The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

NOTA: Tutte le procedure di questo protocollo vengono eseguite in conformità con le linee guida stabilite dal Regno Unito Home Office e l&#39;Università di Edimburgo Servizi Veterinari. 1. L&#39;infezione di topi Gavage <ol><li> Conservare Heligmosomoides polygyrus L3 larve in acqua distillata per fino a sei mesi a 4 ° C. </li><li> Prima dell&#39;uso, lavare L3 larve tre volte in acqua distillata: centrifugare a 300 xg per 10 min (con freno), rimuovere tutti ma 500 ml di acqua (per evitare di disturbare pellettato larve L3) e risospendere il pellet ogni volta. </li><li> Per il terzo lavaggio, aggiungere acqua per un volume esatto (tipicamente 40 ml) e aspirare 20 l con 200 microlitri punta tagliata per allargare la sua apertura. Inserire due campioni 20 microlitri sulla superficie di un piatto di coltura 60 mm e contare il larve L3 (generalmente mobili, e meglio visto sotto ingrandimento 50X con un microscopio da dissezione). Risospendere il precipitato finale in acqua distillata ad una concentration 2.000 L3 larve per ml. </li><li> Per la produzione del ciclo di vita, infettare da 8 settimane di età F1 (C57BL / 6xCBA) topi con 400 H. polygyrus L3 larve in 200 ml di acqua distillata da sonda gastrica (frenare topi in posizione verticale per la collottola e passare delicatamente l&#39;ago sonda gastrica smussato attraverso la bocca e l&#39;esofago nello stomaco). Agitare accuratamente prima di ogni infezione (larve stabilirsi rapidamente in acqua) e aspirare 200 microlitri in una siringa da 1 ml; utilizzare un ago sonda gastrica dedicato con un&#39;estremità arrotondata. Per infezione sperimentale di topi più giovani (6-8 settimane), o di altri ceppi inbred (ad esempio C57BL / 6 o BALBc), infettare topi con 200 L3 larve. </li></ol> 2. Propagazione e manutenzione di H. polygyrus <ol><li> Inserire carbone nel centro di una grande vasca di plastica e lasciare acqua di rubinetto fredda per eseguire su di esso per un minimo di 30 min (non lavati carbone attivo è tossico per le larve L3). Scaricare l&#39;acqua dalla vasca e posizionare il carboncino su two strati di carta assorbente, lasciando esposta all&#39;aria stanza fino a completa asciugatura. </li><li> Se le uova contenute, raschiare feci prima fuori del colon con una pinza e forbici (se necessario). Se è necessario un gran numero di larve L3, posizionare topi su una griglia metallica e raccogliere pellet fecali per diversi giorni. </li><li> Mescolare le feci con carbone granulato con un rapporto di almeno 1: 1, per ottenere una consistenza appena sufficiente per smorzare aderire filtrare carta. Spalmare uno strato sottile sul centro di una carta da filtro inumidita in una capsula di Petri e collocarlo in una scatola umida (aggiungere qualche tovagliolo di carta umido e un piatto di acqua) al buio per 12-14 giorni. </li><li> Rimuovere L3 larve dal giorno 7 in poi, e raccoglierli in almeno due occasioni, prima che la carta viene scartata. Le larve formano un anello attorno al bordo della carta da filtro; sollevare la carta da filtro dalla capsula di Petri e sciacquare le larve che restano della piastra (utilizzando una pipetta e 5 ml di acqua sterile per piastra) in un tubo da 50 ml. </li><li> Ascensorela carta filtro e raccogliere le larve rimanente lasciato sul piatto con acqua distillata in un tubo da 50 ml. Centrifugare la soluzione effluente a 300 xg per 10 min. Lavare le larve tre volte con acqua distillata e quindi memorizzare a 4 ° C fino a 50 ml di acqua distillata fino all&#39;utilizzo. NOTA: Le larve rimangono vitali e infettiva per almeno 6 mesi. </li></ol> 3. Raccolta di adulti H. polygyrus Worms <ol><li> Preparare la Apparato Baermann modificata anticipo, come mostrato in Figura 1. </li><li> Topi Cull quattordici giorni dopo l&#39;infezione. </li><li> Lavare l&#39;addome con il 70% di etanolo. Tagliare la pelle sopra l&#39;addome e tirare indietro per rivelare la parete addominale anteriore. Fare incisione mediana di entrare nella cavità peritoneale. </li><li> Rimuovere l&#39;intero intestino tenue e crasso (dal duodeno prossimale a distale del retto). Mettere in una capsula di Petri a secco. </li><li> Raddrizzare l&#39;intestino tutta la sua lunghezza; asportare il colon feci contenenti; collocare questo in un piatto a parte per i preparati a base di uova successive. </li><li> Accise L&#39;prossimali 20 cm di intestino tenue che contiene i vermi adulti -identified dal relativamente spessa parete del duodeno e spesso un aspetto rosso a causa dei vermi intra-luminali. Mettere in un (diametro 100 mm) piastra di Petri con 5 ml di soluzione di Hanks &#39;, riscaldato a 37 ° C (due esemplari per piatto). </li><li> Aprire la porzione prossimale dell&#39;intestino verme pieno longitudinalmente con le forbici (forbici rotonde-ended sono i migliori per questo), e raschiare giù all&#39;interno del rivestimento intestinale con due lastre di vetro per rimuovere il worm. Poi scarta parete intestinale pulito. </li><li> Worm punta in piccoli sacchetti di mussola, fiocco chiuso e sicuro con graffette intorno al bordo del imbuto di vetro (Figura 1). </li><li> Riempire imbuto con Solution Hanks &#39;e aggiungere circa 4 piastre di Petri di vermi in ciascun cilindro. </li><li> Collocare il dispositivo in 37 ° C incubatore per 1-2 ore, agitando delicatamente metà a sloggiaredetriti dalla preparazione dell&#39;intestino che può occludere il filtro di mussola. Fare attenzione ad evitare la fuoriuscita di detriti di fuori del sacchetto di mussola - questo farà sì che la contaminazione della preparazione finale HES. Vermi adulti devono hanno lentamente migrate attraverso il panno di mussola e depositato sul fondo della provetta di vetro. Staccare con cautela la provetta dal tubo di gomma di collegamento sopra il lavandino (avendo cura di evitare di perdere i vermi a questo punto). </li><li> Utilizzando una pipetta di plastica, trasferire i vermi in un tubo da 50 ml e lavare sei volte con Hanks &#39;Solution (permettono vermi di stabilirsi con la gravità, rimuovere il supporto con un stripette, aggiungere 40 ml di Hanks&#39; Solution e ripetere cinque volte). NOTA: la cultura verme deve essere mantenuto sterile da questo punto in poi. <ol><li> Spostare una cappa a flusso laminare e lavare altri sei volte in soluzione sterile Hanks &#39;integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina, pronta per la cultura in vitro. </li></ol></li><li> Contare ilvermi adulti recuperati prendendo due campioni di 20 l scattate con una punta taglio giallo di ampliare la sua apertura; aspettarsi circa il 50% della quantità di larve inoculato. </li></ol> 4. Configurazione culture per HES: Media Preparazione, lavaggio vermi adulti <ol><li> Immergere i vermi di 3.11 in circa 10 ml di RPMI supplementato con 10% Gentamicina per 20 minuti, lasciando il riposo tubo ad angolo per garantire vermi sono completamente coperti. </li><li> Eseguire questa in una cappa a flusso laminare: sciacquare sei volte con soluzione di Hanks &#39;(supplementato con 5 U / ml di penicillina e 5 ug / ml di streptomicina). </li><li> Preparare H. supporti polygrus. </li><li> Il mantenimento della sterilità in una cappa a flusso laminare, a 500 ml di RPMI1640, aggiungere 11,1 ml di 45% di glucosio (concentrazione finale 1,2% come RPMI1640 contenente 0,2% di glucosio), 5 ml di 100x Peniclllin-streptomicina (concentrazione finale 5 U / ml di penicillina, 5 ug / ml di streptomicina), 5 ml di L-glutammina (concentrazione finale 2 mM), e5 ml di gentamicina (concentrazione finale 1%). Non aggiungere FCS. </li><li> Worm aliquotare in fiaschi T25 ventilati, c. 1.000 vermi in 15 ml H. polygyrus supporto per bombola, e posto in posizione verticale in 37 ° C incubatore (5% di CO 2) per 3 settimane. </li></ol> 5. Preparazione di HES <ol><li> Raccogliere HES contenenti coltura da colture ad intervalli di non più di due volte alla settimana, mettendo da parte la prima collezione dopo 24 ore di cultura (a causa di elevati livelli di contaminazione LPS e proteine ​​dell&#39;ospite - possono essere trattati separatamente o scartato). Tenere ogni raccolta differenziata e chiaramente etichettati con la data e il numero lotto. Sostituire con un uguale volume di H. polygyrus supporto in ogni occasione. </li><li> Centrifuga HES contenenti supporti a 400 x g per 5 min. Poi filtrare sterilizzare attraverso 0,2 micron filtri a basso contenuto proteico vincolanti in 50 ml provette. Conservare nella -20 ° C freezer chiaramente etichettato con la data di raccolta senza fine e la data di HES collezione. </li><li> Dopo 21 giorni di raccolta HES della cultura, eliminare i vermi. </li><li> Pool 500-1000 ml di HES surnatante (di solito a magazzino congelato, e non, tra cui la collezione prima 24 ore) e concentrarsi su un filtro di 3.000 MWCO nel dispositivo di ultrafiltrazione in pressione di azoto. NOTA: Fare molta attenzione a non far funzionare il filtro a secco. <ol><li> Per impostare il dispositivo di filtro, prima lavare la parte lucida 3 kDa membrana verso il basso in un bicchiere 1 litro con acqua distillata per 3 x 20 min sotto agitazione. Montare il dispositivo di ultrafiltrazione secondo le istruzioni del produttore con membrana del filtro lato lucido in alto. Mettere in cabinet a 4 ° C e passare 50 ml di acqua distillata attraverso prima di iniziare a concentrarsi HES pool. </li><li> Aggiungere ciascun tubo di HES nel dispositivo di filtrazione come richiesto (100-140 ml al giorno), fino a quando il volume viene concentrata fino a 2-5 ml. </li></ol></li><li> Al fine di rimuovere i contaminanti dal supporto di coltura HES contenenti, aggiungere 50 ml di pyrOgen-libera PBS al dispositivo di filtraggio e poi concentrarsi fino a circa 2 ml. Ripetere questa operazione per due volte (150 ml di PBS in totale). Trasferire HES in una provetta da 15 ml, sterilizzare il filtro (con un filtro da 0,2 micron) in una cappa a flusso laminare e misurare la concentrazione di proteine ​​utilizzando uno spettrofotometro (E 280 = 10) oppure mediante saggio Bradford. </li><li> Aliquotare, etichetta con il numero di lotto e la data, e congelare a -80 ° C. </li><li> Eseguire un test LAL cromogenico secondo protocolli del produttore di ciascun lotto di HES prima dell&#39;uso. Se i livelli di LPS sono superiori a 1 U LPS per 1 mg di proteine, considerare non utilizzare questo batch per esperimenti in vivo o in colture in vitro. </li><li> Trattare i HES raccolti a 24 ore separatamente nello stesso modo; esso conterrà LPS e alcune proteine ​​di accoglienza e, pur non adatto per esperimenti funzionali, è un&#39;utile fonte di singole molecole che possono essere isolati dal monoclonale purificazione dell&#39;anticorpo affinità. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

Il ciclo di vita di H. procede polygyrus in modo affidabile coerente. A seguito di ingestione naturale o sonda gastrica di L3 larve al giorno 0, cisti iniziano a formarsi sotto la sierosa duodenale di giorno 5, progressione di mute larvali e quindi emergendo come vermi adulti nel lume intestinale da giorno 10, le uova possono essere visti in feci da giorno 14 e granulomi sono visibili sulla superficie sierosa duodenale dal giorno 21. Il protocollo descritto sopra (e riassunti in Figura 6) permette la produzione ad alta velocità di H. escretori secernente prodotti polygyrus (HES), oltre al recupero affidabile di vitale L3 larve per future infezioni sperimentali e ciclo di vita. Infezione polygyrus H. ha dimostrato di essere protettivo nei modelli di asma dipendenti OVA o Der p 1 (Casa acari della polvere allergeni) 14. Inoltre, la soppressione di infiammazione delle vie aeree potrebbe essere trasferita con CD4 + CD25 + </sup&gt; cellule T regolatrici CD19 + 14 o CD23 hi cellule B normativi 24 da non sensibilizzati, H. polygyrus -infected topi. Nei modelli di autoimmunità, H. infezione polygyrus ha dimostrato di essere soppressiva nel encefalomielite autoimmune (EAE) modello sperimentale di sclerosi multipla 9, e la soppressione possono essere trasferiti sia con le cellule T CD4 + CD19 + o cellule B da topi infetti 24. Heligmosomoides polygyrus escretori secernente prodotti (HES) modulano la risposta immunitaria e sopprimono l&#39;infiammazione Th2 mediata da una serie di meccanismi (descritti in figura 7), tra cui: a) Inibizione di risposta delle cellule dendritiche alla stimolazione 25, b) induzione di CD4 cellule T regolatorie + Foxp3 + 18. c) il blocco di IL-33 di produzione 20. HES ha dimostrato di essere protettivo quando somministrato unt sensibilizzazione o sfida nel modello OVA-allume di asma 19 e anche quando somministrato per via intranasale con estratto di Alternaria allergene 20, attraverso la soppressione del primo IL-33 rilascio. Evitare la contaminazione di LPS HES è spesso determinante per il successo delle future esperimenti immunologici. Nel protocollo qui delineato, i passaggi critici nella realizzazione di questo sono per garantire che i residui contenuti nei sacchetti di mussola dell&#39;Apparato Baermann non entra la preparazione finale HES (cfr 2,10) e di mettere da parte la soluzione ES dalla prima 24 ore di cultura (vedi 5.1). Negli ultimi anni, HES è stato completamente caratterizzato, a livello proteomica con oltre 370 proteine ​​distinte identificate 26,27. Inoltre, ES dalla 4a tappa larve è stato sottoposto ad analisi proteomica 28. I lavori in corso comprende che caratterizza i principali componenti glycan di HES, noti per essere fortemente immunogenico 3, e secreta micro-RNCome che sono incapsulati in 50-100 nm vescicole o exosomes (Buck et al., Presentati per la pubblicazione). Con la definizione di protocolli riproducibili per la raccolta di ES da questo parassita altamente immunomodulante, e con numerosi dati di proteomica identificano i componenti molecolari HES, la scena è ora impostata per l&#39;identificazione e la sperimentazione terapeutica delle singole molecole da H. polygyrus che può mediare gli effetti fondamentali sul sistema immunitario dell&#39;ospite.

Heligmosomoides polygyrus è un elminti gastrointestinale murino naturale che è strettamente legato al altamente prevalenti parassiti nematodi umani 1. A differenza di altri modelli di nematodi, come Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus stabilisce costantemente infezione cronica in topi come risultato diretto di molteplici meccanismi potenti immunomodulatori impiega per sopprimere la risposta immunitaria 2. H. polygyrus ha un ciclo di vita diretta: infettiva L3 larve vengono ingerite dalla trasmissione feco-orale (o somministrata mediante sonda gastrica in ambiente di laboratorio), dopo di che migrano verso lo strato sottosierosa del duodeno e incistano prima di tornare al lume intestinale come vermi adulti circa otto giorni dopo l&#39;infezione iniziale. Produzione di accoppiamento e di uova avviene di giorno 10 e si possono raccogliere i vermi adulti per la cultura e la raccolta di prodotti escretore-secrezione da day 14 in poi 3. H. polygyrus interagisce anche con la microflora commensale, con un aumento lattobacilli presenti in topi sensibili infetti 4-6, e aumento dei livelli di H. infezione polygyrus in seguito all&#39;esposizione di topi per lattobacilli 6. Infezione attiva con H. polygyrus ha dimostrato di proteggere immunopatologia in molti modelli animali di autoimmunità 7-10, colite 11,12 e allergie 13-16. Vi è pertanto stato grande interesse nel potenziale di molecole escretore secernente da questo parassita (&quot;HES&quot;) a down-modulare patologia in vivo 17,18. In effetti, gli effetti protettivi sono visti dopo il trattamento dei topi con HES prodotti 19 attraverso percorsi che ora vengono identificati 18,20. Qui si descrive un protocollo per la produzione affidabile di Heligmosomoides polygyrus e il recupero dei suoi prodotti secretiche può essere ulteriormente utilizzato per una serie di indagini biochimiche e immunologiche funzionali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides polygyrus (precedentemente noto come Nematospiroides dubius, e indicato anche da alcuni come H. bakeri) è un elminti gastrointestinale che impiega più meccanismi immunomodulatori stabilire infezione cronica nel topo e assomiglia molto infezioni prevalenti elminti umani. H. polygyrus è stato ampiamente studiato nel campo della regolazione immunitaria elminti di derivazione ed è stato trovato per sopprimere potentemente modelli sperimentali di allergia e autoimmunità (entrambi con infezione attiva e isolate prodotti secreti). Il protocollo descritto in questo documento descrive gestione del H. polygyrus ciclo di vita per la produzione costante di L3 larve, il recupero di parassiti adulti, e la raccolta dei loro prodotti escretori secernente (HES).

La suscettibilità alle infezioni da H. polygyrus è controllato in larga misura dal background genetico del ceppo di topo (Tabella 1); C57BL / 6 e CBA topi sono altamente suscettibili 21,22. Per la manutenzione del ciclo di vita parassita, l&#39;ibrido F1 tra questi due ceppi è stato scelto per la sua capacità di resistere oneri verme molto elevati senza morbilità (danni eccessivi epiteliale intestinale) rispetto a uno ceppo parentale. Gavage orale di 400 larve L3 viene utilizzato per mantenere il ciclo di vita nei topi F1 (con conseguenti oneri verme adulto mostrati nella Figura 2), mentre una dose di 200 larve L3 è generalmente utilizzato per esperimenti in ceppi inbred omozigoti (ad esempio, C57BL / 6 o BALBc). Tuttavia, questo dosaggio può essere necessario ridurre a seconda di co-fattori ambientali che possono differire tra strutture di animali, come ad esempio variazioni di flora intestinale. I lotti di HES hanno dimostrato effi riproducibilicacia in saggi funzionali e in composizione proteica; Inoltre, quando supernatanti da ogni successiva settimana di coltura sono stati analizzati, fino ad un totale di 4 settimane, i profili proteici sono risultate molto simili (Figura 3). Quando la concentrazione HES viene misurata mediante saggio Bradford (vedi 5.5), il totale proteina è solitamente circa 1 mg / ml (Figura 4). Un metodo alternativo di concentrare HES è con un concentratore centrifugo (es Vivaspin membrane cut-off 3-kDa), in cui i campioni vengono centrifugati fino a 4.000 g in un rotore di centrifuga incernierato, rimuovendo sali tampone e componenti a basso peso molecolare. Concentrazione centrifuga è più adatto a piccoli volumi di elaborazione (1-10 ml) e sono limitati ad un fattore di concentrazione massima di circa 30x. Quando si raccolgono HES, evitare la contaminazione è critica. Per evitare la contaminazione con le molecole di accoglienza, scartiamo HES-containing coltura dal primo 24 ore dopo il raccolto verme adulto dall&#39;intestino mouse. Abbiamo anche quantificare il livello di contaminazione LPS in ogni lotto di HES con un test cromogenico LAL (vedi 5.7). 1 U di LPS equivale a ~ 100 pg LPS e livelli inferiori a questo vengono considerati trascurabili 23. Nelle nostre mani, la maggior parte delle partite di HES sono significativamente al di sotto di questo limite, la concentrazione media di LPS in HES essere 0,23 U / mg (Figura 5). Gli effetti di LPS in modelli in vivo della patologia (ad esempio la soppressione delle risposte asmatici) richiede almeno 10 ng di LPS 23. Quindi in amministrazione vivo di 5 mg HES da un lotto con 100 pg LPS / mg HES includerà 500 LPS pg, anche al di sotto della concentrazione effettiva in cui LPS diventa un problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Baermann Apparatus Baermann Apparato per la raccolta di adulti H. polygyrus (come descritto nel capitolo 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: media Worm Burden 14 giorni dopo l&#39;infezione con 400 L3 Larve Media verme grava 14 giorni dopo l&#39;infezione con 400 L3 larve. I punti dati riportati sono da 19 round di infezione di topi C57BL / 6xCBA. Media ± SEM mostrato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: profili proteici di HES Da settimane consecutive in Cultura profilo SDS-PAGE delle proteine ​​HES raccolti in successive settimane di cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; quantità finale di HES da 500 ml ES contenenti media Resa di proteine ​​HES da 11 diversi lotti derivati ​​da circa 500 ml di cultura surnatante. Media ± SEM mostrato. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: LPS Contaminazione di piani HES di contaminazione LPS in 41 lotti di HES misurati con il test ameobocyte Limulus. Concentrazione mediana LPS = 86 U per mg di HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animated schematica di H. polygyrus Life Cycle Sintesi delle tappe fondamentali del ciclo di vita dalla sonda gastrica di L3 larve, attraverso il recupero di larve e adulti di vermi all&#39;isolamento di HES. Figura 7: Animated schematica della HES e le sue funzioni principali effetti immunomodulatori di mediatori solubili e exosomes contenuti in HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotipo (e lo sfondo ceppo) </td><td> Fenotipo infezione primaria </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ceppi inbred </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente suscettibile </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 e C57BL / 10 </td><td> Suscettibile </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermedio </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Bassa sensibilità </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgenici per citochine o recettori delle citochine </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Più sensibili </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Meno sensibili (a); nessun cambiamento nella sensibilità, ma un aumento dei granulomi (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ transgenici (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecondità superiore </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 o BALB / c) </td><td> Altamente suscettibile </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c o C57BL / 6) </td><td> Altamente resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgenici(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiente Th2, diminuzione granuloma gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Più sensibili </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Nessun cambiamento in suscettibilità </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, maggiore suscettibilità </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgenici per i marcatori di cellule T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Marginalmente superiore fecondità </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Fecondità superiore </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Fecondità Higher &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgenici per innata loci immunitario </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 recettori per l&#39;interferone (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> La fecondità superiore, più granulomi </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Più resistenti, più granulomi </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Più sensibili </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: infezioni primari con H. polygyrus in geneticamente diverse e gene-mirata ceppi di topi.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus è un nematode murino con potenti capacità immunomodulanti che ricordano da vicino quelle di altamente prevalenti infezione da elminti umana. Qui si descrive un protocollo per il mantenimento a lungo termine del H. polygyrus ciclo di vita.

Coltivazione di<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un immunomodulante nematode parassita ei suoi prodotti secreti

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.0K Views.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides polygyrus è un nematode murino con potenti capacità immunomodulanti che ricordano da vicino quelle di altamente prevalenti infezione da elminti umana. Qui si descrive un protocollo per il mantenimento a lungo termine del H. polygyrus ciclo di vita. 

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Un test Parasite salvataggio e di trasformazione per screening Antileishmanial contro intracellulare<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoti in THP1 umana linea cellulare Leucemia acuta Monocytic

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

Monitoraggio parte dell&#39;Assemblea di una Secreted batterica Virulence Factor Uso site-specific reticolazione

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

Valutazione della proprietà immunomodulanti di cellule staminali mesenchimali umane (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da &quot;Acufection&quot; e la sua applicazione alla ricerca della pelle

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

La quantificazione rapida di Mitogen indotta blastogenesi in linfociti T per l&#39;identificazione farmaci immunomodulatori

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Valutazione dei citotossici e gli effetti immunomodulatori di sostanze in fette di polmone umano di taglio di precisione

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...