We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Universit&#233; Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Syst&#232;mes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche M&#233;dicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Universit&#233; Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex &#8216;CelTisPhyBio&#8217; (ANR-11-LABX0038).

<ol>
	<li>Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Synthetic+Biology:+Engineering+in+a+Tinkerer&#8217;s+World.">Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer&#8217;s World.</a> Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Shape+Modulates+Transmembrane+Protein+Distribution.">Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution.</a> Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).</li><li>Roux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+controls+dynamin+polymerization.">Membrane curvature controls dynamin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).</li><li>Domanov, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+in+geometrically+confined+membranes.">Mobility in geometrically confined membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).</li><li>Sorre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curvature-driven+lipid+sorting+needs+proximity+to+a+demixing+point+and+is+aided+by+proteins.">Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).</li><li>Faris, M. D. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Lowering+Induced+by+Protein+Activity.">Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity.</a> Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).</li><li>Streicher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+reconstituted+in+GUVs:+A+biomimetic+system+to+study+initial+steps+of+cell+spreading.">Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+approaches+to+protein-induced+membrane+deformations+in+trafficking.">Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion.">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li><li>Reeves, J. P., Dowben, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+properties+of+thin-walled+phospholipid+vesicles.">Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles.</a> Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).</li><li>Angelova, M. I., Sol&#233;au, S., M&#233;l&#233;ard, P., Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.+Kinetics+and+applications.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications.</a> Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).</li><li>Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Unilamellar+Vesicle+Electroformation.">Giant Unilamellar Vesicle Electroformation.</a> Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).</li><li>Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in.">Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in.</a> Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).</li><li>Campillo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+Membrane+Dynamics+Unveiled+by+Membrane+Nanotube+Extrusion.">Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion.</a> Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).</li><li>Kwok, R., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoelasticity+of+large+lecithin+bilayer+vesicles.">Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles.</a> Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).</li><li>Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+and+physical+properties+of+giant+phospholipid+vesicles+prepared+in+the+presence+of+an+AC+electric+field.">Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field.</a> Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).</li><li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-Assisted+Formation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles.</a> Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).</li><li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents.">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li><li>Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+giant+unilamellar+vesicles+via+peptide-induced+fusion.">Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion.</a> Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).</li><li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles.">Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li><li>Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+or+Active+Fluctuations+in+Membranes+Containing+Proteins.">Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins.</a> Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).</li><li>Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Lipids+in+VDAC+Oligomerization.">The Role of Lipids in VDAC Oligomerization.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+voltage-dependent+K++channel.">X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).</li><li>Aimon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reconstitution+of+a+Voltage-Gated+Potassium+Channel+in+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles.</a> PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).</li><li>Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+a+Kv+Channel+into+Lipid+Membranes+for+Structural+and+Functional+Studies.">Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).</li><li>Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+damp+lipid+film+for+better+lipid+compositional+uniformity.">Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).</li><li>Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+and+Structure+of+the+Patch+and+the+Gigaseal.">Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal.</a> Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels of Excitable Membranes. , (2001).</li><li>Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+KvAP+unitary+conductance+and+gating+by+1-alkanols+and+other+surface+active+agents.">Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents.</a> Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).</li><li>Schmidt, D., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+K++channel+gating+and+voltage+sensor+toxin+sensitivity+depend+on+the+mechanical+state+of+the+lipid+membrane.">Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).</li><li>Quemeneur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+matters+in+protein+mobility+within+membranes.">Shape matters in protein mobility within membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).</li><li>Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;S1-casein,+which+is+essential+for+efficient+ER-to-Golgi+casein+transport,+is+also+present+in+a+tightly+membrane-associated+form.">&#945;S1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form.</a> BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).</li><li>Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+Voltage+Dependent+Proteins+with+Giant+Unilamellar+Vesicles+in+a+&#8220;Whole+Cell&#8221;+Configuration.">Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a &#8220;Whole Cell&#8221; Configuration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).</li><li>Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+trehalose+special+for+preserving+dry+biomaterials.">Is trehalose special for preserving dry biomaterials.</a> Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מערכות מודל Biomimetic הן כלי חשוב ללימוד התכונות והאינטראקציות של חלבונים וקרומים. בהשוואה למערכות אחרות כמו מחדש BLMs או ממברנות שומנים בדם נתמכים, בוס מערכות מספר הזדמנויות הנוכחיות כוללים שליטה ניכרת של הרכב קרום, מתח וגיאומטריה, כמו גם להיות באמת ללא שמן בסיס. עם זאת, ב...

כאשר לומדים את העקרונות הפיסיקליים ששולטים במערכות חיים, גישות מלמטה למעלה תאפשר לשלוט בניסויי הרכב מערכת ופרמטרים נוספים שאינם מניפולציות בקלות במערכות מבוססות תאים 1. לתהליכים מבוססי קרום, Giant Unilamellar שלפוחית ​​(GUVs, קוטר ~ 1-100 מיקרומטר) הוכיחו להיות מערכת biomimetic מאוד שימושית 2-7 כפי שהם מתאימים לבחינה מיקרוסקופית ומיקרומניפולציה 8-10. אמנם יש פרוטוקולים רבים ושונים כדי לייצר GUVs, רוב מתחלקים לשתי קטגוריות - תחליב המבוסס גישות 11,12 וטכניקות המבוססות על rehydrating סרט שומנים 13-16. בשיטות המבוססת על אמולסיה, העלונים הפנימיים וחיצוניים של קרומי הבוס הם התאספו ברצף מmonolayers שומנים בממשקים מים / שמן. גישה זו היא אידיאלית עבור מתמצת חלבונים מסיסים בבGUVs, וגיבוש GUVs עם הרכב שומנים עלון א-סימטרי. עם זאת, GUVs נוצר מתחליבים יכול לשמור עקבות של ממס שמשנות את התכונות מכאניות של הקרום 17, והגישה היא לא במיוחד מתאימה היטב לכינון מחדש חלבון טרנס-קרום. שיטות להחזרת נוזלי סרט מסתמכות על העובדה שהייבוש (התייבשות) גורם תערובות שומנים רבות כדי ליצור ערימה רבת-שבשבת של ממברנות. אם זה ערימה ממוקמת אז במגע עם חיץ המימי, קרומים בערימה יעברו תזרים בנפרד ממס כביניהם ועל פני השטח של הערימה, קרומי אדם יכולים לנתק כדי ליצור GUVs 13,18 (כמו גם גן חיות אמיתית של אובייקטי lipidic אחרים). עם זאת, גם ליצירות חיץ ושומנים בדם אופטימליות, יש בשיטה זו קלסית &quot;נפיחות ספונטנית&quot; תשואה נמוכה יחסית של GUVs ללא פגם. שיטה נפוצה אחת כדי להגביר את התשואה של GUVs ללא פגם היא &quot;electroformation221 ;, שבו שדה זרם חילופין (AC) מיושם בהחזרת נוזלי סרט. בעוד המנגנון נותר הבין היטב, &quot;electroformation&quot; יכול לתת תשואות בוס מרהיבות (&gt; 90% בנסיבות חיוביות) למאגרי ריכוז נמוך מלח (&lt;5 מ&quot;מ) 14,19, ואפילו יכול לעבוד במאגרים פיסיולוגיים (~ 100 מ&quot;מ) באמצעות תדירות גבוהה יותר (500 הרץ לעומת 10 הרץ) שדה AC ואלקטרודות פלטינה 15. גישה חלופית כדי להגביר את התשואה של GUVs ללא פגם היא &quot;בסיוע ג &#39;נפיחות&quot;, שבו פתרון השומנים מופקד על מצע ג&#39;ל פולימרים ולא פסיבי מצעים (למשל, זכוכית, PTFE) המשמשים ב&quot; נפיחות ספונטנית קלסית &quot;. כאשר סרט השומנים / ג&#39;ל התוצאה הוא rehydrated, GUVs יכול במהירות ליצור אפילו למאגרים פיסיולוגיים 16,20. כל השיטות הללו יכולים לייצר GUVs שומנים בדם היחיד שיכול לשמש כדי לחקור תופעות קרום הקשורים כגוןאינטראקציה בין חלבונים וקרומים מסיסים. עם זאת, כדי לשלב חלבון טרנס-קרום לGUVs, יש צורך בשינויים משמעותיים כדי להבטיח כי החלבון נשאר במצב תפקודי לאורך כל הליך הכינון מחדש. בעוד פתרונות של שומנים בממסים אורגניים (למשל, כלורופורם, cyclohexane) הם אידיאליים להפקת סרטי שומנים, חלבונים טרנס-קרום הם בדרך כלל יציבים רק כאשר תחום טרנס-הקרום הידרופובי שלהם מוטבע בbilayer שומנים בדם, או מוקף בmicelle חומרי ניקוי ( לדוגמא, במהלך טיהור חלבונים). לפיכך, החומר המוצא לכינון מחדש הוא בדרך כלל קרומי ילידים, חלבון מטוהר בתמיסת ניקוי, או שלפוחית ​​המכיל חלבון unilamellar קטנה (proteo-רכבי שטח) ו / או שלפוחית ​​רבת-שבשבת (proteo-MLVs) שהוקמו על ידי הסרת חומר ניקוי ב נוכחות של שומנים. רוב השיטות לשלב חלבונים בממברנה אלה לGUVs נחלקות לשלוש קטגוריות. Insertio הישירn: החלבון חוצה הממברנה התלויה בחומר הניקוי מעורבב עם שומנים בדם בלבד, GUVs מראש יצר, בלשון המעטה חומר ניקוי solubilized, וחומרי הניקוי ולאחר מכן להסיר באמצעות biobeads 21. בעוד פשוט מבחינה מושגית, שיטה זו דורשת שליטה מדויקת של ריכוז חומר הניקוי, כגבוה מדי ריכוז חומר ניקוי יכול לפזר את GUVs בעוד נמוך מדי יכול לגרום לריכוז החלבון להתפתח או מצטבר. בוס / Proteo-SUV Fusion: חלבון בproteo-רכבי שטח בשילוב עם, שומנים רק GUVs מראש יצר והיתוך הוא הקל עם פפטידים מיוחדים fusogenic 22 או חומר ניקוי 21. בדרך כלל היקף ההיתוך מוגבל מוביל לGUVs עם צפיפות חלבון נמוכה. התייבשות / Rehydration: סרט המכיל שומני חלבון נוצר על ידי התייבשות חלקית של proteo-SUV (או proteo-MLV) פתרון וGUVs לאחר מכן גדל כמו לסרט שומנים טהור. האתגר הברור הוא להגן על החלבון במהלך dehydrati החלקיבשלב 23, אבל השיטה שמש בהצלחה כדי לשקם חלבונים טרנס-קרום כגון Bacteriorhodopsin, סידן-ATPase, integrin וVDAC לGUVs 7,23 - 25. מאמר זה מתאר פרוטוקולי התייבשות / התייבשות לעשות GUVs המכיל את ערוץ המתח מגודרת אשלגן, KvAP, מpernix החיידקים הקדום, Aeropyrum היפר-thermophilic. יש KvAP רמה גבוהה של הומולוגיה לערוצי אשלגן תלויים מתח אוקריוטים 26 ומבנה הגבישי ידוע 27 , מה שהופך את מודל טוב ללימוד המנגנון של gating מתח. הייצור של proteo-רכבי השטח שתואר בפירוט בעבר ואינו חלק ממדריך זה 26,28,29. חשוב לציין, proteo-רכבי שטח KvAP לא צריך להיות מיוצרים עבור כל הכנת בוס, כפי שהם יכולים להיות מאוחסנים בaliquots הקטן (למשל, 10 μl) ב -80 מעלות צלזיוס למשך פרקי זמן ארוכים (&gt; 1 שנה). Electroformationאו נפיחות בסיוע ג &#39;לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לגדול GUVs מproteo-רכבי השטח KvAP (או proteo-MLVs). השלבים העיקריים לפרוטוקול electroformation הם באיור 1. טיפות של תמיסה של רכבי שטח המכילים החלבון מופקדות על חוטי פלטינה (שמוצגים באיור 2). התייבשות חלקית של ההשעיה SUV מובילה להיווצרות של סרט חלבון שומנים באמצעות השילוב של רכבי שטח. במהלך התייבשות, שדה AC מוחל על אלקטרודות לסייע לשכבות השומנים לdelaminate ויוצר GUVs. שדה 10 הרץ עובד היטב בעת שימוש &quot;דל מלח&quot; (&lt;5 מ&quot;מ) חיץ להחזרת נוזלים 28 וGUVs להימשך מספר שעות כדי לגדול. בניגוד לכך, מאגרים פיסיולוגיים (המכילים ~ 100 מ&quot;מ מלח) לעבוד היטב עם מתח נמוך יותר, 500 הרץ שדה AC אך דורש ממושך (~ 12 שעות) נפיחות תקופה של 15. שיטה זו מבוססת על פרוטוקול קודם, באמצעות איטו מחליק 24, אבל משתמשת בהמשך קאמרי מותאם אישיתaining שני חוטי פלטינה כפי שמוצג באיור 2 (ראה דיון לפרטים עיצוב והצעות לפשוטים יותר, מאולתר תאים). איור 3 ממחיש את שיטת נפיחות בסיוע ג &#39;. הפרוטוקול עובד היטב עם מאגרים עם ריכוזי מלח פיסיולוגיים, הוא מהיר, ומייצר GUVs עם הפצת חלבון הומוגני יותר. עם זאת, התשואה של GUVs המבודד, כנראה פגם-חופשי (כלומר, קרום הבוס הוא אחידה באורך-קשקשים אופטיים ואינו מצרף כל עצמים) הוא נמוך יותר, על אף שהוא מספק מספר מספיק לתיקון מהדק וניסויים מיקרו-מניפולציה . שיטה זו מבוססת על פרוטוקול שימוש בג&#39;ל agarose לייצר GUVs שומנים בדם רק 16 ודורש ציוד ייחודי פחות מאשר שיטת electroformation. האפיון של GUVs עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתואר, כמו גם הליכים באמצעות הגדרת תיקון מהדק סטנדרטית ללמדוד את פעילות KvAP ב&quot; מבפנים החוצה &quot;נכרת תיקוני קרום. GUVs המכיל חלבון גידול יכול להיות קשה יותר מGUVs שומנים בדם בלבד. בפרט, תשואת הבוס הסופית יכולה לסמוך ברגישות על איך בדיוק פתרון SUV מופקד ומיובש כדי ליצור ערימת הקרום. למישהו ללא כל ניסיון קודם עם GUVs, זה עשוי להיות מועיל לראשון לגדול GUVs שומנים בדם רק לאחר פרוטוקול קונבנציונלי 15,16 בי סרט הקרום נוצר על ידי הפקדת שומנים מממס אורגני. ברגע שהפרוטוקול הקונבנציונלי עובד היטב, בתצהיר SUV והתייבשות חלקית אז יכולים להיות שולטים באמצעות רכבי שטח שומנים בדם בלבד, שהם גם מאוד מועילים כאשר התאמת הפרוטוקול להרכב שומנים בדם חדש. כאשר GUVs לגדול באופן מהימן מרכבי שטח שומנים בדם בלבד, אז זה רק צעד קטן להפקת GUVs המכיל חלבון מproteo-רכבי שטח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="599">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Name of the 
			Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:149px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850356P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Egg PC L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840051P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Egg PA L-&#945;-phosphatidic acid (Egg, Chicken)</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>840101P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>850375P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">cholesterol (ovine wool, &#62;98%)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Avanti Polar Lipids&#160;</td>
			<td>700000P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRed-DHPE</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>T-1395MP</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">BPTR-Ceramide</td>
			<td style="width:132px;">Invirtogen</td>
			<td>D-7540&#160;</td>
			<td style="width:149px;">labeled lipid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Choloroform</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>22711.290</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Acetone</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20066.296</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td style="width:149px;">AnalaR Normapur</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:132px;">Kimtech</td>
			<td>7552</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Hamilton Bonaduz AG</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Amber vials and teflon cups</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>SU860083 and SU860076</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Parafilm</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>291-1214</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:132px;">eppendorf</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">diverse</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td style="width:155px;">LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sucrose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>84097-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Trehalose</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>T9531-25G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>P9333-1kg</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Hepes</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>H3375-100G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">TRIS</td>
			<td style="width:132px;">Euromex</td>
			<td>EU0011-A</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Osmometer</td>
			<td style="width:132px;">Wescor</td>
			<td>Vapro</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pH meter</td>
			<td style="width:132px;">Schott instruments</td>
			<td>Lab850</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Sonicator</td>
			<td style="width:132px;">Elmasonic</td>
			<td>S 180 H</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td style="width:132px;">Sartorius steim</td>
			<td>Minisart 16532</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Function generator</td>
			<td style="width:132px;">TTi</td>
			<td>TG315</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Platinum wires</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td>LS413074</td>
			<td style="width:149px;">99.99+%, d=0.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Polytetrafluoroethylene</td>
			<td style="width:132px;">Goodfellow</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Dow Corning &#39;high vacuum grease&#39;</td>
			<td style="width:132px;">VWR</td>
			<td>1597418</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">sealing paste</td>
			<td style="width:132px;">Vitrex medical A/S, Denmark</td>
			<td>REF 140014</td>
			<td style="width:149px;">Sigillum Wax</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x40 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0136</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Cover slides 22x22 mm No1,5</td>
			<td style="width:132px;">VWR&#160;</td>
			<td>631-0125</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">plasma cleaner</td>
			<td style="width:132px;">Harrick</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td style="width:149px;">airplasma, setting &#39;high&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon BD</td>
			<td>REF 353001</td>
			<td style="width:149px;">3.5 cmx1cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:132px;">Axon instruments</td>
			<td>Multiclamp700B</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">DAQ Card</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Labview</td>
			<td style="width:132px;">National Instruments</td>
			<td>version 8.6</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm</td>
			<td style="width:132px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:132px;">Warner Instruments&#160;</td>
			<td>Q45W-T10P</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>MP-285</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">pipette puller</td>
			<td style="width:132px;">Sutter&#160;</td>
			<td>P-2000&#160;</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Camera</td>
			<td style="width:132px;">ProSilica&#160;</td>
			<td>GC1380</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Zeiss microscope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>Axiovert 135</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">40x long working distance, Phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Objective&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">100x Plan-Apochromat NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset GFP (for Alexa-488)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF100-3</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">Filterset Cy3 (for TexasRed)</td>
			<td style="width:132px;">Horiba</td>
			<td>XF101-2</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">beta-casein</td>
			<td style="width:132px;">Sigma&#160;</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td dir="LTR" height="40" style="height:40px;width:163px;">confocal microscope</td>
			<td style="width:132px;">Nikon Eclipse TE 2000-E</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">D-Eclipse C1 confocal head</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td dir="LTR" height="20" style="height:20px;width:163px;">Objective</td>
			<td style="width:132px;">Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">Plan Fluor 100&#215; NA1.3</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td dir="LTR" height="60" style="height:60px;width:163px;">matlab</td>
			<td style="width:132px;">Mathworks</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;">for image processing and analysis of the current traces</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, kvap, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies

הענק Unilamellar שלפוחית ​​(GUVs) היא מערכת פופולרית biomimetic לחקר התופעות הקשורות קרום. עם זאת, נפוץ פרוטוקולים לגדול GUVs חייב להיות שונה כדי ליצור GUVs המכיל חלבונים הטרנסממברני פונקציונליים. מאמר זה מתאר שתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation ונפיחות בסיוע ג &#39;- כדי ליצור GUVs המכיל אשלגן ערוץ המתח מגודרת, KvAP. בשתי השיטות, פתרון של שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכיל חלבון מיובש באופן חלקי כדי ליצור ערימה של ממברנות, אשר לאחר מכן מותרת להתנפח בחיץ להחזרת נוזלים. לשיטת electroformation, הסרט מופקד על אלקטרודות פלטינה, כך ששדה AC יכול להיות מיושם בהחזרת נוזלי סרט. בניגוד לכך, שיטת הנפיחות בסיוע ג &#39;משתמשת במצע ג&#39;ל agarose כדי לשפר את התייבשות סרט. שני שיטות יכולות לייצר GUVs ב( למשל, 100 מ&quot;מ) ריכוזי מלח נמוכים (למשל, 5 מ&quot;מ) ופיסיולוגיים. GUVs וכתוצאה מכך מאופיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, והפונקציה של ערוצים מחדש נמדדה באמצעות תצורת תיקון מהדק מבפנים החוצה. בעוד נפיחות בנוכחות שדה חשמלי משתנה חשמלי (electroformation) נותנת תשואה גבוהה של GUVs ללא פגם, שיטת הנפיחות בסיוע ג &#39;מייצרת הפצת חלבון הומוגנית יותר ולא דורשת ציוד מיוחד.

הצמיחה של GUVs ניתן להעריך במהירות על ידי בחינה קאמרי הצמיחה מתחת למיקרוסקופ. לelectroformation, GUVs נוטה לגדול בצרורות לאורך חוטי הפלטינה, כפי שמוצג באיור 4. במהלך נפיחות בסיוע ג &#39;, GUVs יופיע כמבנים כדוריים שבמהירות לגדול ופתיל יחד (איור 5). <p class="jove_content" style=";...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies at JoVE

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג &#39;. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות שנחקר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

reconstitution-transmembrane-protein-voltage-gated-ion-channel-kvap

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K Views.  Université Pierre et Marie Curie.  הכינון מחדש של החלבון הטרנסממברני, KvAP, לתוך שלפוחית ​​unilamellar ענקית (GUVs) הוא הוכיח לשתי שיטות התייבשות-החזרת נוזלים - electroformation, ונפיחות בסיוע ג '. בשני השיטות, שלפוחית ​​unilamellar קטנה המכילה החלבון הם התמזגו יחד כדי ליצור GUVs כי אז יכול להיות ?...

Video: Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

לחץ לליטוש pipettes עבור Patch-clamp הקלטה משופרים

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים