플랫폼 관련 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인 하

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

생화학

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

신경과학

Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid storage processes contributing to the development of the disease. We demonstrate a complete protocol from selection to epigenetic data analysis of patients with and without obesity. All steps from the protocol were tested and validated in a pilot study. 32 women participated in the study, in which 15 individuals were classified with obesity according to Body Mass Index (BMI) (45.1 &#177; 5.4 kg/m2); and 17 individuals were classified without obesity according to BMI (22.6 &#177; 1.8 kg/m2). In the group with obesity, 564 CpG sites related to fat mass were identified by linear regression analysis. The CpG sites were in the promoter regions. The differential analysis found 470 CpGs hypomethylated and 94 hypermethylated sites in individuals with obesity. The most hypomethylated enriched pathwayswere in the RUNX, WNT signaling, and response to hypoxia. The hypermethylated pathways were related to insulin secretion, glucagon signaling, and Ca2+. We conclude that the protocol effectively identified DNA methylation patterns and trait-related DNA methylation. These patterns could be associated with altered gene expression, affecting adipogenesis and lipid storage. Our results confirmed that an obesogenic lifestyle could promote epigenetic changes in human DNA.

The present study describes the workflow to manage DNA methylation data obtained by microarray technologies. The protocol demonstrates steps from sample preparation to data analysis. All procedures are described in detail, and the video shows the significant steps.

DNA 메틸화의 생물 정보학 분석에 대한 샘플 준비 : 비만 및 관련 특성 연구를위한 협회 전략

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

DNA Methylation Analysis

Methylation at CpG dinucleotides is a chemical modification of DNA hypothesized to play important roles in regulating gene expression. In particular, the methylation of clusters of methylation sites, called &#8220;CpG islands&#8221;, near promoters and other gene regulatory elements may contribute to the stable silencing of genes, for example, during epigenetic processes such as genomic imprinting and X-chromosome inactivation. At the same time, aberrant CpG methylation has been shown to be associated with cancer.In this video, the biological functions and mechanisms of DNA methylation will be presented, along with various techniques used to identify methylation sites in the genome. We will then examine the steps of bisulfite analysis, one of the most commonly used methods for detecting DNA methylation, as well as several applications of this technique.

DNA 메틸화 분석

Methylation at CpG dinucleotides is a chemical modification of DNA hypothesized to play important roles in regulating gene expression. In particular, the ...