Name: cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

NOT: Bu protokol tüm işlemler Birleşik Krallık Home Office ve Edinburgh Veteriner Hizmetleri Üniversitesi tarafından belirlenen esaslara uygun olarak yapılır. Gavaj yoluyla 1. Farelerin enfeksiyonu <ol><li> Altı aya kadar 4 ° C için damıtılmış su içinde mağazası Heligmosomoides polygyrus L3 larva. </li><li> Kullanmadan önce, damıtılmış su içinde L3 larva üç kez yıkayın: santrifüj (fren) 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de, tüm su ancak 500 ul çıkarın (rahatsız edici pelet L3 larva önlemek için) ve pelet, her zaman yeniden süspanse edin. </li><li> Üçüncü yıkama için, kendi deliği genişletmek için 200 ul ucu kesilmiş tam bir hacimde (tipik olarak 40 mi) ve aspirasyon 20 ul su ilave edilir. (Mobil, ve en iyi bir mikroskop ile 50X büyütme altında inceledi genellikle) 60 mm kültür çanak yüzeyinde iki 20 ul örnekleri yerleştirin ve L3 larva sayısı. Bir concentratio için damıtılmış su içinde nihai pelet yeniden süspanseml başına 2,000 L3 larvaları n. </li><li> Yaşam döngüsü üretimi için, 400 H. 8 haftalık F1 (C57BL / 6xCBA) fareleri enfekte oral gavaj yoluyla damıtılmış su, 200 ul polygyrus L3 larvalarına (Boynun ense göre dik olarak fareler sınırlayacağı ve yavaşça mideye ağızdan ve yemek borusundan küt gavaj iğnesi). Çalkalayın, her enfeksiyon (larvalar suda hızlı yerleşmek) ve aspirat 1 ml şırınga 200 ul önce iyice; yuvarlak uçlu özel bir sonda iğne kullanın. Genç farelerde deneysel enfeksiyon (6-8 hafta) veya diğer doğal suşları (örneğin, C57BL / 6 veya Balbc) için, 200 L3 larva ile enfekte fareler. </li></ol> 2. Yayılım ve H. Bakım polygyrus <ol><li> Büyük bir plastik küvet merkezinde kömür yerleştirin ve soğuk musluk suyu 30 dakika en az üzerinde çalışmasına izin (yıkanmamış aktif kömür L3 larvalarına karşı toksiktir). Küvet suyu boşaltın ve t kömür yerleştirinTamamen kuruyana kadar oda havaya maruz kalacak şekilde, emici kağıt tabakaları, wo. </li><li> Yumurta gerekiyorsa (gerekirse ve makas), ilk forseps ile kolonun dışına dışkı kazımak. L3 larva sayıda gerekli ise, bir tel ızgara üzerinde fareler yerleştirin ve bir kaç gün içinde fekal pelet toplar. </li><li> Sadece kağıt filtre yapışmak için yeterince nemli bir kıvam elde etmek için, 1: en az bir 1 oranında granüle edilmiş mangal kömürü ile dışkı karıştırın. Bir petri bazı nemli filtre kağıdının ortasına ince bir tabaka smear ve nemli kutuda bu koyun 12-14 gün süreyle karanlıkta (bazı nemli kağıt havlu ve su bir tabak eklemek). </li><li> Itibaren günde 7 den L3 larvaları çıkarın ve kağıt atılır önce en az iki vesilelerle onları toplamak. Larvalar filtre kağıdı kenarı etrafında bir halka oluştururlar; petri üzerinden filtre kağıdı kaldırarak ve 50 ml&#39;lik bir tüp içine (bir pipet ve plaka başına steril su 5 ml kullanılarak) levhanın kalan larva yıkayın. </li><li> Asansörve filtre kağıdı kapalı kalan larvalar 50 ml tüp içine damıtılmış su ile tabağın sol hasat. 10 dakika için 300 xg&#39;de atık çözüm santrifüjleyin. Damıtılmış su ile larva üç kez yıkayın ve gerekli olana değin daha sonra damıtılmış su içinde 50 ml 4 ° C&#39;de saklayın. NOT: Larva canlı kalır ve en az 6 ay süreyle enfektif. </li></ol> Yetişkin H. 3. Koleksiyonu polygyrus Worms <ol><li> Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi önceden değiştirilmiş Baermann Aparatı hazırlayın. </li><li> On dört gün sonra enfeksiyon itlaf fareler. </li><li> % 70 etanol ile karın yıkayın. Karın üzerindeki deriyi kesin ve karın ön duvarı ortaya çıkarmak için geri çekin. Periton boşluğuna girmek için orta hat kesi olun. </li><li> (Distal rektum proksimal duodenum itibaren) tüm küçük ve büyük bağırsak çıkarın. Kuru Petri kabı içine yerleştirin. </li><li> Onun bütün uzunluğu boyunca gut Düzelt; dışkı içeren kolon tüketim; Daha sonra yumurta hazırlıkları için ayrı bir çanak içine bu yerleştirin. </li><li> Nedeniyle içi lümen solucanlar duodenum ve genellikle kırmızı görünüm nispeten kalın bir duvar ile -identified erişkin solucanlar içeren ince bağırsağın proksimal 20 cm eksize edin. Hanks çözeltisi, 5 ml ile (100 mm&#39;lik çap) Petri kabı içine yerleştirin, 37 ° C (tabak başına iki örnek) ısıtıldı. </li><li> Makas (yuvarlak uçlu makas bunun için en iyi) ile uzunlamasına solucan dolu proksimal bağırsak bölümünü açın ve solucanları kaldırmak için iki cam slaytlar ile astar bağırsak içinde aşağı kazımak. Sonra temiz bağırsak duvarını atın. </li><li> Küçük müsli çanta içine ucu solucanlar, zımba kapalı ve cam huni (Şekil 1) kenarında Ataç ile sabitleyin. </li><li> Hanks &#39;Çözüm ile huni doldurun ve her huni içine solucanlar yaklaşık 4 Petri kapları ekleyin. </li><li> 1-2 saat boyunca 37 ° C inkübatör içinde bir yer cihaz, hafifçe yarı yoldan ajite çıkarmak içinmuslin filtresi occlude bağırsak hazırlık enkaz. Muslin çanta dışında enkaz dökülmesini önlemek için özen - bu son HES hazırlık kontaminasyona neden olur. Yetişkin solucanlar yavaş yavaş muslin kumaş ile göç ve cam test tüpünün dibinde yerleşmiş olmalıdır. Dikkatle (bu noktada solucanlar kaybetmemek için dikkat) lavabonun üzerinde bağlantı kauçuk hortum test tüpü ayırın. </li><li> Bir plastik pipet kullanarak, bir 50 ml tüp içine solucanlar aktarmak ve yıkama altı kez Hanks ile &#39;Çözüm (solucanlar bir stripette ile medya, yerçekimi ile yerleşmek kaldırmak için izin eklemek Hanks 40 ml&#39; Çözüm ve beş kez tekrarlayın). Not: solucan kültürü Bu noktadan itibaren, steril tutulmalıdır. <ol><li> Bir laminar akış çeker taşı ve 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin, in vitro kültür için hazır ile takviye edilmiş steril Hanks çözeltisi içinde altı defa yıkanır. </li></ol></li><li> Saymakonun açıklığı genişletmek için sarı ucu kesilmiş alınmış 20 ul iki numune alarak kurtarıldı erişkin solucanlar; aşılanmış larva miktarı yaklaşık% 50 bekliyoruz. </li></ol> Orta Hazırlanması, Yetişkin Worms Yıkama: 4. HES için Kültürleri Kurma <ol><li> RPMI yaklaşık 10 ml 3.11 solucanlar emmek solucanlar tamamen kapalı sağlamak için bir açıyla boru dinlenme bırakarak, 20 dakika boyunca% 10 Gentamisin ile takviye edilmiştir. </li><li> Bir laminar akış başlığı içinde bu yapın: Hanks çözeltisi ile altı kez yıkama (5 U ile takviye / ml penisilin ve 5 ug / ml streptomisin). </li><li> H. hazırlayın polygrus ortam. </li><li> , 11.1 mi,% 45 glükoz (nihai konsantrasyon RPMI-1640,% 0.2 glukoz içeren 1.2%), 100 x Peniclllin-Streptomisin (nihai konsantrasyon, 5 U / ml penisilin, 5 ml ilave edin, 500 RPMI1640 ml, bir laminar akış başlığı içinde steriliteyi korumaya 5 ug / ml streptomisin), L-glutamin, 5 ml (nihai konsantrasyon 2 nM), veGentamisin 5 ml (nihai konsantrasyon% 1). FCS katmayın. </li><li> Bacalı T25 şişeler içine kısım solucanlar, yakl. 15 mi H. 1000 solucanlar polygyrus şişe başına ortam, ve 37 ° C inkübatör (% 5 CO2) 3 hafta boyunca dik bir yer. </li></ol> HES 5. hazırlanması <ol><li> Kültür 24 saat sonra ilk koleksiyonunu bir kenara bırakarak, haftada iki kez daha daha uzun aralıklarla kültürlerinden kültür ortamı HES içeren toplayın (LPS nedeniyle kirlenme ve ev sahibi proteinlerin yüksek düzeyde - ayrı ayrı işlenir veya atılabilir). Ayrı ve açıkça tarih ve seri numarası ile etiketlenmiş her koleksiyonu tutun. H. eşit hacimde yerine Her vesileyle polygyrus medya. </li><li> Santrifüj 5 dakika boyunca 400 x g &#39;daki ortamı HES-ihtiva etmektedir. Daha sonra 50 ml tüpler içinde 0.2 mikron düşük-protein bağlayıcı filtre ile sterilize filtre edin. -20 ° C derin dondurucuda saklayın açıkça HES c solucan hasat tarihi ve tarih ile etiketlenmişollection. </li><li> Kültürden HES toplama 21 gün sonra, solucanlar atın. </li><li> (Genellikle dondurulmuş stoktan ve ilk 24 saat toplama dahil olmak üzere) ve azot basıncı altında, ultrafiltrasyon cihazında 3000 MWCO filtre üzerinde konsantre HES yüzer Havuz 500-1000 mi. NOT: Filtre çalışma kuruması için çok dikkatli olun. <ol><li> Filtre cihazı kurmak ilk karıştırma iken 3 x 20 dakika boyunca distile su ile 1 litrelik beher aşağı 3 kDa membran parlak tarafı yıkamak için. Filtre membran parlak tarafı yukarı üreticinin talimatlarına göre ultrafiltrasyon cihazı monte edin. 4 ° C &#39;de kabin içinde yeri ve bir araya toplanmış HES konsantre başlamadan önce damıtılmış su, 50 ml geçmektedir. </li><li> Hacmi 2-5 ml&#39;ye kadar konsantre edildi kadar (gün başına 100-140 mL) gerektiği gibi süzme cihazına HES her tüp ekleyin. </li></ol></li><li> PYR 50 ml HES-ihtiva eden kültür ortamından kirleri çıkarmak eklemek içinve PBS filtrasyon cihazına ve ogen-özgür sonra yaklaşık 2 ml kadar konsantre. İki kez bu adımı (toplam PBS 150 mi) tekrar edin. Bir laminar akış başlığı içinde bir 15 ml tüp (0.2 um filtre ile) filtre ile steril olarak HES aktarın ve bir spektrofotometre (= 10 e 280) ya da Bradford tahlili ile kullanılarak protein konsantrasyonları ölçülür. </li><li> Kısım, -80 ° C&#39;de parti numarası ve tarih, ve dondurma ile etiket. </li><li> Kullanımdan önce HES her parti üzerine, üreticinin protokollerine uygun olarak, bir kromojenik olan LAL değerlendirmesinin kullanılması yapın. LPS seviyelerinin 1 ug protein başına 1 u, LPS daha büyük ise, in vivo deneyler için ya da in vitro kültürlerde bu serisi ile düşünün. </li><li> Ayrı ayrı, aynı şekilde 24 saat sonra toplanan HES Proses; uygun olmayan fonksiyonel deneyler için, bu monoklonal antikor, afinite temizliği yolu ile izole edilebilir tek tek moleküllerin bir yararlı bir kaynak olduğunu da bunun, LPS ve bir ev sahibi proteinleri ihtiva edecektir. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

H. yaşam döngüsü güvenilir bir şekilde tutarlı bir şekilde polygyrus ilerler. Doğal sindirim ya da günde 0 L3 larva oral gavaj sonra, kist 10. günden bağırsak lümenine solucanların ortaya çıkan daha sonra larva moults kadar ilerleyen ve 5. günde, duodenal zarı altına oluşmaya başlar, yumurta dışkıların görülebilir 14. günde ve 21. günde granülomlar, yukarıda tarif edilen (ve Şekil 6&#39;da özetlenmektedir) protokolü duodenumunda serozasında görebilir H., yüksek verimli üretimi için izin verir Gelecekteki deneysel ve yaşam döngüsü enfeksiyonları için canlı L3 larva güvenilir kurtarma ek polygyrus boşaltım-salgı ürünleri (HES),. H. polygyrus enfeksiyonu OVA veya Der p 1 (Ev tozu akarı alerjen) 14 bağlıdır, astım modellerinde koruyucu olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, hava yolu inflamasyonu baskılama CD4 + CD25 + ile transfer edilebilir </sup&gt; düzenleyici T hücreleri 14 veya CD19 + CD23 hi düzenleyici B hücreleri 24, H., sigara duyarlı polygyrus fareler ile enfekte. Otoimmünite, H. modellerinde polygyrus enfeksiyonu multipl skleroz 9 deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modeli baskılayıcı olduğu gösterilmiştir, ve bastırma enfekte olmuş fareler, 24 CD4 + T hücreleri veya CD19 + B hücreleri ya ile aktarılabilir. Stimülasyondan 25 dendritik hücre tepkisinin) inhibisyonu CD4 b) indüksiyonu: Heligmosomoides polygyrus boşaltım salgılama ürünleri (HES), dahil olmak üzere, bağışıklık tepkisini modüle eden ve (Şekil 7 &#39;de tarif edilmektedir) bir dizi mekanizma ile Th2 aracılı inflamasyonun baskılanması + Foxp3 + düzenleyici T hücreleri 18. c) IL-33 üretiminin 20 engellenebilir. Bir tatbik edildiğinde HES koruyucu olduğu gösterilmiştirt hassaslaşması ya da meydan astım 19 OVA-şap modelinde ve ayrıca erken IL-33 salınımının baskılanması yoluyla, Alternaria özü alerjen 20 ile burundan verildiğinde. HES LPS kirlenmesinin önlenmesi genellikle gelecekteki immünolojik deneyler başarısı için çok önemlidir. Burada özetlenen protokolde, bu ulaşmada kritik adımlar (2.10) ve kültürünün ilk 24 saat kenara ES çözümü ayarlamak için nihai HES hazırlık girmiyor Baermann Aparatı müsli çanta içinde bulunan o enkaz sağlamak için vardır (5.1 bakınız). Son yıllarda, HES iyice 26,27 belirlenen 370 üzerinde farklı proteinler ile proteomik düzeyde karakterize edilmiştir. Buna ek olarak, 4 larva ES proteomik analizi 28 tabi tutulmuştur. Yürütülen çalışma 3 güçlü bir immünojenik olduğu bilinen HES ana glıkan bileşenleri karakterize içerir ve mikro-RN salgılananBu 50-100 nm veziküller veya eksozom (Buck ve diğ., Yayımlanmak üzere gönderilen) olarak kapsüllü gibidir. Bu son derece bağışıklık parazitten ve HES moleküler bileşenleri tanımlayan geniş proteomik verileri ile ES toplanması için tekrarlanabilir protokollerin kurulması ile, sahne artık kimlik ve H. bireysel moleküllerin tedavi test için ayarlanır konukçu bağışıklık sistemi üzerinde önemli etkilere aracılık edebilen polygyrus.

Heligmosomoides polygyrus yakın yüksek yaygın insan nematod parazit 1 ile ilişkili olan doğal faregiller mide-bağırsak kurtları olup. Örneğin Nippostrongylus brasiliensis, H. gibi diğer nematod modellerinin tersine polygyrus sürekli o ana bağışıklık yanıtı 2 bastırmak için kullandığı çok güçlü bir bağışıklık mekanizmalarının doğrudan bir sonucu olarak farelerde kronik enfeksiyon oluşturur. H polygyrus doğrudan ömrü vardır: enfeksiyon L3 larva FECO ağız iletimi ile alınan (veya laboratuvar ortamında oral gavaj yoluyla uygulanmıştır) vardır, bunlar bağırsak lümenine geri dönmeden önce duodenum ve kese içine almak ve subserozal katmana göç bunun Yaklaşık sekiz gün ilk enfeksiyondan sonra erişkin solucanlar. Çiftleşme ve yumurta üretimi günde 10 ile gerçekleşir ve dekara gelen boşaltım-salgı ürünlerinin kültür ve toplama için erişkin solucanlar hasat etmek mümkündüry 14 itibaren 3. H. polygyrus da enfekte duyarlı farelerde 4-6, ve H seviyeleri, artmış Laktobasillerin ile ortakçı mikroflora ile, bu etkileşim Lactobacilli 6 farelerin maruz kaldıktan sonra polygyrus enfeksiyonu. H. Aktif enfeksiyonu polygyrus otoimmünite 7-10 birçok hayvan modellerinde immunopatolojilerinde karşı korumak için gösterilmiştir, 11,12 ve alerji 13-16 kolit. Dolayısıyla bu parazitten Boşaltım-Salgı moleküllerin potansiyel büyük ilgi olmuştur (&quot;HES&quot;) in vivo 17,18 patoloji aşağı-modüle. Nitekim, koruyucu etkileri artık 18,20 tespit ediliyor yollar aracılığıyla HES ürünleri 19 ile farelerin tedavisi sonrasında görülür. İşte biz onun salgılanan ürünlerin güvenilir Heligmosomoides polygyrus üretimi ve kurtarma için bir protokol açıklarBu başka fonksiyonel biyokimyasal ve immünolojik araştırmaların bir dizi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (eski Nematospiroides dubius olarak bilinen ve H. bakeri gibi bazı olarak adlandırılır) yakın farelerde kronik enfeksiyona neden birçok bağışıklık düzenleyici mekanizmalar kullandığı ve bir mide-bağırsak helmint yaygın insan helmint enfeksiyonları karışabilirler. H. polygyrus helmint türevli bağışıklık düzenleme alanında yaygın olarak incelenmiş ve potansiyel olarak (aktif enfeksiyon ve izole salgılanan ürünler ile her ikisi de), alerji ve otoimmün deneysel modeller bastırmak için tespit edilmiştir. Bu yazıda anlatılan protokol H. yönetimini özetliyor kendi boşaltım-salgı ürünleri (HES) tutarlı L3 larva üretimi, yetişkin parazitler kurtarma ve toplama için polygyrus yaşam döngüsü.

H. ile enfeksiyona Duyarlılık polygyrus fare türüne (Tablo 1) &#39;deki genetik arka tarafından daha büyük bir dereceye kadar kontrol edilir; C57BL / 6 ve FMA fareler 21,22 derece hassastır. Parazitin yaşam döngüsünün bakımı için, bu iki suşları arasındaki F1 hibrit ya ebeveyn zorlanma göre morbidite (aşırı bağırsak epitel hasar olmadan) çok daha yüksek solucan yükünü dayanma kabiliyeti için seçilmiştir. 400 L3 larva oral gavaj genellikle homozigot kendilenmiş suşları deneyler (örneğin, C57BL / 6 için kullanılan 200 L3 larva bir doz iken, (Şekil 2&#39;de gösterilen, yetişkin kurt yükü ile sonuçlanan) F1 farelerde ömrünü korumak için kullanılır veya Balbc). Ancak, bu dozaj, bağırsak florasında varyasyonları gibi hayvan olanakları arasında farklılık çevresel ko-faktörlere bağlı olarak azaltılabilir gerekebilir. HES Partiler tekrarlanabilir effi kanıtlanmıştırfonksiyonel deneylerde ve protein bileşimi içinde etkinlik gösterir; Kültür her bir ardışık hafta süpernatanlar 4 haftalık toplam kadar, analiz edildiğinde, ayrıca, söz konusu protein profilleri (Şekil 3) Hes konsantrasyonu Bradford tahlili ile ölçüldüğünde. (5.5) çok benzer olduğu tespit edildi, toplam Protein, genellikle yaklaşık olarak 1 mg / ml idi (Şekil 4). HES konsantre alternatif bir yöntem, numunelerin, tampon tuzlar ve düşük molekül ağırlıklı bileşenlerin çıkarılması, dışarı salınan bir rotor santrifüj içinde 4000 g hızında döndürüldü edildiği bir santrifüjlü yoğunlaştırıcı (örneğin, Vivaspin 3 kDa kesme zarı), ile. Santrifüj konsantrasyonu en küçük işlem hacimleri (1-10 mi) için uygun olan ve yaklaşık 30x maksimum konsantrasyon faktörü ile sınırlıdır. HES toplarken, kirlenmesinin önlenmesi önemlidir. Ev sahibi molekülleri ile kirlenmesini önlemek için, biz HES-cont atmakFare bağırsak yetişkin solucan hasattan sonra ilk 24 saat kültür ortamı, geri kalan. Ayrıca, bir Kromojenik LAL deneyi (5.7) ile HES her parti LPS kirlenme seviyesini ölçmek. LPS 1 U ~ 100 pg LPS eşittir ve bu aşağıda seviyeleri 23 önemsiz kabul edilir. Bizim ellerde, HES çoğu toplu bu sınırın altına önemli ölçüde, 0.23 U / mg olarak HES LPS ortalama konsantrasyonu (Şekil 5) vardır. patoloji in vivo modellerde LPS etkileri (örneğin, astım yanıtların baskılanması) LPS 23, en az 10 ng gerektirir. Bu nedenle 100 ug LPS / ug Hes bir partiden 5 ug HES vivo uygulama içinde 500 ug LPS, çok altında LPS bir sorun haline gelir etkili konsantrasyonu içerir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Şekil 1: Baermann Aparatı BaerYetişkin H. toplanması için mann Aparatı kurulum polygyrus (bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi). <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Şekil 2: 14 Gün 400 L3 Larva Ortalama solucanı Enfeksiyon sonra ortalama Worm Yükü 14 gün 400 L3 larvaları ile enfeksiyondan sonra attırır. Gösterilen veri noktaları C57BL / 6xCBA farelerin enfeksiyon 19 ayrı mermi vardır. ± SEM gösterilir idi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Şekil 3: kültürün birbirini hafta toplanan HES proteinlerinin Kültür SDS-PAGE profilinde Ardışık Hafta itibaren HES Protein Profilleri. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Şekil 4: </strong&gt; 500 ml ES-İçeren kültür yüzer yaklaşık 500 ml türetilen 11 farklı partilerden HES proteinin Medya Verim gelen HES Final Miktarı. ± SEM gösterilir idi. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Şekil 5: Limulus ameobocyte deneyi ile ölçülen HES 41 toplu LPS kirlenme HES Düzeylerinin LPS kirlenmesi. Medyan LPS konsantrasyonu = HES 86 U başına mg. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Şekil 6: H. Hareketli şematik HES izolasyonuna larva ve erişkin solucanlar kurtarma yoluyla L3 larva oral sonda, anahtar yaşam döngüsü aşamaları polygyrus Yaşam Döngüsü Özeti. Şekil 7: HES ve İşlevleri HES içinde bulunan çözünebilir aracıların ve eksozom Anahtar bağışıklık etkileri Animasyon şematik. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotip (ve arka plan suşu) </td><td> Birincil Enfeksiyon Fenotip </td><td> Referans </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Doğuştan suşlar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, FMA, C3H </td><td> Son derece duyarlı </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 ve C57BL / 10 </td><td> Duyarlı </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Orta </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Düşük duyarlılık </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Sitokinler veya sitokin reseptörleri için transgenik </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Daha duyarlı </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> İL-1 R - / - </td><td rowspan="2"> Daha az duyarlı (a) &#39;; Hiçbir duyarlılıkta bir değişiklik ancak artan granülomlar (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ transjenik (C57BL / 6) </td><td> Dayanıklı </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4, - / - </td><td> Yüksek doğurganlık </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 ya da Balb / c) </td><td> Son derece duyarlı </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6, - / - (BALB / c ya da C57BL / 6) </td><td> Son derece dayanıklı </td><td> 37 </td></tr><tr><td> , IL-9 Transjenik(FVB) </td><td> Dayanıklı </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Eksik Th2 granülom gormation azalma </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Daha duyarlı </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Duyarlılıkta değişiklik yok </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Yüksek Th1, artan hassasiyet </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> T hücre markörleri için transgenik </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marjinal yüksek doğurganlık </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Yüksek doğurganlık </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Yüksek doğurganlık &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Doğuştan gelen bağışıklık lokusların transgenik </td><td></td></tr><tr><td> Tip 1 interferon reseptörü (IFNAR), - / - (C57BL / 6) </td><td> Yüksek doğurganlık, daha fazla granülomlar </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Daha dayanıklı, daha granülomlar </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Cı-KitW / WV (WBB6) </td><td> Daha duyarlı </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: H. primer enfeksiyonlar genetik olarak farklı ve gen hedeflenen fare soylarında polygyrus.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus yakından yüksek yaygın insan helmint enfeksiyonu benzeyen güçlü bağışıklık yetenekleri ile bir kemirgen nematod olduğunu. Burada H. uzun vadeli bakım için bir protokol tarif polygyrus yaşam döngüsü.

Yetiştirme<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Bir immunsupresif Nematodu Parazit ve Salgılanmış Ürünleri

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.2K Görüntüleme.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus yakından yüksek yaygın insan helmint enfeksiyonu benzeyen güçlü bağışıklık yetenekleri ile bir kemirgen nematod olduğunu. Burada H. uzun vadeli bakım için bir protokol tarif polygyrus yaşam döngüsü. 

Video: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. Infective eggs are given by oral gavage, hatch in the distal small intestine, invade the intestinal epithelial cells (IECs) 
that line the crypts of the cecum and proximal colon and upon maturation the worms release eggs into the environment1. This model is a powerful tool to 
examine factors that control CD4+ T helper (Th) cell activation as well as changes in the intestinal epithelium. The immune response that occurs in 
resistant inbred strains, such as C57BL/6 and BALB/c, is characterized by Th2 polarized cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) and expulsion of worms while Th1-associated 
cytokines (IL-12, IL-18, IFN-&gamma;) promote chronic infections in genetically susceptible AKR/J mice2-6. Th2 cytokines promote physiological changes in 
the intestinal microenvironment including rapid turnover of IECs, goblet cell differentiation, recruitment and changes in epithelial permeability and smooth muscle 
contraction, all of which have been implicated in worm expulsion7-15. Here we detail a protocol for propagating Trichuris muris eggs which can 
be used in subsequent experiments. We also provide a sample experimental harvest with suggestions for post-infection analysis. Overall, this protocol will provide 
researchers with the basic tools to perform a Trichuris muris mouse infection model which can be used to address questions pertaining to Th proclivity in 
the gastrointestinal tract as well as immune effector functions of IECs.

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infection is an intestinal model of Th2 immunity where resistant mice generate a protective Th2 response and susceptible mice generate a pathological Th1 response.

Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the family Enterobacteriaceae. Xenorhabdus bacteria are associated with steinernematids nematodes while Photorhabdus are symbionts of heterorhabditids. Together nematodes and bacteria form a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species in an intimate and specific partnership. Herein, we demonstrate in vivo and in vitro techniques commonly used in the rearing of these nematodes under laboratory conditions. Furthermore, these techniques represent key steps for the successful establishment of EPN cultures and also form the basis for other bioassays that utilize these organisms for research. The production of aposymbiotic (symbiont&#8211;free) nematodes is often critical for an in-depth and multifaceted approach to the study of symbiosis. This protocol does not require the addition of antibiotics and can be accomplished in a short amount of time with standard laboratory equipment. Nematodes produced in this manner are relatively robust, although their survivorship in storage may vary depending on the species used. The techniques detailed in this presentation correspond to those described by various authors and refined by P. Stock&#8217;s Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). These techniques are distinct from the body of techniques that are used in the mass production of these organisms for pest management purposes.

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

The goal of this presentation is to demonstrate in vivo and in vitro techniques for the rearing of entomopathogenic nematodes. In vivo methods consider the rearing of these nematodes with an insect host, whereas the in vitro methods utilize rich agar media.

In vivo ve in vitro Entomopatojenik Nematodlar Yetiştiriciliğinin olarak (Steinernematidae ve Heterohabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

Biyomühendislik

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Biyoloji

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Bağırsak Mikrobiyom Bakterileri İçin Zenginleştirmek için Yabani Caenorhabditis Nematodlarının Seçici Temizliği

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti. S.&#160;stercoralis is a human-parasitic, skin-penetrating nematode that infects approximately 610 million people, while the rat parasite S.&#160;ratti is closely related to S.&#160;stercoralis and is often used as a laboratory model for S.&#160;stercoralis. Both S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti are easily amenable to the generation of transgenics and knockouts through the exogenous nucleic acid delivery technique of intragonadal microinjection, and as such, have emerged as model systems for other parasitic helminths that are not yet amenable to this technique.
Parasitic Strongyloides adults inhabit the small intestine of their host and release progeny into the environment via the feces. Once in the environment, the larvae develop into free-living adults, which live in feces and produce progeny that must find and invade a new host. This environmental generation is unique to the Strongyloides species and similar enough in morphology to the model free-living nematode Caenorhabditis elegans that techniques developed for C. elegans can be adapted for use with these parasitic nematodes, including intragonadal microinjection. Using intragonadal microinjection, a wide variety of transgenes can be introduced into Strongyloides. CRISPR/Cas9 components can also be microinjected to create mutant Strongyloides larvae. Here, the technique of intragonadal microinjection into Strongyloides, including the preparation of free-living adults, the injection procedure, and the selection of transgenic progeny, is described. Images of transgenic Strongyloides larvae created using CRISPR/Cas9 mutagenesis are included. The aim of this paper is to enable other researchers to use microinjection to create transgenic and mutant Strongyloides.

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The functional genomic toolkit for the parasitic nematodes Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti includes transgenesis, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, and RNAi. This protocol will demonstrate how to use intragonadal microinjection to introduce transgenes and CRISPR components into S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti.

Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Entomopatojenik Nematodların Kültürlenmesi ve Genetik Olarak Manipüle Edilmesi

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

NAD(P)H Fluorescence Lifetime Imaging for the Metabolic Analysis of the Murine Intestine and Parasites During Nematode Infection

Parasites generally have a negative effect on the health of their host. They represent a huge health burden, as they globally affect the health of the infested human or animal in the long term and, thus, impact agricultural and socio-economic outcomes. However, parasite-driven immune-regulatory effects have been described, with potential therapeutic relevance for autoimmune diseases. While the metabolism in both the host and parasites contributes to their defense and is the basis for nematode survival in the intestine, it has remained largely understudied due to a lack of adequate technologies. We have developed and applied NAD(P)H fluorescence lifetime imaging to explanted murine intestinal tissue during infection with the natural nematode Heligmosomoides polygyrus to study the metabolic processes in both the host and parasites in a spatially resolved manner. The exploitation of the fluorescence lifetime of the co-enzymes nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), hereafter NAD(P)H, which are preserved across species, depends on their binding status and the binding site on the enzymes catalyzing metabolic processes. Focusing on the most abundantly expressed NAD(P)H-dependent enzymes, the metabolic pathways associated with anaerobic glycolysis, oxidative phosphorylation/aerobic glycolysis, and NOX-based oxidative burst, as a major defense mechanism, were distinguished, and the metabolic crosstalk between the host and parasite during infection was characterized.

NADPH Fluorescence Lifetime Imaging for the Metabolic Analysis of the Murine Intestine and Parasites During Nematode Infection

The present protocol describes the NAD(P)H fluorescence lifetime imaging of an explanted murine intestine infected with the natural parasite Heligmosomoides polygyrus, which allows one to investigate metabolic processes both in host and parasite tissues in a spatially resolved manner.

Parasites generally have a negative effect on the health of their host. They represent a huge health burden, as they globally affect the health of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Laboratuvar Farelerinde Strongyloides ratti Enfeksiyonunun İncelenmesi

Experimental Infection of Mice with the Parasitic Nematode Strongyloides ratti

Strongyloides ratti is a parasitic nematode that naturally infects wild rats. However, most laboratory rat and mouse strains are fully susceptible to infection. Immunocompetent BALB/c and C57BL/6 mice terminate S. ratti infections within a month in the context of a canonical type 2 immune response and&#160;remain semi-resistant to a re-infection. The course of infection can be divided into three phases: (a) the tissue migration phase of the infective third-stage larvae during the first two days; (b) the early intestinal phase, including the molting to the adult parasites and embedding in the mucosa of the intestine in days 3 to 6 post-infection with reproduction starting by day 5 to 6 post-infection; (c) the later intestinal phase ending with the complete clearance of the parasites. Experimental infections of mice with S. ratti enable the precise study of host-parasite interactions throughout the whole life cycle at the different sites of infection, as well as immune evasion strategies employed by the parasite. The protocol presented here describes the maintenance of the parasite in Wistar rats, the infection of laboratory mice, and the detection and quantification of S. ratti parasites in the tissue migrating phase and during the intestinal phase.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Strongyloides ratti Enfeksiyonunda Cinsiyete Bağlı Bağırsak Bağışıklığı ve Bölgeye Özgü Bağışıklık Tepkileri

Strongyloides ratti is a parasitic nematode that causes transient infections in laboratory mice, displaying tissue-migrating and intestinal life stages. Here, we present a protocol for the maintenance of the parasite cycle in rats and experimental infection of mice, including parasite quantification in the head, lung, and intestine.

Farelerin Parazitik Nematod Strongyloides ratti ile Deneysel Enfeksiyonu

Strongyloides ratti is a parasitic nematode that naturally infects wild rats. However, most laboratory rat and mouse strains are fully susceptible to ...

Yetiştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler