Name: cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
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The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 영국 홈 오피스 에딘버러 수의학 대학에서 정한 지침에 따라 수행된다. 위관 마우스 1. 감염 <ol><li> 6 개월까지 4 ° C에서 증류수에 보관 Heligmosomoides polygyrus L3 유충. </li><li> 사용 전에 증류수에 L3 유충을 세 번 세척 : 원심 분리기 (브레이크) 10 분 300 XG에, 물을 제외한 모든 500 μl를 제거 (방해 펠렛 L3 유충을 피하기 위해) 및 펠릿 때마다 재현 탁. </li><li> 세 번째 세척의 경우, 그 구멍을 넓혀 200 μL 팁 컷 정확한 볼륨 (일반적으로 40 ml) 및 흡인 20 μl를 물을 추가합니다. (모바일 및 최적의 해부 현미경으로 50 배 확대하여 봅니다 보통) 60mm 배양 접시의 표면에 두 개의 20 μL 샘플을 놓고 L3 유충을 계산합니다. concentratio 증류수에 최종 펠렛을 재현 탁1 ㎖ 당 2,000 L3 유충의 명. </li><li> 라이프 사이클 생산을위한, 400 H. 8 주 된 F1 (C57BL / 6xCBA) 쥐를 감염 구강 투여에 의한 증류수 200 μL에 polygyrus L3 유충 (목덜미에 의해 수직 위치에 마우스를 억제하고 부드럽게 위장으로 입과 식도를 통해 무딘 위관 바늘을 통과). 선동 각각의 감염 (유충은 물에 빨리 정착) 및 흡인 1 ML의 주사기에 200 μL에 철저하게 사전; 끝이 둥근로 전용 위관 바늘을 사용합니다. 젊은 쥐의 실험 감염 (구 6~8주), 또는 다른 근친 균주 (예 : C57BL / 6 BALBc)의 경우, 200 L3 유충 쥐를 감염. </li></ol> 2. 전파 및 H. 유지 보수 polygyrus <ol><li> 대형 플라스틱 욕조의 중심에 숯을 넣고 차가운 수돗물을 최소 30 분을 위해 그것을 통해 실행 할 수 있습니다 (씻지 않은 활성탄 L3 유충에 독성). 욕조에서 물을 배출하고 t에 숯을 배치완전히 건조 될 때까지, 실내 공기에 노출 떠나는 흡수지 층, WO. </li><li> 계란이 필요한 경우 (필요한 경우 가위), 최초의 집게로 결장 중 대변을 다 쳤어요. L3 유충의 다수가 필요한 경우, 와이어 그리드에 마우스를 위치시키고 며칠 동안 분변 펠렛을 수집한다. </li><li> 다만 종이 필터에 부착 할 정도로 감쇠 일관성을 달성하기 위해, 한 적어도 하나의 비율로 과립 숯 대변 섞는다. 페트리 접시에 일부 젖은 필터 종이의 중앙에 얇게 바르고 습기 상자에이 배치 12-14일의 어둠 속에서 (일부 젖은 종이 타월과 물 접시를 추가). </li><li> 이후 7 일에서 L3 유충을 제거하고 용지가 폐기되기 전에 적어도 2 번의 그들을 수집합니다. 애벌레는 여과지의 가장자리 주위에 고리를 형성하고; 페트리 접시에서 필터 종이를 들어 올려 50 ㎖ 튜브에 (펫 및 플레이트 당 멸균 물 5ml를 사용하여) 판으로 남아있는 유충을 씻어. </li><li> 승강기및 여과지 오프 나머지 유충 50 ㎖ 튜브에 증류수를 플레이트에 남아 수확. 10 분 동안 300 XG에 유출 물 용액을 원심 분리기. 증류수로 유충을 세 번 세척하고 필요한 때까지 증류수 50 ml를 4 ° C에 저장합니다. 주 : 유생 생존을 유지하고, 적어도 6 개월 이상 감염성. </li></ol> 성인 H. 3. 컬렉션 polygyrus 웜 <ol><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 미리 변형 Baermann 준비 장치. </li><li> 십사일 감염 후 발췌 마우스. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 씻으십시오. 복부를 통해 피부를 잘라 전방 복벽을 공개 철수. 복강를 입력 정중선 절개를합니다. </li><li> (원위부 직장에 근위 십이지장에서) 전체 크고 작은 창자를 제거합니다. 건조 페트리 접시에 놓습니다. </li><li> 전체 길이를 따라 장을 직선화; 대변​​ 함유 대장을 절제; 나중에 계란 준비를위한 별도의 접시에이를 배치합니다. </li><li> 때문에 내 내강 벌레 십이지장 종종 붉은 모양의 비교적 두꺼운 벽에 의해 증명되는 어른 벌레가 포함되어 소장의 근위 20cm를 절제. 행크스 &#39;액 5 mL를 (100mm 직경) 페트리 접시에 놓고, 37 ° C (접시 당 두 개의 표본)로 가열. </li><li> 가위 (라운드 종료 가위이 가장 아르)와 종 방향 웜 가득 근위 창자 부분을 열고 웜을 제거하기 위해 두 개의 유리 슬라이드 라이닝 장 내부에 아래로 긁어. 그런 다음 깨끗한 창자 벽을 폐기합니다. </li><li> 작은 모슬린 가방에 팁 웜, 주식 폐쇄 및 유리 깔때기 (그림 1)의 가장자리 주위에 클립으로 고정합니다. </li><li> 행크스 &#39;솔루션으로 깔때기를 작성하고 각 깔때기에 웜의 약 4 페트리 접시를 추가합니다. </li><li> 1 ~ 2 시간 동안 37 ° C 배양기에 넣어 장치, 부드럽게 반까지 교반하면 빠지지모슬린 필터를 막다 수있는 장 준비에서 파편. 모슬린 가방 외부 이물질의 유출을 방지하기 위해주의 -이 최종 HES 제제의 오염의 원인이됩니다. 성인 웜 천천히 모슬린 천 통해 이주 및 유리 시험관의 하단에 정착한다. 조심스럽게 (이 시점에서 웜을 잃지 않도록주의하면서) 싱크를 통해 연결 고무 호스에서 테스트 튜브를 분리합니다. </li><li> 플라스틱 피펫을 사용하여, 50 ㎖ 튜브에 웜을 전송하고 씻어 여섯 번 행크스와 함께 &#39;솔루션 (웜 stripette와 미디어, 중력 침전 제거 할 수 있도록 허용, 추가 행크스의 40 ml의&#39;솔루션을 다섯 번 반복). 참고 : 웜 문화는 이후이 시점에서 멸균 보관해야합니다. <ol><li> 층류 후드로 이동 100 U / ml의 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 체외 문화에 대한 준비와 보충 멸균 행크스 &#39;솔루션에 다른 여섯 번 씻는다. </li></ol></li><li> 카운트그 구멍을 넓혀 노란색 팁 인하와 함께 찍은 20 μL의 두 샘플을 채취하여 복구 어른 벌레; 접종 유충의 양의 약 50 %를 기대합니다. </li></ol> 중간 준비, 성인 웜을 세척 4. HES에 대한 문화를 설정 <ol><li> RPMI의 약 10 ml의 3.11에서 벌레를 적시는 벌레가 완전히 덮여 수 있도록 각도로 튜브 휴식을 떠나, 20 분 동안 10 % 겐타 마이신으로 보충. </li><li> 층류 후드에서이 작업을 수행 행크스 &#39;솔루션 다시 여섯 번 씻어 (5 U 보충 / ㎖ 페니실린 및 5 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신). </li><li> H. 준비 polygrus 미디어. </li><li> 11.1 ml의 45 % 글루코오스 (최종 농도 RPMI1640 0.2 % 글루코스를 포함 1.2 %), 100 × Peniclllin - 스트렙토 마이신 (최종 농도 5 U / ㎖ 페니실린 5 ㎖를 넣고 500 RPMI1640 ml의, 층류 후드에서 무균 유지 5 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신), L 글루타민 5 ㎖ (2 mM의 최종 농도) 및겐타 마이신 5 ㎖ (최종 농도 1 %). FCS를 추가하지 마십시오. </li><li> 배출 T25 플라스크로 나누어지는 웜, 약. 15 ML의 H. 1,000 벌레 polygyrus 플라스크 당 미디어, 37 ° C 배양기 (5 % CO 2) 삼주에 대한 정직한 곳. </li></ol> HES 5. 준비 <ol><li> 문화의 24 시간 후 첫 컬렉션을 따로 설정, 두 번 일주일 이상 더 이상 간격으로 문화 문화 매체를 HES가 함유 수집 (때문에 LPS 오염 및 호스트 단백질의 높은 수준 - 개별적으로 처리하거나, 삭제할 수 있습니다). 별도의 명확 날짜 및 배치 번호가 표시 각각의 컬렉션을 유지합니다. H. 같은 부피로 교체 각 행사에 polygyrus 미디어. </li><li> 원심 5 분 동안 400 x g에서 미디어 HES가 함유. 이어서 50 ㎖ 튜브에 0.2 ㎛의 저 단백질 - 결합 필터를 통해 살균 필터. -20 ° C 냉장고에 보관 명확하게 HES (c)의 웜 수확의 날짜와 날짜 표시ollection. </li><li> 문화 HES 컬렉션 21 일 후, 벌레를 폐기합니다. </li><li> (보통 냉동 콘텐츠로부터, 상기 제 24 시간 컬렉션을 포함하지 않음), 및 질소 가압하에 한외 여과 장치에서의 필터 3000 MWCO를 통해 농축 HES 상청 500-1000 ml의 풀. 참고 : 필터 실행 건조 들어 가지 않도록주의해야합니다. <ol><li> 필터 장치를 설정 첫째 교반하면서 3 × 20 ​​분 동안 증류수 1 리터 비이커에 아래 3 kDa의 막 반짝이는면을 세척합니다. 필터 멤브레인 광택면을 위로하여 제조업체의 지침에 따라 한외 여과 장치를 조립합니다. 4 ° C에서 캐비닛의 장소 및 풀링 HES을 집중하기 시작하기 전에를 통해 증류수 50 ㎖를 전달합니다. </li><li> 볼륨이 2-5 ml의 농축 될 때까지 (하루에 100-140 ml)을 필요에 따라 여과 장치에 HES의 각 튜브를 추가합니다. </li></ol></li><li> 피라 50 ㎖를, HES - 함유 배지에서 오염물을 제거하기 위해서 추가PBS 및 여과 장치 및 ogen없는 한 다음 약 2 ㎖의 아래로 농축시킨다. 두 번이 단계 (총 PBS 150 ㎖)를 반복합니다. 층류 후드에서 15ml의 튜브 (0.2 μm의 필터) 필터 소독 HES로 옮기고, 분광 광도계 (10 E = 280) 또는 브래드 포드 분석법을 이용하여 단백질 농도를 측정한다. </li><li> 나누어지는, -80 ° C에서 배치 번호와 날짜, 동결 레이블. </li><li> 사용하기 전에 HES의 각 배치의 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 LAL 분석을 수행합니다. LPS 레벨은 1 μg의 단백질 당 1 U LPS보다 많은 경우, 생체 내 또는 시험 관내 실험 배양이 배치를 사용하는 것을 고려하지. </li><li> 별도로 동일하게 24 시간에 수집을 HES 방법; 적합하지 기능적 실험 그것이 모노클로 날 항체의 친 화성 정제에 의해 단리 될 수있다 개별 분자의 유용한 소스가있는 동안은, LPS 및 일부 숙주 단백질을 포함 할 것이다. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

H.의 수명주기 안정적으로 일관된 방식으로 polygyrus 진행됩니다. 자연 섭취 또는 0 일에 L3 유충의 구강 투여 후, 낭종이 10 일에서 장 루멘으로 어른 벌레로 부상 한 후 유충의 moults로 진행하고, 5 일에 의해 십이지장 장막에서 형성되기 시작, 계란에서 대변에서 볼 수 있습니다 14 일 및 육아종 일 (21) 전술 (그림 6에 요약) 프로토콜에서 십이지장 장막 표면에 볼 수 있습니다 H.의 높은 처리량 생산 가능 미래의 실험 및 라이프 사이클 감염 가능한 L3 유충의 안정적인 복구에 추가 polygyrus의 배설-분비 제품 (HES). H.의 polygyrus 감염은 OVA 나 데르 P 1 (집 먼지 진드기 알레르기 항원) (14)에 따라 천식 모델에서 보호 될 것으로 나타났다. 또,기도 염증의 억제는 CD4 + CD25 +로 전송 될 수있다 </sup&gt; T 조절 세포는 14 또는 CD19 + CD23 하이 규제 B 세포로부터 24 H. 비 감응 polygyrus 쥐를 -infected. 자가 면역, H. 모델에서 polygyrus 감염은 다발성 경화증 (9)의 실험적인자가 면역성 뇌척수염 (EAE) 모델의 억제로 도시되었으며, 진압 감염된 마우스 (24)로부터 CD4 + T 세포 또는 CD19 + B 세포 중 하나와 함께 전송 될 수있다. 자극 (25) 수상 세포 반응성) 억제 CD4의 b) 유도 : Heligmosomoides polygyrus 배설-분비 제품 (HES)를 포함하여, 숙주 면역 반응을 조절하고 (도 7에서 설명하는) 다수의 메커니즘에 의해은 Th2 매개 염증 억제 + + Foxp3를 조절 T 세포 18. 및 c) IL-33의 생산 (20)의 봉쇄. 를 관리 할 때 HES가 보호 될 것으로 나타났다t 과민성 또는 도전 천식 (19)의 OVA-명반 모델 및 조기 IL-33 릴리스의 억제를 통해, 알터 추출물 알레르기 (20)와 비강 내 투여시. HES의 LPS 오염의 회피는 종종 미래의 면역 학적 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 여기에 설명 된 프로토콜,이 달성의 중요한 단계는 (2.10 참조)과 문화의 첫 24 시간을 제외 ES 솔루션을 설정하는 최종 HES 준비를 입력하지 않는 Baermann 장치의 모슬린 가방에 포함 된 그 파편을 보장하는 (5.1 참조). 최근 몇 년 동안, HES는 철저하게 26, 27 확인 된 370 별개의 단백질과 단백체 수준에서 특징으로하고있다. 또한, 제 4 단째는 유충 ES 프로테옴 분석 (28)에 실시되었다. 3의 계속 강하게 면역 원성 공지 HES의 주요 글리 칸 성분을 특성화 포함하고, 마이크로 RN 분비그는 50 ~ 100 nm의 소포 또는 엑소 좀 (벅 등., 게시를 위해 제출)에 캡슐화되어있다. 이 높은 면역 기생충에서, 그리고 HES의 분자 구성 요소를 식별하는 광범위한 단백체 데이터와 ES의 수집에 대한 재현성 프로토콜의 설립으로, 무대는 이제 식별 및 H.에서 개별 분자의 치료 테스트 설정 호스트 면역 체계에 중요한 영향을 중재 할 수 polygyrus.

Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간 선충 기생충 일에 관련되어 자연 쥐의 위장 기생충이다. 이러한 Nippostrongylus의 brasiliensis, H. 다른 선충 모델과는 대조적으로 polygyrus 일관는 숙주 면역 반응을 억제하는이 채용 여러 강력한 면역 조절 메커니즘의 직접적인 결과로 생쥐의 만성 감염을 확립한다. H.의 polygyrus은 직접 수명주기를 가지고 : 감염 L3 유충이 FECO 구강 전송 섭취 (또는 실험실 설정에서 구강 투여에 의해 관리), 그들은 같이 장 루멘으로 돌아 가기 전에 십이지장과 encyst의 장막 층으로 이주 그러자 약 팔일 초기 감염 후 성인 웜. 상대와 계란 생산은 10 일에 의해 발생하며 다에서 배설-분비 제품의 문화와 수집을위한 성인 벌레를 수확 할 수있다Y (14) 이후 3. H. polygyrus 또한 감염된 감염 마우스 4-6, 및 H.의 증가 수준에서 증가 유산균으로, 공생 미생물에 존재하는 상호 작용 유산균 6 마우스의 노출 다음 polygyrus 감염. H.와 활성 감염 polygyrus가 7-10 많은자가 면역 동물 모델에서 면역 병리에 대하여 보호하는 것으로 나타났다, 11, 12 및 알레르기 성 대장염 13-16. 결과적으로이 기생충의 아웃풋 - 분비 분자의 가능성에 큰 관심이있다 ( &quot;HES&quot;)는 생체 (17, 18)에서 병리학을 다운 조절합니다. 사실, 보호 효과는 이제 18, 20 확인되는 경로를 통해 HES 제품 (19)와 쥐의 치료 다음 볼 수 있습니다. 여기에서 우리는 그것의 분비 제품의 신뢰성 Heligmosomoides의 polygyrus의 생산 및 복구를 위해 프로토콜을 설명즉 추가의 생화학 적, 면역 기능의 조사 범위에 대해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides의 polygyrus (이전 Nematospiroides의 dubius로 알려져 있으며, 또한 H. bakeri 일부에 의해 참조) 밀접하게 쥐에 만성 감염을 설정하는 여러 면역 메커니즘을 고용하고 위장 기생충이 널리 인간의 기생충 감염과 유사하다. H. polygyrus는 기생충 유래 면역 조절 분야에서 광범위하게 연구되었고, 강력하게 (활성 감염 및 격리 분비 제품 모두) 알레르기와자가 면역의 실험 모델을 억제하는 것으로 확인되었습니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜은 H. 관리를 설명 자신의 배설-분비 제품 (HES)의 일관된 L3 유충의 생산, 성인 기생충의 복구 및 수집을위한 polygyrus 수명주기.

H. 감염에 대한 감수성 polygyrus는 마우스 균주 (표 1)의 유전 적 배경에 의해 고도로 제어되고; C57BL / 6 CBA 마우스는 21, 22, 매우 민감하다. 기생충의 라이프 사이클의 유지 관리를 위해,이 두 균주 사이의 F1 잡종 어느 모 균주에 비해 이환율 (과도한 장내 상피 손상)없이 훨씬 높은 웜 부담을 견딜 수있는 능력에 대해 선택되었다. 400 L3 유충의 구강 투여는 일반적으로 동형 접합 근친 균주의 실험 (예를 들어, C57BL / 6에 사용되는 200 L3 유충의 복용량 동안, (그림 2 성인 웜 부담의 결과로) F1 생쥐의 수명을 유지하는 데 사용됩니다 또는 BALBc). 그러나,이 용량은 장내 식물의 변화와 같은 동물 시설 사이에 다를 수 있습니다 환경 공동 요인에 따라 감소 될 필요가있다. HES의 일괄 재현 effi을 입증기능 분석에서 단백질 조성물 cacy; 배양의 각 연속 주에서 상등액 4 주 총까지 분석 한 결과 또한, 단백질 프로파일 (도 3) HES 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정 될 때. (5.5 참조) 매우 유사한 것으로 밝혀졌다, 총 단백질은 일반적으로 약 1 밀리그램 / ㎖ (그림 4)입니다. HES를 집중하는 다른 방법은 샘플 버퍼 염, 저 분자량 성분을 제거, 스윙 아웃 로터 원심 최대 4,000g에서 회전하는 원심 농축기 (예 VIVASPIN 3 kDa의 컷 - 오프 멤브레인)로된다. 원심 농도가 가장 작은 처리 볼륨 (1 ~ 10 ㎖)에 적합하고, 약 30 배의 최대 집중 계수로 제한됩니다. HES를 수집 할 때, 오염의 방지가 중요하다. 호스트 분자와 오염을 방지하기 위해, 우리는 HES-계속을 폐기마우스 소장에서 성인 웜 수확 후 첫 24 시간에서 문화 매체를 aining. 또한 발색성 LAL 분석 (5.7 참조​​) HES의 각 배치에 오염 LPS 레벨을 정량화. LPS의 1 U는 ~ 100 페이지 LPS 총점이 아래 수준은 23 무시할 간주됩니다. 우리의 손에, HES 대부분의 배치는이 한도가 크게, 0.23 U / μg의 인 HES의 LPS의 평균 농도 (그림 5)입니다. 병리학의 생체 내 모델에서 LPS의 효과는 (예를 들어 천식 반응의 억제) LPS (23)의 적어도 10 NG가 필요합니다. 따라서 100 페이지 LPS / μg의 HES와 배치에서 5 μg의 HES의 생체 관리 500 페이지의 LPS, 잘 아래 LPS가 문제가된다 유효 농도를 포함 할 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> 그림 1 : Baermann 장치 배어성인 H.의 수집을위한 MANN기구 설치 polygyrus (2 절에서 설명). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> 그림 2 : 14 일 400 L3 유충 평균 웜에 감염 후 평균 웜 부담은 14 일 400 L3 유충 감염 후 부담. 표시된 데이터 포인트는 C57BL / 6xCBA 마우스의 감염의 19 별도 라운드에서 있습니다. ± SEM이 표시 의미. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 문화의 주 연속 수집 HES 단백질의 문화 SDS-PAGE 프로필에 주 연속에서 HES의 단백질 프로파일. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> 그림 4 : </strong&gt; 500㎖의 ES-포함하는 배양 상층 액의 약 500 ml의에서 파생 된 11 가지 배치에서 HES 단백질의 미디어 수율에서 HES의 최종 수량. ± SEM이 표시 의미. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> 그림 5 : 리 물러의 ameobocyte 분석에 의해 측정 HES의 41 일괄 LPS 오염의 HES 수준의 LPS 오염. 중간 LPS 농도 = HES의 86 U 당 MG. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> 그림 6 : H. 애니메이션 회로도 HES의 분리에 애벌레와 어른 벌레의 회복을 통해 L3 유충의 구강 투여에서 키 수명주기 단계의 polygyrus 수명주기 개요. 그림 7 : HES와 그 기능 HES에 포함 된 수용성 매개체와 엑소 좀의 주요 면역 효과를 애니메이션 회로도. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 유전자형 (및 배경 균주) </td><td> 차 감염 표현형 </td><td> 참고 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 근친 균주 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> 매우 취약 </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6와 C57BL / 10 </td><td> 감수성 </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / C, DBA / 2, 129 / J </td><td> 중간의 </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </TD&gt; <td> 낮은 감수성 </td><td> (22), (32) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 사이토 카인 또는 사이토 카인 수용체 형질 </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> 더 취약 </td><td> (33) </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> 덜 영향 (a); 더 감수성의 변화 없지만 증가 육아종 (B) </td><td> (33) </td></tr><tr><td> (b) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ 유전자 변형 (C57BL / 6) </td><td> 저항하는 </td><td> (35) </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> 높은 생산력 </td><td> (36) </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 또는 BALB / c) </td><td> 매우 취약 </td><td> (22) </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c 또는 C57BL / 6) </td><td> 고도의 내성 </td><td> (37) </td></tr><tr><td> IL-9 형질 전환(FVB) </td><td> 저항하는 </td><td> (38) </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> 결핍은 Th2, 육아종 gormation 감소 </td><td> (39, 40) </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> 더 취약 </td><td> (33) </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> 감수성 변화 없음 </td><td> (33) </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> 높은 TH1, 감수성을 증가 </td><td> 41, 42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> T 세포 형질 전환 용 마커 </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> 변두리에 더 높은 생산력 </td><td> (43) </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> 높은 생산력 </td><td> (44) </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> 높은 생산력 및# 160; </td><td> (45) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 선천성 면역 궤적을위한 형질 전환 </td><td></td></tr><tr><td> 타입 1 인터페론 수용체 (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> 높은 생산력, 더 육아종 </td><td> (34) </td></tr><tr><td> 에서 MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> 더 많은 저항, 더 육아종 </td><td> (34) </td></tr><tr><td> C-KitW / 웨스트 버지니아 (WBB6) </td><td> 더 취약 </td><td> (46, 47) </td></tr></tbody></table> 표 1 : H.와 차 감염 유 전적으로 다른과 유전자 타겟으로 마우스 균주에 polygyrus.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간의 기생충 감염의 것과 유사 강력한 면역 조절 기능이있는 쥐의 선충이다. 여기에서는 H.의 장기적인 유지 관리 프로토콜을 기술 polygyrus 라이프 사이클.

재배<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus :</em&gt; 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.2K 조회수.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간의 기생충 감염의 것과 유사 강력한 면역 조절 기능이있는 쥐의 선충이다. 여기에서는 H.의 장기적인 유지 관리 프로토콜을 기술 polygyrus 라이프 사이클. 

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Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

체액 성 면역의 해결 핵심 선수: 고급 및 Murine 파이어의 패치에서 림프 구 격리 프로토콜 최적화

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

연구

암 연구학

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

면역학 및 감염병학

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in high demand. With a close genetic and behavioral resemblance to humans, small animals such as the mouse are good candidates for human disease models, through which human-like symptoms and responses can be recapitulated. Further, the mouse genetic background can be altered to accommodate diverse demands. The NOD/SCID/IL2r&#947;null (NSG) mouse is one of the most widely used immunocompromised mouse strains; it allows engraftment with human hematopoietic stem cells and/or human tissues and the subsequent development of a functional human immune system. This is a critical milestone in understanding the prognosis and pathophysiology of human-specific diseases such as HIV/AIDS and aiding the search for a cure. Herein, we report a detailed protocol for generating a humanized NSG mouse model (hu-NSG) by hematopoietic stem cell transplantation into a radiation-conditioned neonatal NSG mouse. The hu-NSG mouse model shows multi-lineage development of transplanted human stem cells and susceptibility to HIV-1 viral infection. It also recapitulates key biological characteristics in response to combinatorial antiretroviral therapy (cART).

This protocol provides a method to establish humanized mice (hu-NSG) via intrahepatic injection of human hematopoietic stem cells into radiation-conditioned neonatal NSG mice. The hu-NSG mouse is susceptible to HIV infection and combinatorial antiretroviral therapy (cART) and serves as a suitable pathophysiological model for HIV replication and latency investigations.

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

공동-agonism 인간 CD8 + T 세포 활성화에 조사를 단일 체인 MHC 기술의 사용

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

갤러리아 mellonella 구강 관리 모델 Study Commensal-Induced 타고 난 면역 반응에

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

내장 호밍 규제 T 세포 유도의 생체 내 확대

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Nippostrongylus brasiliensis 감염 모델에서 IL-9 생성 림프 세포 연구를 위한 전략

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

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