This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

תרבית תאי האנדותל 1. הכללי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי שור אב העורקים אנדותל (קטעים 4-9) על צלוחיות תרבית רקמת ג&#39;לטין מצופה (משטח תרבית רקמת מעיל עם 0.1% w / v ג&#39;לטין PBS ב RT במשך 15 דקות) בEGM-2 תקשורת (עם כדור EGM-2 ערכה המכילה 5% בסרום שור עוברי, גורמי גדילה וכל תוספים הניתנים על ידי היצרן, פרט להידרוקורטיזון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים הם כמעט ומחוברות (בערך 3 ימים לאחר זריעה לאחר 1: 4 מפוצל), תאי קציר על ידי טיפול עם 0.05% w / v טריפסין / 0.02% w / v EDTA ב PBS על 37 מעלות צלזיוס. לאחר שרוב התאים יש מנותק, להוסיף EGM-2 מדיה מלאה כדי להרוות את טריפסין ולאחר מכן צנטריפוגות (100 XG, 5 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תאים למחקרים על הידבקות דה נובו של תאי האנדותל לפיברונקטין (ניסוי 1: סעיף 2) ודה-ההידבקות הבאה של תאי האנדותל עם הידבקות הוקמה על המצע הזה (ניסוי 2: סעיף 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נקטףתאים פעם אחת עם הסרום חופשי בינוני 199 המכיל 1% w / v אלבומין בסרום שור (BSA) ומחדש צנטריפוגות (100 XG, 5 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש תאים ב% סרום ללא בינוניים 199 המכילים 1 w / v BSA ב 2.5 x 10 5 תאים / מיליליטר (מדידות עכבת תא-מצע) או 5 x 10 5 תאים / מיליליטר (הדמיה תא חי ניתוחים) ולשמור על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. הערה: תגובות ההידבקות של תאים רגישות מאוד להבדלי טמפרטורה (למשל, בשל השפעות הסעה) כך שכל הציוד והפתרונות המשמשים לטיפול ובטיפול בתאים במהלך הפרוטוקולים הבאים צריכים להישמר בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. ניסוי 1: הידבקות תא כימות De Novo האנדותל על פיברונקטין Native וחמצון-MPO (עכבת Cell-מצע) הערה: ניסוי 1 בוחן את המידה שבה תיווך MPO חמצון של פיברונקטין פוגע ביכולתה לתמוך דה נובו </em&gt; הדבקה של תאי האנדותל מושעים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיברונקטין מעיל על מערכי זהב 96-גם תא-מצע microelectrode העכבה. להוסיף פיברונקטין שור 80 μl / היטב מטוהר בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS, דגירה של שעת 2 ​​ב 37 ° C ולהסיר את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה משטחים מצופה פיברונקטין עם MPO כדי לאפשר את הכריכה של MPO לפיברונקטין המשטח מחויב. להוסיף 80 μl / היטב MPO נויטרופילים האנושי המטוהר בטמפרטורה של 20 ננומטר בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) והדגירה של 0.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף משטחים פעמיים עם HBSS כדי להסיר כל MPO מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף H 2 O 2 (0-10 מיקרומטר ריכוז סופי) לבארות הצלחת מערך microelectrode מכילות 80 μl / טוב HBSS ליזום MPO-זרז, חמצון פיברונקטין HOCl תלוי ודגירה עבור שעות נוספות 0.5 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את ההשפעה של מעכבים או מאפננים של תגובות היו זרז-MPO רלוונטיים (למשל, אנזים MPO חלופימצעים, מעכבי אנזים או חומרים נוגדי חמצון; ראה 9 לפרטים נוספים), להוסיף אלה לHBSS מייד לפני H 2 O 2 בנוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 0.5 שעות, טיפול במשטחים עם מתיונין כדי להרוות מיני משטח-כבול שייר חמצון, כלומר, chloramines הנכנס חלבון תגובתי, שיכול להפעיל את פעילות סלולרית של בלבול. להוסיף מתיונין 10 מ&quot;מ ב -80 μl HBSS לכל טוב והדגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק משטחים עם BSA. להוסיף 80 μl / טוב של BSA על 0.2% w / v בPBS, דגירה של שעת 2 ​​ב 37 ° C ולהסיר את הפתרון. הערה: אזורי משטח ציפוי שיורי יתמכו הידבקות תא וחסימה אלה עם חלבון הלא דביק (כלומר, BSA) מבטיחה כי תגובות הידבקות סלולריות תלויות אך ורק על מטריצת התא מודבק המטוהרת המועסקות, במקרה זה פיברונקטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף משטחי פעמיים עם HBSS. הערה: אף אחד מטיפולי השטח שקדמו ניכר משפיעה הקראת תא-מצעGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי האנדותל מושעים זרע (להוסיף 200 μl / גם בקירוב 2.5 x 10 5 מיליליטר תאים /, שהוכן ב199 בינוניים BSA 1% המכילים סרום ללא; ראה 1.3) על גבי משטחי פיברונקטין מצופה האם של חמצון-MPO או. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר זריעת תאים (כלומר, לפני כל מצורף תא והפצה), הר צלחת מערך microelectrode על יציאת החממה (שוכנת בחממה 37 ° C בנוכחות של 5% CO 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת המכשיר באופן מיידי לקחת &quot;ריק&quot; קריאה לנורמליזציה עכבת תא-מצע שלאחר מכן (&quot;מדד תא &#39;) ערכים לערכי הרקע הראשוניים שהתקבלו בהעדר תא-הידבקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום רכישת נתונים רציפים מדד תא (מינימום של קריאה / min מדד תא אחד). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור שעה 2, פרק זמן שבי מצורף תא מקסימאלי ומתפשטים מושגת; זה בא לידי ביטוי על ידיplateauing של ערכי מדד תא (ראה איור 3 א). הערה: הניסוי הקודם (ניסוי 1) בוחנת כיצד חמצון בתיווך MPO הראשוני של פיברונקטין מגביל את יכולתם של תאי האנדותל להקים הידבקות תא על מצע זה. הניסוי (ניסוי 2) הבא בוחן כיצד חמצון פיברונקטין תיווך MPO מקדם ירידה בהידבקות תא-מטריצה ​​(כלומר, דה-הידבקות) בתאי האנדותל עם הידבקות הוקמה על המצע הזה. הטיפולים בשני ניסויים אלה הם למעשה זהים, פרט לעיתוי של חמצון בתיווך MPO פיברונקטין (כלומר, לפני הידבקות תא - ניסוי 1; לאחר הידבקות תא - ניסוי 2). </li></ol> 3. ניסוי 2: כימות תא האנדותל De-הידבקות מפיברונקטין בתגובה לחמצון פיברונקטין תיווך MPO (עכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיברונקטין מעיל על microelectrode זהב 96-היטבrrays למדידות עכבת תא-מצע (להוסיף 80 μl / טוב של פיברונקטין בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS ו דגירה של שעה 2 ב 37 ° C) או תרבות מנות תא עם רצפת זכוכית 35 מ&quot;מ לניתוחי הדמיה תא חיים (להוסיף 2 מיליליטר / צלחת של פיברונקטין בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS ו דגירה של השעה 2 ב 37 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק משטחים עם BSA. להוסיף BSA על 0.2% w / v ב PBS בכרכים מצויינים ב3.1 דגירה במשך שעה 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה משטחים עם MPO כדי לאפשר את הכריכה של MPO לפיברונקטין. הוסף 20 ננומטר MPO האנושי מטוהר בHBSS בכרכים מצויינים ב3.1 ודגירה של 0.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף משטחים פעמיים עם HBSS כדי להסיר כל MPO מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע מושעים האנדותל (שהוכנו בבינוני 199 המכילים 1% w / v BSA סרום ללא; ראה 1.3) על גבי משטחי פיברונקטין האם MPO נושאות או מצופים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl / גם ב 2.5 x 10 5 תאים / מיליליטר ל- 96 מערכי microelectrode עכבת תא-מצע היטב. </li> &lt;li&gt; הוסף 2 מיליליטר / צלחת ב 5 x 10 5 תאים / מיליליטר לכוס 35 מ&quot;מ תחתית תרבות מנות תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר זריעת תאים (כלומר, לפני כל מצורף תא והפצה): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 96 צלחות גם מערך microelectrode על יציאת חממת עכבת תא-מצע (שוכנת בחממה 37 ° C בנוכחות של 5% CO 2) ולקחת קריאות &#39;ריקות&#39; ליזום רכישה רציפה של נתוני מדד תא (סעיף השווה 2.10 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ&quot;מ זכוכית העברת 35 תחתית תרבות מנות תא 37 ° C חממה בנוכחות של 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 כדי לאפשר התקשרות מקסימלי תא והפצה (סעיף השווה 2.11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להסיר (קריאות מדד תא הפסקה בשלב זה) 96 צלחת מערך microelectrode טובה או זכוכית 35 מ&quot;מ תחתית צלחת תרבית תאים מן החממה 37 ° C, להסיר supernatant תא ולהוסיף התחממנו (37 ° C) HBSS (כרכים כpצעד אה 3.1). הערה: HBSS מועסק כאשר לומדים-זרז MPO תגובות חמצון במקום תקשורת והתרבות השלמה כמו זה האחרון מכיל מיני החמצן שמפריעים לתגובות החמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את ההשפעה של מעכבים / מאפננים של תגובות היו זרז-MPO (מצעי אנזים חלופיים, מעכבי אנזים או נוגדי חמצון) או מעכבי איתות תא (לדוגמא, blebbistatin 40 מיקרומטר לעכב התכווצות actomyosin), להוסיף האלה עכשיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקם את צלחת מערך microelectrode בחזרה ל( קריאות מדד תא להתחיל מחדש בשלב זה) 37 ° C או יציאת חממת זכוכית 35 מ&quot;מ תחתית צלחת תרבית תאים בחזרה לתוך חממת 37 ° C, ולאפשר לתאים לאזן ב HBSS ל0.5 שעות. הערה: לאחר איזון 0.5 שעות בHBSS, ערכי מדד התא יתייצבו על ערכים מעט נמוכים יותר; כאשר מראש דוגרים תאים עם מצעי אנזים, אנזים ומעכבי תא איתות או נוגדי חמצון, להבטיח t שראשוןhese אינו משפיע באופן משמעותי את הערכים שהתקבלו לאחר איזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום זרז-MPO, חמצון פיברונקטין HOCl תלוי ודה-הידבקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימודי עכבת תא באמצעות צלחות מערך microelectrode 96 גם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מערך microelectrode מן החממה ולהשהות מדידות מדד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 O 2 (ריכוז סופי של 0-10 מיקרומטר) H לHBSS ולערבב בעדינות על ידי pipetting חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד, מחדש הר מערך microelectrode חזרה אל נמל 37 ° C החממה ולהתחיל מחדש את רכישת קריאת מדד תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימודי הדמיה תא חיים באמצעות צלחת תרבית תאי זכוכית תחתית 35 מ&quot;מ: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת התרבות מן החממה והר על במה מחוממת 37 מעלות צלזיוס של מיקרוסקופ confocal הפוך מצוידים בעדשה אובייקטיבית 63X מים עם אופטיקה דסק&quot;ש המתאימה להקלטת סרטי תא חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בתאים ולייעל אופטיקה דסק&quot;ש (תאורת קוהלר, פיגור שהטיה ומצלמה לקזז / רווח, לפרטים, ראה 13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום סרט דסק&quot;ש ולהקליט קריאות בסיס של תאים שלא טופלו דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 O 2 (ריכוז סופי של 0-10 מיקרומטר) H ולערבב בעדינות על ידי pipetting חזר. Re-להתמקד מיקרוסקופ (במידת צורך) ולהמשיך בסרטי הקלטה של ​​דסק&quot;ש התאים שטופלו במשך תקופת הזמן הנדרשת. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. ניתוח נתונים והצגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני עכבת תא-מצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא גלם (מדד תא לעומת זמן) לגיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימודי תא דה-הידבקות (ניסוי 2: סעיף 3), לנרמל את הנתונים על-ידי הגדרת ערכים שנרשמו ערב תחילתו של חמצון פיברונקטין תיווך MPO בשווי של 1 (כלומר, מייד לפני התוספת של H 2 O 2 ב3.11 .1.1). הערה: הדבר מבטיח כי ביחסשינויים בערכי מדד תא שהושרו על ידי חמצון פיברונקטין תיווך MPO אינם רעול פנים על ידי הבדלים ראשוניים קטנים בערכי מדד תא מוחלטים בין בארות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים הנוכחיים כחלקות מדד מנורמל תא (ציר y) לעומת זמן (ציר x). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני הדמיה תא חי (מחקרי תא דה-הידבקות בניסוי 2: סעיף 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח דסק&quot;ש לחיות סרטי הדמיה תא נרשמו מייד לפני ואחרי תחילתו של חמצון פיברונקטין תיווך MPO בתכנית ניתוח תמונה סטנדרטי (לדוגמא, תוכנת ImageJ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות בשני סרטי דסק&quot;ש נפרדים באופן אקראי לבחור תאים מרובים ולמדוד האזור המוקרן במסגרות רציפות (לדוגמא, במרווחים דק &#39;1) על ידי התחקות ידנית קצה הקרום שלהם וכימותי מספר הפיקסלים סגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני שטח תא יצוא נתונים גולמיים (אזור תא מוקרן לעומת זמן) לגיליון אלקטרוני Excel ולנרמל על ידי קביעת ערכים שנרשמו בסמוך להייזום של חמצון פיברונקטין תיווך MPO בשווי של 1 (כלומר, מייד לפני התוספת של H 2 O 2 ב3.11.2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים הנוכחיים כעלילה של אזור המנורמל תא (ציר y) לעומת זמן (ציר x). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function.">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li><li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+extracellular+matrix+and+its+role+in+human+pathologies.">Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies.</a> Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).</li><li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+transcytosis+of+myeloperoxidase+confers+specificity+to+vascular+ECM+proteins+as+targets+of+tyrosine+nitration.">Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration.</a> J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).</li><li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mapping+of+pulmonary+and+vascular+nitrotyrosine+reveals+the+pivotal+role+of+myeloperoxidase+as+a+catalyst+for+tyrosine+nitration+in+inflammatory+diseases.">Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases.</a> Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).</li><li>Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+control+of+endothelial+function+and+dysfunction:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities.">Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-derived+oxidants+selectively+disrupt+the+protein+core+of+the+heparan+sulfate+proteoglycan+perlecan.">Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan.</a> Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).</li><li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+subendothelial+matrix+oxidation+by+myeloperoxidase+triggers+myosin+II-dependent+de-adhesion+and+alters+signaling+in+endothelial+cells.">Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells.</a> Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).</li><li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+(RT-CES)+technology+to+cell-based+assays.">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically.">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li><li>Vissers, M. C., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypochlorous+acid+disrupts+the+adhesive+properties+of+subendothelial+matrix.">Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix.</a> Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).</li><li>Ziv, N. E., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Interference+Contrast+(DIC)+Imaging+of+Living+Cells.">Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Kennett, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+modifies+the+structure+and+function+of+the+extracellular+matrix+proteoglycan+perlecan+by+reaction+with+both+the+protein+core+and+the+heparan+sulfate+chains.">Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains.</a> Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).</li><li>Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+dominates+adhesive+ligand+density+in+regulating+cellular+de-adhesion+and+retraction+kinetics.">Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics.</a> Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).</li><li>Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+subcellular+release+for+studying+the+dynamics+of+cell+detachment.">Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment.</a> Nat Methods. 6, 211-213 (2009).</li></ol>

אי לנו גילויים לעשות.

הידבקות תא-מטריצה ​​ותהליכי דה-הידבקות ניתן לכמת בצורה מדויקת בזמן אמת עם רזולוציה גבוהה זמנית באמצעות עכבת תא-מצע והדמיה תא חי ניתוחים. גישות אלה בזמן אמת מספקות יתרון גדול על פני נקודת סיום הניתוח של הידבקות תא, המספק פתרון זמני עני. על ידי במדויק כימות תגובות דה-ה?...

אנשי קשר דבק יציבים בין תאים והחוץ-התאי המקיף אותם נדרשים לשמירה על הומאוסטזיס רקמות. לדוגמא, הדבקת תא האנדותל למטריצת subendothelial בכלי דם משחקת תפקיד קריטי בשמירה על שלמות שכבת האנדותל ותפקודו homeostatic כחסם רגולטורים, חדיר למחצה כלי דם 1. Cytoskeleton אקטין מצמיד מכאנית לדבק מולקולות מטריצה ​​באתרים של הידבקות התא-מטריקס ואנשי קשר דבק בממשק שהתא-המטריצה ​​לשחק תפקיד חשוב בקביעת המיקום של קרום התא על ידי התנגדות כוחות המתיחה actomyosin מרכזית מכוונות. גירויים תאיים המשנים הידבקות תא-מטריצה ​​בהכרח לשנות את מאזן כוחות בממשק שהתא-מטריקס, אירוע שהוא במהירות &quot;חשו&quot; על ידי חלבוני איתות מכאניים רגישה, וכתוצאה מכך התמרה של &quot;מחוץ-באיתות&quot;. הימור הצטלבות זותאי Ween ומטריצת החוץ תאי המקיפה אותם ממלאות תפקיד מרכזי בשליטה צורת תא, תנועתיות, פונקציה, שגשוג והישרדות 2. תהליכים מגוונים פיתו-פיסיולוגי (התפתחות עוברית, דלקת, תיקון פצע וגרורות סרטן) מתאפיינים בעיצוב מחדש דינמי של מצעי מטריצת דבק על ידי חמצון מטריצה-משפילה ו / או אנזימים 3,4. לדוגמא, דבק חלבוני מטריצת subendothelial בכלי דם (למשל, פיברונקטין) הם מעורבים כמטרות עיקריות לשינוי או השפלה במחלות דלקתיות אדם בשל הייצור המקומי של חמצון תגובתי (למשל, חומצת hypochlorous, HOCl) על ידי האנזים המופק מויקוציטים Myeloperoxidase (MPO), אשר מצטבר בתוך subendothelium במהלך מחלת כלי דם דלקתית (איור 1) 5-9. שינויים בהידבקות תא-מטריצה ​​הנגרמים על ידי חמצון נגזר MPO וגירויים שינוי מטריצה ​​אחרים ליקאיליי למלא תפקידים חשובים בשינוי הומאוסטזיס כלי דם במהלך מגוון רחב של תהליכים פתולוגיים; למשל, על ידי שינוי איתות תא האנדותל, מורפולוגיה וכדאיות, אשר בתורו מדאיגה את תפקוד האנדותל ושלמות מחסום. עם זאת, תגובות האיתות מורפולוגיים ותא של תאים חסיד לשינויים מטריצה ​​תאיים הן רק מתחילות להיות מובנות. כדי להבין כיצד שינויי מטריצה ​​לנהוג שינויים בדינמיקת הידבקות תא ומסלולי תא איתות הידבקות תלויה, טכניקות נדרשות במדויק לכמת שינויים בהידבקות התא-מטריקס בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה זמנית. כאן אנו מתארים עכבת תא-מצע משלים וטכניקות הדמיה תא חיות שעומדות בקריטריונים הללו ולספק פלטפורמה לכמת הידבקות תא ותהליכי דה-הידבקות באופן לא פולשני. אנו מראים כיצד עכבת תא-מצע אלה וappro הדמיה תא החיכאבים יכולים להיות מועסקים בקלות ל( i) לפקח על הדינמיקה של קובץ מצורף תא והפצה (כלומר, דה נובו הידבקות תא) על גבי מצעי מטריצת ילידים שונה ו( ii) כדי למדוד את הדינמיקה של ניתוק תא-מטריצה ​​(כלומר, דה-הידבקות ) על ידי תאים חסיד החשופים לגירויי שינוי מטריצה. מערכת biosensor עכבת תא-מצע xCELLigence מספקת מדידה רציפה של אזור מגע תא-מטריצה ​​על ידי כימותי עכבה חשמלית על פני השטח של מערכי microelectrode זהב 96-היטב ומבטאת מדידות עכבה חשמליות אלה, כמו &quot;מדד תא &#39;, ערך ממדים ש במידה רבה יחסי לאזור של תא-מצע ליצירת קשר 10 (איור 2), בעוד גם להיות רגישים לשינויים במרחק הממוצע בין קרום התא (בידוד) ופני האלקטרודה 11. עלייה נוספת בערכי מדד תא השיגה גם על היווצרות tha קשר תאי תאים הצמודt להגביל זרם paracellular, 11 תנאים שאינם גוברים בתוך הניסויים שתוארו במחקר זה. מדידה של האזור המוקרן של תאים בודדים לאורך זמן על ידי ניתוח תמונה של התערבות ההפרש לעומת זאת זמן לשגות סרטים (DIC) מספקת מידה משלימה של שינויים בתחום קשר עם תא-מצע ומספק מידע נוסף לגבי האופי והדינמיקה המדויק של שינויים מורפולוגיים לכמת ידי גישת עכבת תא-מצע. באופן ספציפי, אנו מתארים את יישום גישות אלה כדי לפקח איך תיווך MPO חמצון של חלבוני מטריצת subendothelial דבק (למשל, פיברונקטין) (i) מפחית את הידבקות דה נובו של תאי האנדותל הושעו על פיברונקטין מטוהר ו( ii) מפעיל דה התא-מטריקס -adhesion בתאי האנדותל עם הידבקות הוקמה על פיברונקטין. על ידי ביצוע איתות תא מקביל מנתח לאורך זמן באמצעות Biochem הרלוונטימבחני iCal (למשל, מערבי סופג), יחסי זמן וסיבתי בין תהליכי ההדבקה / דה-הידבקות ושינויים הקשורים באירועי תא איתות הידבקות תלויה ניתן לקבוע. גישות אלה שמשו לאחרונה על מנת להוכיח כי חמצון חוץ-תאי זרז ידי הפקדות subendothelial של MPO מפעיל אובדן מהיר בהידבקות תא-מטריצה ​​של תאי האנדותל המונעת על ידי כוחות התכווצות actomyosin קיים מראש 9. חשוב לציין, בכך שיאפשר קשר הזמני בין שינויים בשתי הידבקות התא ותא הידבקות תלויה איתות שייקבע, גישות אלה זיהו כי שינוי מטריצה ​​מושרה MPO ודה-הידבקות סלולרית מפעיל שינויים במסלולי הידבקות תלויה חשובים תא איתות כוללים קינאז Src שרשרת זירחון paxillin + התלוי ושרירן אור II זרחון (איור 1) 9. מצב זה של איתות חיזור תלוי, involving ההפעלה של אירועי איתות תאיים על ידי תגובות חמצון תאיים המשבשות הידבקות התא-מטריקס, מייצג מצב רומן של תא איתות מכונה &quot;מחוץ-באיתות חיזור&quot; (איור 1) 9. באופן כללי, biosensor אלה משלימים עכבת תא-מצע וגישות הדמיה תא חיות צריכים להיות בעל ערך בחשיפה כמה שונה גירויי שינוי מטריצה ​​או סוכנים לנהוג שינויים בדינמיקת הידבקות תא, מורפולוגיה ואיתות בתוך תא-סוגים שונים חסיד כפופים למגוון רחב של הגדרות ניסיוניות. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לכמת את ההשפעה של חמצון מטריצת תיווך MPO על דה נובו הידבקות אנדותל תא (ניסוי 1) ודה-הידבקות אנדותל תא (ניסוי 2) תהליכים. MPO נקשר בשקיקה לפיברונקטין וחלבוני subendothelial דבק אחרים חוץ-תאיים וes מי חמצן (H 2 O 2) להמיר יוני כלוריד (Cl -) לחומצה מאוד תגובתי חמצון chlorinating hypochlorous (HOCl), אשר מגיבה באופן מקומי עם חלבוני מטריצה ​​אלה ומשבשים מאפיינים דבקים הסלולרי שלהם (איור 1) 8,9, 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1328">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:551px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">E-Plate 96</td>
			<td>single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">blebbistatin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">B0560</td>
			<td>selective inhibitor of non-muscle myosin-II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">BW-6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGM-2 BulletKit</td>
			<td style="width:223px;">Lonza</td>
			<td style="width:151px;">CC-3162</td>
			<td>endothelial cell growth media kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fibronectin, lyophilized powder</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">F-4759</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td>
			<td style="width:223px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:151px;">FD35-100</td>
			<td>Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">G9391</td>
			<td>cell culture substratum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">14025076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:223px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">107298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Medium-199</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">11150-059</td>
			<td>serum-free cell media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Methionine</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">M9500</td>
			<td>quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">475911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td>
			<td style="width:223px;">ACEA Biosciences / Roche</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td>Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using cell-substrate impedance and live cell imaging to measure real-time changes in cellular adhesion and de-adhesion induced by matrix modification

הידבקות תא-מטריצה ​​ממלאת תפקיד מרכזי בשליטה מורפולוגיה של תאים ואיתות. גירויים המשבשים הידבקות תא-מטריצה ​​(למשל, Myeloperoxidase וחמצון שינוי מטריצה ​​אחר / אנזימים שפורסמו במהלך דלקת) הם מעורבים במפעילים שינויים פתולוגיים בתפקוד התאי, פנוטיפ וכדאיות במספר המחלות. כאן, אנו מתארים כיצד עכבת תא-מצע וגישות הדמיה תא חיות יכולים להיות מועסקות בקלות לכמת במדויק את השינויים בזמן אמת בהידבקות תא ודה-הידבקות הנגרמת על ידי שינוי מטריצה ​​(תוך שימוש בתאי האנדותל וMyeloperoxidase כגירוי שינוי המטריצה ​​pathophysiological) עם רזולוציה גבוהה זמנית ובאופן לא פולשני. מערכת עכבת תא-מצע xCELLigence רציפות מכמתת את האזור של הידבקות תא-מטריצה ​​על ידי מדידת העכבה החשמלית בממשק שהתא-המצע בתאים שגודלו במערכי microelectrode זהב. ניתוח תמונה של זמן לשגות בידולtial סרטי ניגוד להפרעות מכמת שינויים באזור המוקרן של תאים בודדים לאורך זמן, המייצג את השינויים באזור מגע התא-מטריקס. שני טכניקות מדויקים לכמת שינויים מהירים לתהליכי הדבקה סלולרית ודה-הידבקות. עכבת תא-מצע על מערכי biosensor microelectrode מספקת פלטפורמה למדידות תפוקה גבוהה חזקה,. הדמיה תא חי מנתחת לספק פירוט נוסף לגבי האופי והדינמיקה של השינויים מורפולוגיים לכמת ידי מדידות עכבת תא-מצע. גישות משלימות אלה מספקות תובנות חדשות חשובות איך שינוי חמצוני-זרז Myeloperoxidase של רכיבי מטריצה ​​תאיים subcellular מפעיל שינויים מהירים בהידבקות תא, מורפולוגיה ואיתות בתאי האנדותל. גישות אלה חלות גם על לימוד דינמיקת הידבקות סלולרית בתגובה לגירויי שינוי מטריצה ​​אחרות ובתאים הקשורים חסיד (לדוגמא, תאי אפיתל).

כימות של תא דה-הידבקות האנדותל מפיברונקטין בתגובה לחמצון בתיווך MPO פיברונקטין (ניסוי 2). הזריעה של מתלי תא האנדותל על ילידי תוצאות פיברונקטין פיברונקטין (MPO חינם) או MPO נושאות בקובץ מצורף תא מקסימאלי ומתפשטים בזמן אמת בתוך 2 שעות, כפי שיישפט על ידי plateau...

Watch this Scientific Journal Video about Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification at JoVE.

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת ברציפות תהליכי הידבקות התא ודה-הידבקות עם רזולוציה גבוהה זמנית באופן בלתי פולשני על ידי עכבת תא-מצע והדמיה תא חי ניתוחים. גישות אלה חושפות את הדינמיקה של תהליכי הדבקת תא / דה-הידבקות מופעלים על ידי שינוי מטריצה ​​והיחסים הזמני שלהם לאירועי איתות הידבקות תלויה.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.9K Views.  University of New South Wales.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת ברציפות תהליכי הידבקות התא ודה-הידבקות עם רזולוציה גבוהה זמנית באופן בלתי פולשני על ידי עכבת תא-מצע והדמיה תא חי ניתוחים. גישות אלה חושפות את הדינמיקה של תהליכי הדבקת תא / דה-הידבקות מופעלים על ידי שינוי מטריצה ...

Video: Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

יוניברסל כף היד תלת ממדי Optoacoustic הדמיה בדיקה לרקמות עמוקות אנגיוגרפיה אדם ופונקציונליים פרה-קליניים מחקרים בזמן אמת

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

כף יד Photoacoustic קליניים מערכת הדמיה עבור בזמן אמת לא פולשנית הדמיה בעלי חיים קטנים

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...