שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגסטרואנטרולוגיה על ההשפעה של חברי המיקרוביוטה, במיוחד אלה של הסוג הליקובקטר, על דלקת וסרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר של זיהום הליקובקטר והשפעתו על הבטן בתנאים פיזיולוגיים. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת פיתוח של טיפולים למניעה או חיסול של זיהום הליקובקטר או ההשלכות שלה, כולל אנטיביוטיקה, תרופות, או חיסונים.
שיטות אלה מספקות תובנה ספציפית לפתוגנזה של זיהום הליקובקטר. עם זאת, כמה טכניקות עשוי להיות מותאם לחקר פתוגנים אחרים במערכת העיכול. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם הכנת אינוקולום חיידקי המסוגל ליצור זיהום בעכברים.
זה הכרחי כי המבודדים הליקובקטר ידועים עכבר קולוניזציה זנים שלא עברו תת תרבות נרחבת במבחנה. בנוסף, יש לתעד את מספר תת-התת-ת-תים במבחנה עבור זנים אלה. הוסיפו מתלים חיידקיים לצינורות פוליסטירן 15 מיליליטר, ולהשתמש בלולאת פלסטיק כדי להעביר טיפה אחת של 10 עד 20 מיקרוליטר מכל תרבות לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות.
לאחר מכן, להעריך את הכדאיות ואת תנועתיות של החיידקים תחת מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה בהגדלה 100 פעמים. השתמשו באנוקולה H.pylori רק אם לרוב החיידקים יש צורת מרה. H.felis אינוקולה צריך בעיקר להכיל חיידקים בצורת סם.
ולטעון את האנוקולה למזרקים בודדים, חד פעמיים, מיליליטר. לצייד כל מזרק עם מחט 23-מד, ולהשתמש בסרט פרפין פלסטיק לחבר קטטר פוליאתילן חד פעמי לכל מחט. לאחר מכן, רסן ידנית עכבר בן שישה עד שמונה שבועות ללא פתוגן ועכבר נטול הליקובקטר על ידי עורף הצוואר והזנב, והכנס קטטר אחד למרכז הלסת הפתוחה.
מדריך קטטר caudal לכיוון הוושט, הארכת הצוואר של העכבר כדי לאפשר קלות גישה לקיבה דרך הוושט הרחק קנה הנשימה עד רוב או כל הקטטר כבר לא נראה והתנגדות מורגשת. לאחר מכן, לספק לפחות פעם אחת 10 לחיידקים החמישי כדי להבטיח קולוניזציה אופטימלית ופתולוגיה של המחלה. בסוף הניסוי, השתמש במספריים דקים ומעוקלים כדי לפתוח את חלל הבטן לכרסום בבטן.
חותכים את הבטן לאורך העקמומיות הגדולה יותר, ושוטפים בעדינות את האיבר פעמיים בצינור אחד של 50 מיליליטר של PBS טרי לכל שטיפה כדי להסיר כל מזון שיורית. לאחר הכביסה השנייה, מניחים את הרקמה לתוך תבשיל פטרי מפלסטיק מוכתם באורך שישה ס"מ כדי לתעד את המשקל הרטוב. לאחר שיטוח הקיבה, חצי את הדגימה בשטויות לשני שברי רקמות שווים המרכיבים את אזורי הנמלים, הגוף והפורטנום הלא-בלוטות.
הסר את האזור שאינו הבלוטות, ולשקול מחצית מכל קיבה לפני אחסון פיסת הרקמה בתתפיסה המתאימה לניתוח במורד הזרם המתוכנן. מוסיפים את החצי השני של רקמת הקיבה לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 10% פורמלין, משטח את הרקמות נגד הצדדים העליונים של הצינורות לאחר 10 שניות. כאשר הרקמות הפכו מודבקות על קירות הצינור, לטבול מחדש את הדגימות בפורמלין לפחות 24 שעות.
כדי לספור את מספר H.pylori קיימא בקיבה לאחר זיהום, הומוגניזציה דגימות הקיבה המאוחסנים BHI, ולבצע דילול סדרתי כפול של הומוגנטים קיבה וכתוצאה מכך מרק טרי, סטרילי. לחלק אגר דם סוס מיובש מראש, או HBA, צלחות בתוספת אנטיביוטיקה נוספת לשלושה או ארבעה קטעים, ו, באמצעות התאמה של טכניקת מיילס ומיסה, להוסיף 10 עד 100 microliters של כל דילול הומוגני בקיבה על קטע של כל צלחת אגר. מורחים את ההומוגנים בלולאות פלסטיק סטריליות ומאפשרים לצלחות להתייבש.
לאחר מכן, מניחים את הצלחות במצב הפוך בצנצנות גז אנארובה המכילות צלחת פטרי של מים וחבילת גז. לאחר מכן, הדגירה את הצנצנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבעה עד שבעה ימים. כאשר ניתן לצפות במושבות, למנות את המקטעים המכילים בין 10 ל 100 מושבות מבודדות.
לאחר המתת חסד, הקיבה נקצרת מבעלי החיים ומשקלו. האזור הלא בלוטות מוסר, והקיבה מחולקת לשני חצאים שווים המרכיבים את הנמלים והגוף. קולוניזציה מוצלחת מאושרת בדרך כלל על ידי ביצוע ספירה בת קיימא וספירה עוקבת של מושבות בודדות מהומוגנטים קיבה מפוספס על לוחות HBA.
שים לב כי נוכחות של חיידקים מזהמים מן microbiota קיבה העכבר או מספר גדול של מושבות H.pylori יכול לסבך את ספירת H.pylori CFUs. לחלופין, PCR ניתן להשתמש כדי לאמת זיהום באמצעות פריימרים מאומתים ספציפיים מכוונים לאזור זוג 325 בסיס של H.felis ו H.pylori ureB גנים. בניסוי מייצג זה, עכברים מסוג פראי C57 Black-6 הראו סימנים מתונים של דלקת, כולל היפרפלזיה ניוון בלוטה בשישה חודשים לאחר ההדבקה עם H.felis, כמו גם חדירה תאית של submucosa.
דלקת חמורה יותר נצפתה בעכברים נוקאאוט באותו זמן נקודה, עם נוכחות נוספת של זקיקי הלימפה נצפתה בסמיכות חדירות הסלולר. חיידקי H.felis ניתן גם לדמיין בחלקים מוכתמים Giemsa של רקמת קיבה עכבר נגוע. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR כמותי, אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence כדי לענות על שאלות נוספות על סוגי התגובות המארח המושרה במהלך זיהום הליקובקטר.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה וגסטרואנטרולוגיה לחקור את התפקיד הסיבתי של הליקובקטר פילורי במחלות קיבה בבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להדביק עכברים להתרבות עם מיני הליקובקטר וללמוד את הפתולוגיה הקשורה לזיהום. אל תשכח כי זני הליקובקטר המשמשים בפרוטוקול זה הם זיהומיות, ולכן נהלים biosafety סטנדרטי תמיד צריך להיות אחריו תוך כדי עבודה עם חיידקים אלה.
