The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה מבוצעת בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי משרד בית אנגליה ואוניברסיטת השירותים הווטרינריים אדינבורו. 1. זיהום של עכברים על ידי Gavage <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות זחלי Heligmosomoides polygyrus L3 במים מזוקקים עד שישה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, לשטוף זחלי L3 שלוש פעמים במים מזוקקים: צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות (עם בלם), להסיר את כל אבל 500 μl של מים (כדי למנוע זחלי L3 טבליות מטרידים) וresuspend גלולה בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטיפה השלישית, מוסיף מים עד לנפח מדויק (בדרך כלל 40 מיליליטר) ולשאוב 20 μl עם חתך טיפ 200 μl להרחיב צמצמה. מניחים שתי 20 דגימות μl על פני השטח של צלחת תרבות 60 מ&quot;מ ולספור את זחלי L3 (בדרך כלל ניידת, ונראה במיטבו תחת 50X הגדלה עם מיקרוסקופ לנתח). Resuspend גלולה הסופיים במים מזוקקים לconcentration של 2,000 זחלי L3 לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצור מעגל חיים, להדביק (C57BL / 6xCBA) עכברים 8 שבועות בן F1 עם 400 H. זחלי polygyrus L3 ב 200 μl של מים מזוקקים על ידי gavage האוראלי (לרסן את העכברים במצב הזקוף בעורף ובעדינות להעביר את מחט gavage הבוטה דרך הפה והוושט לקיבה). להתסיס ביסודיות לפני כל זיהום (זחלים ליישב במהירות במים) ולשאוב 200 μl במזרק 1 מיליליטר; להשתמש במחט gavage ייעודית עם קצה מעוגל. לזיהום ניסיון של עכברים צעירים (6-8 שבועות), או זנים טהורים אחרים (למשל C57BL / 6 או BALBc), להדביק עכברים עם 200 זחלי L3. </li></ol> 2. רביה ותחזוקה של H. polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פחם במרכז אמבטיה פלסטיק גדול ומאפשר למים ברז קרים לדרוס אותו למינימום של 30 דקות (לא רחוץ פחם פעיל הוא רעיל לזחלי L3). מסננים את המים מהאמבטיה ולמקם את הפחם על tוו שכבות של נייר סופג, והשאירו אותו חשוף לאוויר חדר עד יבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצים נדרשות, לגרד צואה הראשונה מתוך המעי הגס עם מלקחיים (ומספריים במידת צורך). אם יש צורך במספר גדול של זחלי L3, מקום עכברים על רשת תיל ולאסוף כדורי צואה על פני כמה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הצואה עם פחם מגורען ביחס של לפחות 1: 1, כדי להשיג עקביות פשוט רטוב מספיק כדי לדבוק לסנן נייר. למרוח שכבה דקה על המרכז של כמה נייר סינון לח בצלחת פטרי ומניח את זה בתיבה לחה (להוסיף קצת נייר מגבת לחה וקערת מים) בחושך במשך 12-14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר זחלי L3 מיום 7 ואילך, ולאסוף אותם, לפחות בשתי הזדמנויות לפני שהנייר שהושלך. הזחלים יוצרים טבעת מסביב לקצה של נייר הסינון; הרם את נייר הסינון מצלחת פטרי ולשטוף את הזחלים שנשארו מהצלחת (בעזרת פיפטה ו -5 מיליליטר של מים סטריליים לכל צלחת) לתוך צינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Liftאת נייר הסינון ולאסוף את הזחלים שנותרו נשארו בצלחת עם מים מזוקקים לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה פתרון השפכים ב XG 300 עבור 10 דקות. שטוף את הזחלים שלוש פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס בעד 50 מיליליטר של מים מזוקקים עד נדרשת. הערה: הזחלים להישאר קיימא ומזהם במשך לפחות 6 חודשים. </li></ol> 3. אוסף של H. מבוגרים התולעים polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשירי Baermann שונה מראש, כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים ללקט ארבע עשרה ימים לאחר ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבטן עם אתנול 70%. חותך את העור מעל הבטן ולמשוך בחזרה כדי לחשוף את דופן הבטן הקדמית. לעשות חתך קו האמצע כדי להיכנס לחלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי כולו קטן וגדול (מתריסריון הפרוקסימלי לרקטום דיסטלי). הנח לצלחת פטרי יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הבטן לכל אורכו; בלו מעי גס צואה המכיל; את המקום הזה לצלחת נפרדת להכנות ביצה מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו 20 סנטימטרים הפרוקסימלי של מעי דק שמכיל את התולעים בוגרות -identified על ידי הקיר העבה יחסית של התריסריון, ולעתים קרובות מראה אדום בשל תולעי התוך luminal. הנח לתוך צלחת פטרי (100 מ&quot;מ קוטר) עם 5 מיליליטר של הפתרון &#39;הנקס, חימם עד 37 ° C (שתי דגימות לכל צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלק מעי הפרוקסימלי מלא תולעת longitudinally עם מספריים (מספריים הסתיימו עגולים הם הטובים ביותר לכך), ולגרד את החלק הפנימי של מעי בטנה עם שתי שקופיות זכוכית כדי להסיר את התולעים. ואז להשליך את קיר הבטן הנקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעי טיפ לשקיות מוסלין קטנים, מצרך סגור ובטוח עם מהדקים מסביב לקצה של משפך הזכוכית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא משפך עם הפתרון &#39;הנקס ולהוסיף כ 4 צלחות פטרי של תולעים לכל משפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון מקום 37 ° C חממה במשך 1-2 שעות, בעדינות להסעיר חצי דרך כדי לסלקפסולת ממעי ההכנה שעשויה לחסום את מסנן המוסלין. תשמור על עצמך, כדי למנוע דליפה של פסולת מחוץ לשקית המוסלין - זה יגרום זיהום של הכנת הס הסופית. צריכה היגרו תולעים בוגרות באיטיות דרך בד המוסלין והתיישבו בחלק התחתון של מבחנת זכוכית. לנתק בזהירות את המבחנה מצינור גומי חיבור מעל הכיור (טיפול כדי למנוע אובדן של תולעים בשלב זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את התולעים לתוך צינור 50 מ&quot;ל ולשטוף שש פעמים עם הנקס &#39;פתרון (לאפשר תולעים להתיישב עם כוח הכבידה, להסיר תקשורת עם stripette, להוסיף 40 מיליליטר של הנקס&#39; הפתרון וחזור חמש פעמים). הערה: תרבות תולעת חייבת להישמר סטרילי מנקודה זו ואילך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לזרימה למינרית ולשטוף עוד שש פעמים בפתרון &#39;הנקס סטרילי בתוספת 100 U / ml פניצילין ושל 100 מק&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, מוכן לתרבות במבחנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזןתולעים בוגרות התאוששו על ידי לקיחת שתי דגימות של 20 μl נלקח עם קיצוץ קצה צהוב להרחיב צמצמה; מצפה כ -50% מהכמות של זחלים מחוסן. </li></ol> 4. הגדרת תרבויות להס: הכנה בינונית, כביסה תולעים בוגרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את התולעים מ3.11 בכ 10 מיליליטר של RPMI בתוספת 10% gentamycin במשך 20 דקות, והשאיר את מנוחת הצינור בזווית כדי להבטיח תולעים מכוסים במלואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את זה בזרימה למינרית: לשטוף שוב שש פעמים עם הפתרון &quot;הנקס (בתוספת 5 U / ml פניצילין ו5 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן H. תקשורת polygrus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על סטריליות בזרימה למינרית מכסה המנוע, 500 מיליליטר של RPMI1640, להוסיף 11.1 מיליליטר של 45% גלוקוז (ריכוז סופי 1.2% כRPMI1640 מכיל גלוקוז 0.2%), 5 מיליליטר של 100x Peniclllin סטרפטומיצין (ריכוז סופי 5 U / ml פניצילין, 5 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר), 5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 2 מ&quot;מ), ו5 מיליליטר של gentamycin (ריכוז סופי 1%). אל תוסיף FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעי Aliquot לתוך צלוחיות T25 פרקו, כ. 1,000 תולעים בH. 15 מיליליטר תקשורת polygyrus לכל בקבוק, ומקום זקוף ב -37 חממת ° C (5% CO 2) במשך 3 שבועות. </li></ol> 5. הכנת הס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף הס המכיל תקשורת ותרבות מתרבויות במרווחים של לא יותר מפעמיים בשבוע, להניח בצד את האוסף הראשון לאחר 24 שעות של התרבות (עקב רמות גבוהות של זיהום LPS וחלבוני מארח - יכול להיות מעובד בנפרד או שהושלך). שמור כל איסוף נפרד ומסומן עם מספר התאריך ויצווה בבירור. החלף עם נפח שווה של H. תקשורת polygyrus בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הס המכיל תקשורת ב 400 x גרם במשך 5 דקות. אז לסנן לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר מסננים דל חלבון מחייב לצינורות 50 מיליליטר. חנות ב-20 ° C במקפיא שכותרתו עם תאריך של קציר תולעת ותאריך ג הס ברורollection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 21 ימים של אוסף הס מתרבות, להשליך תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500-1,000 מיליליטר בריכה של supernatant הס (בדרך כלל ממניות קפוא, ולא כולל את אוסף שעות 24 הראשונים) ולהתרכז על מסנן 3,000 MWCO במכשיר אולטרה תחת לחץ חנקן. הערה: היה זהיר מאוד שלא לתת ליבש מסנן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את מכשיר הסינון, ראשון לשטוף את הצד המבריק 3 קרום kDa למטה בכוס 1 ליטר עם מים מזוקקים במשך 3 x 20 דקות תוך בחישה. להרכיב את מכשיר אולטרה סינון לפי הוראות יצרן עם קרום מסנן צד מבריק למעלה. מקום בארון על 4 מעלות צלזיוס ולהעביר 50 מיליליטר של מים מזוקקים דרך לפני שמתחיל להתרכז הס נקווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף צינור אחד של הס למכשיר הסינון כנדרש (100-140 מיליליטר ביום), עד הנפח מרוכז עד 2-5 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר מזהמים מכלי תקשורת התרבות הס המכיל, להוסיף 50 מיליליטר של PYRעוגן ללא PBS למכשיר הסינון ולאחר מכן להתרכז עד כ 2 מיליליטר. חזור על פעולה זו פעמיים (150 מיליליטר של PBS בסך הכל). העבר את הס לתוך צינור 15 מיליליטר, לעקר מסנן (עם מסנן 0.2 מיקרומטר) בזרימה למינרית ולמדוד ריכוז חלבון באמצעות ספקטרופוטומטר (E 280 = 10) או על ידי assay ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot, תווית עם מספר האצווה ותאריך, והקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay LAL chromogenic על פי הפרוטוקולים של היצרן על כל אצווה של הס לפני השימוש. אם רמות LPS הן גדולות מ -1 U LPS חלבון 1 מיקרוגרם ל, לשקול לא באמצעות אצווה זה לin vivo ניסויים או בתרבויות חוץ גופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הס שנאסף ב 24 שעות בנפרד באותו אופן; הוא יכיל LPS וכמה חלבוני מארח ו, ואילו אינו מתאים לניסויים פונקציונליים, היא מהווה מקור שימושי של מולקולות בודדות שעשויים להיות מבודדת על ידי טיהור זיקת נוגדן חד שבטי. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

מחזור החיים של H. תמורת polygyrus באופן מהימן ועקבי. בעקבות בליעה טבעית או gavage פה של זחלי L3 ביום 0, ציסטות מתחילות להיווצר מתחת לserosa התריסריון ביום 5, התקדמו לmoults זחל ולאחר מכן מתעוררות כמו תולעים בוגרות לתוך לום הבטן מיום 10, ניתן לראות ביצים בצואה מ יום 14 וגרנולומות גלויים על פני השטח serosal התריסריון מיום 21. הפרוטוקול שתואר לעיל (ומסוכם באיור 6) מאפשר לייצור תפוקה גבוהה של ח מוצרי polygyrus הפרשה-הפרשה (הס), בנוסף להתאוששות אמינה של זחלי L3 קיימא לזיהומי מחזור ניסיוניים וחיים בעתיד. זיהום polygyrus H. הוכח להיות מגן במודלים של אסתמה תלויות בOVA או Der p 1 (אלרגן קרדית אבק הבית) 14. יתר על כן, דיכוי הדלקת בדרכי אוויר יכול להיות מועבר עם CD4 + CD25 + </sup&gt; תאי T רגולטורים 14 או CD19 + CD23 תאי B רגולציה היי 24 מאינם רגישים, ח &#39; polygyrus -infected עכברים. במודלים של אוטואימוניות, ח &#39; זיהום polygyrus הוכח להיות מדכא במודל הניסויי Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE) של טרשת נפוצה 9, ודיכוי ניתן להעביר גם עם תאי CD4 + T או CD19 + B תאים מעכברים נגועים 24. חומרי ההפרשה-הפרשה polygyrus Heligmosomoides (הס) לווסת את התגובה החיסונית המארחת ולדכא דלקת בתיווך Th2 על ידי מספר המנגנונים (שמתוארים באיור 7), ובם: א) עיכוב של היענות תאים דנדריטים לגירוי 25, ב ​​אינדוקציה) של CD4 תאים + Foxp3 + רגולציה T 18. וג) מצור של IL-33 ייצור 20. הס הוכח להיות מגן כאשר מנוהלרגישות t או אתגר במודל OVA-אלום של אסטמה 19 וגם כאשר מנוהל intranasally עם האלרגן תמצית Alternaria 20, דרך דיכוי של IL-33 שחרור מוקדם. הימנעות מזיהום LPS של הס היא לעתים קרובות חיונית להצלחה של ניסויים חיסוניים עתיד. בפרוטוקול שתואר כאן, השלבים הקריטיים בהשגת מטרה זו הם להבטיח כי פסולת הכלול בתוך שקיות המוסלין של מכשירי Baermann לא נכנס להכנת הס הסופית (ראו 2.10) ולהניח בצד את פתרון ES מהשעה 24 הראשונה של תרבות (ראה 5.1). בשנים האחרונות, הס התאפיין ביסודיות ברמת proteomic עם מעל 370 חלבונים שונים זיהו 26,27. בנוסף, ES מזחלי שלב 4 כבר נתון לניתוח proteomic 28. עבודה שוטפת כוללת אפיון הרכיבים העיקריים של סוכרי הס, ידועים להיות מאוד חיסוני 3, ומופרשת מיקרו-RNשכגלומים 50-100 ננומטר שלפוחית ​​או exosomes (Buck et al., הוגשה לפרסום). עם הקמתה של פרוטוקולים לשחזור לאיסוף ES מטפיל המערכת החיסונית הזה מאוד, ועם נתונים proteomic נרחבים זיהוי הרכיבים המולקולריים של הס, השלב מוגדר כעת לזיהוי והבדיקה רפואית של מולקולות בודדות מH. polygyrus שיכול לתווך השפעות מרכזיות על המערכת החיסונית המארח.

polygyrus Heligmosomoides הוא helminth עיכול עכברי טבעי הקשור באופן הדוק לטפילי נמטודות אדם מאוד-נפוצים 1. בניגוד לדגמים אחרים, כגון נמטודות Nippostrongylus brasiliensis, ח &#39; polygyrus קובע באופן עקבי זיהום כרוני בעכברים כתוצאה ישירה של מנגנוני המערכת החיסונית חזקה מרובים היא מעסיקה כדי לדכא את התגובה חיסונית המארח 2. יש polygyrus H. מחזור חיים ישיר: זחלי L3 מזהמים הם מעובדים על ידי העברת feco-שבעל-פה (או מנוהלים על ידי gavage האוראלי במעבדת ההגדרה), ואז הם נודדים לשכבת subserosal של התריסריון וencyst לפני ההחזרה ללומן המעי כ תולעים בוגרות שמונה כ ימים לאחר הדבקה ראשונית. ייצור הזדווגות והביצה מתרחש ביום 10 ואפשר לקצור תולעים בוגרות לתרבות ואוסף של חומרי הפרשה-הפרשה מday 14 3. ואילך H. polygyrus גם אינטראקציה עם מיקרופלורת commensal, עם לקטובצילוס המוגבר הנוכחית בעכברים נגועים רגישים 4-6, ורמות גבוהות של ח זיהום polygyrus בעקבות החשיפה של עכברים ללקטובצילוס 6. זיהום פעיל עם ח &#39; polygyrus הוכח כדי להגן מפני immunopathology במודלים של בעלי חיים רבים של אוטואימוניות 7-10, קוליטיס 11,12 והאלרגיה 13-16. כתוצאה מכך חל עניין רב בפוטנציאל של מולקולות טרמינל-הפרשה מטפיל זה (&quot;הס&quot;) ללמטה לווסת פתולוגיה in vivo 17,18. ואכן, השפעות מגנות נראות לאחר טיפול של עכברים עם מוצרי הס 19 דרך מסלולים אשר כעת עוברות זיהו 18,20. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצור אמין של polygyrus Heligmosomoides וההתאוששות של מוצרים המופרשיםשיכול להיות מנוצל נוסף עבור מגוון רחב של חקירות ביוכימיים וחיסוניות תפקודיות.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

polygyrus Heligmosomoides (שנקרא בעבר dubius Nematospiroides, וגם מכונה על ידי כמה כH. bakeri) הוא helminth עיכול שמעסיק מנגנוני המערכת החיסונית מרובים להקים זיהום כרוני בעכברים ובקירבת זיהומי helminth אנושיים נפוצים. H. polygyrus נחקר בהרחבה בתחום הרגולציה חיסונית הנגזר helminth וכבר מצא לדכא בעצמה מודלים ניסיוניים של אלרגיה ואוטואימוניות (שניהם עם מוצרים מופרשים מבודדים זיהום ופעיל). הפרוטוקול המתואר במאמר זה מתאר ניהול H. מחזור החיים polygyrus לייצור עקבי של זחלי L3, התאוששות של טפילים בוגרים, ואוסף של המוצרים שלהם ההפרשה-הפרשה (הס).

רגישות לזיהום עם ה &#39; polygyrus נשלט במידה רבה על ידי הרקע הגנטי של זן העכבר (טבלת 1); עכברי C57BL / 6 וCBA רגישים 21,22 מאוד. לתחזוקה של מחזור החיים טפילים, ההיברידי F1 בין שני זנים אלה נבחר ליכולתו לעמוד נטל תולעת הרבה יותר גבוה ללא תחלואה (נזק אפיתל במעי מוגזם) בהשוואה לאו מתח הורי. האוראלי gavage של 400 זחלי L3 משמש כדי לשמור על מחזור החיים בעכברי F1 (וכתוצאה מכך נטל תולעת בוגר שמוצג באיור 2), בעוד במינון של 200 זחלי L3 משמש בדרך כלל לניסויים בזנים טהורים הומוזיגוטים (למשל, C57BL / 6 או BALBc). עם זאת, מינון זה ייתכן שיהיה הצורך מופחת בהתאם לשיתוף גורמים סביבתיים שעלולות להיות שונה בין מתקני בעלי חיים, כגון שינויים בפלורת מעיים. קבוצות של הס הוכיחו אפי לשעתקcacy במבחנים פונקציונליים ובהרכב חלבון; יתר על כן, כאשר supernatants מכל שבוע של התרבות רצוף נותח, עד לסך של 4 שבועות, פרופילי החלבון נמצאו דומה מאוד (איור 3). כאשר ריכוז הס נמדד על ידי assay ברדפורד (ראה 5.5), הכולל חלבון הוא בדרך כלל כ 1 / מ&quot;ג מיליליטר (איור 4). שיטה חלופית של ריכוז הס היא עם רכז צנטריפוגלי (למשל קרום חתוך 3-kDa Vivaspin), שבו דגימות הם הסתחררו במהירות של עד 4,000 גר &#39;בצנטריפוגה הרוטור את נדנדה, הסרת מלחי חיץ ורכיבי משקל מולקולריים נמוכים. ריכוז צנטריפוגלי הוא מתאים ביותר לנפחים קטנים עיבוד (1-10 מיליליטר) ומוגבלים לגורם ריכוז מרבי של כ 30x. בעת איסוף הס, הימנעות מזיהום היא קריטית. כדי למנוע זיהום עם מולקולות מארח, אנחנו זורקים את הס-המשךaining תקשורת ותרבות מ24 שעות הראשונות לאחר קציר תולעת בוגר מהמעי העכבר. אנחנו גם לכמת את רמת זיהום LPS בכל אצווה של הס עם assay Chromogenic LAL (ראה 5.7). 1 U של LPS משווה ל ~ 100 pg LPS והרמות מתחת זה נחשבות זניח 23. בידיים שלנו, רוב קבוצות של הס באופן משמעותי מתחת לגבול זה, הריכוז הממוצע של LPS בהס להיות 0.23 U / מיקרוגרם (איור 5). ההשפעות של LPS במודלי in vivo של פתולוגיה (למשל דיכוי תגובות אסתמה) דורשת לפחות 10 ng של LPS 23. מכאן בממשל vivo של 5 מיקרוגרם הס מיצווה עם 100 pg LPS / מיקרוגרם הס יכלול 500 pg LPS, הרבה מתחת לריכוז היעיל בי LPS הופך לבעיה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> איור 1: מכשירי Baer Baermannהתקנת מכשירי מאן לאוסף של H. הבוגר polygyrus (כפי שתואר בסעיף 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> איור 2: ממוצע נטל תולעת 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 תולעת L3 זחלי Mean מכביד 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 זחלי L3. נקודות הנתונים המוצגות הן מ -19 סיבובים נפרדים של זיהום של עכברי C57BL / 6xCBA. ממוצע ± SEM מוצג. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> איור 3: פרופילי חלבון של הס משבועות רצופים בפרופיל SDS-PAGE תרבות של חלבוני הס שנאספו בשבועות רצופים של התרבות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> איור 4: </s<html> trong&gt; כמות סופית של הס מ -500 מדיה תשואה של חלבון הס מ -11 קבוצות שונות הנגזרות מכ -500 מיליליטר של supernatant התרבות המכיל ES מיליליטר. ממוצע ± SEM מוצג. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> איור 5: LPS זיהום של רמות הס של זיהום LPS ב 41 קבוצות של הס שנמדדו על ידי assay ameobocyte Limulus. ריכוז LPS חציון = 86 U למ&quot;ג של הס. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> איור 6: אנימציה סכמטי של H. סיכום polygyrus מחזור החיים של שלבי מחזור החיים של מפתח מgavage הפה של זחלי L3, דרך התאוששות של תולעי זחלים ומבוגרים לבידודה של הס. -together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig7highres.jpg" /> איור 7: אנימציה סכמטי של הס ופונקציות ההשפעות החיסונית מפתח של מתווכים מסיסים וexosomes הכילו בתוך הס. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> גנוטיפ (ומתח ברקע) </td><td> הפנוטיפ זיהום העיקרי </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> זנים טהורים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> / J, CBA, C3H </td><td> מאוד רגיש </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 וC57BL / 10 </td><td> רגיש </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / ג, DBA / 2, 129 / J </td><td> ביניים </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> רגישות נמוכה </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס לציטוקינים או קולטני ציטוקינים </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> רגיש יותר </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> רגיש פחות (א); לא חל שינוי ברגישות אך גרנולומות המוגברת (ב) </td><td> (א) 33 </td></tr><tr><td> (ב) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ הטרנסגניים (C57BL / 6) </td><td> עמיד </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> פוריות גבוהה יותר </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 או BALB / ג) </td><td> מאוד רגיש </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c או C57BL / 6) </td><td> מאוד עמיד </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 טרנסגניים(FVB) </td><td> עמיד </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Th2 הלקוי, ירד gormation granuloma </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / ג) </td><td> רגיש יותר </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / ג) </td><td> אין שינוי ברגישות </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Th1 הגבוה רגישות מוגברת, </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס עבור סמני תא T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / ג) </td><td> פוריות שולית גבוהה יותר </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / ג) </td><td> פוריות גבוהה יותר </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / ג) </td><td> ופוריות גבוהה יותר160 #; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס ללוקוסי חיסון מולדים </td><td></td></tr><tr><td> קולט מסוג 1 אינטרפרון (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> פוריות גבוהה יותר, יותר גרנולומות </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> יותר גרנולומות עמידה יותר, </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / WV (WBB6) </td><td> רגיש יותר </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: זיהומים ראשוניים עם ח &#39; polygyrus בזנים שונים עכבר וגן-targetted גנטיים.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה &#39; מחזור החיים polygyrus.

טיפוח<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.3K Views.  University of Edinburgh.  polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה ' מחזור החיים polygyrus. 

Video: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of several pathogens. Efforts have been dedicated to the cattle tick control to diminish its deleterious effects, with focus on the discovery of vaccine candidates, such as BM86, located on the surface of the tick gut epithelial cells. Current research focuses upon the utilization of cDNA and genomic libraries, to screen for other vaccine candidates. The isolation of tick gut cells constitutes an important advantage in investigating the composition of surface proteins upon the tick gut cells membrane. This paper constitutes a novel and feasible method for the isolation of epithelial cells, from the tick gut contents of semi-engorged R. microplus. This protocol utilizes TCEP and EDTA to release the epithelial cells from the subepithelial support tissues and a discontinuous density centrifugation gradient to separate epithelial cells from other cell types. Cell surface proteins were biotinylated and isolated from the tick gut epithelial cells, using streptavidin-linked magnetic beads allowing for downstream applications in FACS or LC-MS/MS-analysis.

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A modified density centrifugation gradient-based methodology was utilized to isolate epithelial cells from Rhipicephalus microplus gut tissue. Surface-bound proteins were biotinylated and purified through streptavidin magnetic beads for utilization in downstream applications.

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Biochemistry

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Genetics

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro (Protozoa Culture) and in vivo (Microinjection into Termite Hindgut)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean termites are dependent on protozoa in the hindguts of workers to efficiently digest wood. Lytic peptides have been shown to kill a variety of protozoan parasites (Mutwiri et al. 2000) and also protozoa in the gut of the Formosan subterranean termite, Coptotermes formosanus (Husseneder and Collier 2009). Lytic peptides are part of the nonspecific immune system of eukaryotes, and destroy the membranes of microorganisms (Leuschner and Hansel 2004). Most lytic peptides are not likely to harm higher eukaryotes, because they do not affect the electrically neutral cholesterol-containing cell membranes of higher eukaryotes (Javadpour et al. 1996). Lytic peptide action can be targeted to specific cell types by the addition of a ligand. For example, Hansel et al. (2007) reported that lytic peptides conjugated with cancer cell membrane receptor ligands could be used to destroy breast cancer cells, while lytic peptides alone or conjugated with non-specific peptides were not effective. Lytic peptides also have been conjugated to human hormones that bind to receptors on tumor cells for targeted destruction of prostate and testicular cancer cells (Leuschner and Hansel 2004).
In this article we present techniques used to demonstrate the protozoacidal activity of a lytic peptide (Hecate) coupled to a heptapeptide ligand that binds to the surface membrane of protozoa from the gut of the Formosan subterranean termite. These techniques include extirpation of the gut from termite workers, anaerobic culture of gut protozoa (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni, Spirotrichonympha leidyi), microscopic confirmation that the ligand marked with a fluorescent dye binds to the termite gut protozoa and other free-living protozoa but not to bacteria or gut tissue. We also demonstrate that the same ligand coupled to a lytic peptide efficiently kills termite gut protozoa in vitro (protozoa culture) and in vivo (microinjection into hindgut of workers), but is less bacteriacidal than the lytic peptide alone. The loss of protozoa leads to the death of the termites in less than two weeks.
In the future, we will genetically engineer microorganisms that can survive in the termite hindgut and spread through a termite colony as "Trojan Horses" to express ligand-lytic peptides that would kill the protozoa in the termite gut and subsequently kill the termites in the colony. Ligand-lytic peptides also could be useful for drug development against protozoan parasites.

Testing Protozoacidal Activity of Ligand-lytic Peptides Against Termite Gut Protozoa in vitro Protozoa Culture and in vivo Microinjection into Termite Hindgut

We present procedures for demonstrating that ligands bind to the surface membrane of the cellulose-digesting protozoa in the gut of Formosan subterranean termites using fluorescent microscopy and that ligands coupled with lytic peptides kill these protozoa in vitro (anaerobic protozoa culture) and in vivo (injection into the termite hindgut).

בדיקת פעילות של ליגנד Protozoacidal-ממוסס פפטידים נגד גוט הטרמיטים פרוטוזואה במבחנה (תרבות פרוטוזואה) ו In vivo (Microinjection לתוך טרמיטים במעי האחורי)

We are developing a novel approach to subterranean termite control that would lead to reduced reliance on the use of chemical pesticides. Subterranean ...

Biology

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

הקמת תרבויות בינאריות יציבות של סקרייבקטריה סימביוטית מחלל הפה

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

טיפוח

Summary

Explore More Videos

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ