עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH AI56168, AI71142, AI87541 וAI100631 לMDP. מאוריציו Del Poeta הוא בורוז Wellcome חוקר במחלות זיהומיות.

1. כולסטרול דלדול של תאי J774A.1 עם MβCD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, תאים כמו מקרופאג-10 5 J774A.1 זרע לכל גם על צלחת תרבית תאי 96-גם ב -200 μl של הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מmonolayer התא ולשטוף את התאים פעמיים עם פוספט 1x שנאגרו (PBS) שסונן או autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון MβCD בריכוז הרצוי (10 מ&quot;מ או 30 מ&quot;מ בPBS) או 1x PBS כביקורת דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. הסר supernatant ובמילואים בRT לניתוח כמותי עם ערכה זמינה מסחרי ביצוע ההליך באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים פעמים עד שלוש פעמים עם 1x PBS או בסרום ללא DMEM ולהמשיך בתאי דלקת או lyse ידי pipetting פעמים עד שלוש פעמים עם H 2 O deionized לניתוח עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה או עם ערכה. הערה: בעקבות דלדול כולסטרול יכול לשמש ערכת כימות כולסטרול זמינה מסחרי. ראה סעיף חומרים לפרטים. עקוב אחר ההוראות של היצרן כפי שנכתב. </li></ol> 2. תצפית של כולסטרול תוכן על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טנק TLC פעמיים עם אצטון ופעם אחת עם פתרון של אתר נפט: אתר diethyl: חומצה אצטית (65: 30: 1 על ידי נפח). להרוות את המכל באתר הנפט: אתר diethyl: חומצה אצטית (65: 30: 1 על ידי נפח) פתרון ולהשאיר O / N. יש להשתמש תמיד ממסים אורגניים תחת מנדף כדי למנוע שאיפה של אדים: הערה. כפפות ומעייל מעבדה צריכים להיות משוחק בכל העת. חומצה אצטית היא חומצה חזקה ויש להשתמש בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 תאים כמו מקרופאג-6 J774A.1 לכל גם בce 6-גםצלחת תרבות ll בנפח של 5 מיליליטר של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן מקרופאגים של כולסטרול על ידי ביצוע צעדים 1.2-1.4, החלפת 1 מיליליטר ל -200 μl ישים כדי להסביר את הגודל גם הגדול יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של טריפסין-EDTA היטב כל אחד, דגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ובעדינות לגרד תאים עם מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר לתוך צינור microfuge ולהוסיף 500 μl נוסף של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים למשך 5 דקות ב XG 300 ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 500 μl נוסף של DMEM החם בתוספת 10% FBS ו -1% P / S לתא גלולה וresuspend בקפידה על ידי pipetting מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μl של תאים ולספור תאים על hemocytometer. לנרמל את ריכוזי תא מכל מדגם ולהוסיף מספר שווה של תאים לצינורות זכוכית. הערה: בשלב זה, במאי אחדלבחור לשלב תאים מאותו קבוצות הטיפול לקבלת תמצית שומנים סופיות מרוכזת יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT ולהסיר תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של מתנול ומערבולת. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של כלורופורם ומערבולת. בדוק את מצב השלב לוודא הפתרון בmonophasic. הערה: ניתן לאחסן צינורות על 4 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב RT ולהעביר את supernatant לצינור חדש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 מיליליטר נוסף של כלורופורם ואחריו 1 מיליליטר של DH 2 O. מערבולת פעמיים למשך 30 שניות. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל שפופרת זכוכית על איזון עדין ולהשתמש בזכוכית פיפטה פסטר להעביר את השלב נמוך יותר לתוך צינור הזכוכית של משקל ידוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את שומנים במאייד צנטריפוגלי עד (כ 2 שעות) יבשות. שוקל צינור עם שומנים מיובשים ולחשב את משקל השומנים היבש. הערה: שומנים יבשים יכולה להיות מאוחסן ב-20 ° C עד מוכן לבצע TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל שומנים מיובשים בכלורופורם מספיק כדי לנרמל את הריכוז של שומנים בדם (בדרך כלל 20-50 μl) ועומס 20 μl של השומנים בדם המדולל על צלחת TLC סיליקה. עומס 20 מיקרוגרם של הכולסטרול בדילול מלא 20 μl של כלורופורם כסטנדרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף צלחת TLC מיובשת למכל הרווי TLC ולאפשר ממס להעביר עד 1 סנטימטר לפני קצה צלחת. הסר את צלחת TLC מהטנק ולאפשר לו להתייבש כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו שומנים על ידי הצבת בטנק אדי יוד כדי לבדוק הגירה. הסר ולאפשר כתמים לדעוך במשך כ 10 - 15 דקות מתחת למכסת המנוע. הערה: יוד הוא מפגע שאיפה. להשתמש תמיד מתחת למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מכתים שומנים ניטראליים על ידי שילוב של 60 מיליליטר של מתנול עם 60 מיליליטר של H 2 O deionized, 4 מיליליטר של חומצה גופרתית, ו 630 מ&quot;ג כלוריד מנגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט ובזהירות לטבול את צלחת TLC לפתרון מכתים שומנים הניטרלי במגש ולהסיר ללא השלת מעליה את l סיליקהאייר. הערה: הפתרון מכתים שומנים הניטרלי ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים וכך שניתן לשלוף אותו מהמגש והניח בחזרה בבקבוק לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צלחת לייבוש מתחת למכסת המנוע בRT עד שכל הבועות נעלמו. מחממים את צלחת TLC על סט גוש חום 160 מעלות צלזיוס וchar לצבע הרצוי. הערה: תכנית צפיפות כגון LS עבודות חזון יכולה לשמש כדי לכמת את הלהקות החרוכות כדי להשוות דגימות שומנים. </li></ol> 3. זיהום של המקרופאגים עם ג neoformans (H99) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 תאים דמויי מקרופאג 5 בכל טוב בצלחת תרבית תאי 96-גם ב -200 μl של DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N. הערה: זיהום יכול להיעשות גם בזכוכית תחתית מנות confocal הדמיה קלה יותר; כל הסכומים יישארו זהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות של ג neoformans (H99)על ידי inoculating 10 מיליליטר של YNB עם מושבה אחת שהתקבלה מצלחת פגעה ודוגר זה O / N ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ולספור C. neoformans תאים (H99). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ג תרבות neoformans O / N ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת וזורקים. לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של 1x PBS. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולשטוף עם 5 מיליליטר של PBS 1x המסונן. צנטריפוגה ב1,700 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ו resuspend ב 5 מיליליטר של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דילול סדרתי בPBS להשיג דילול 1: 500 של התרבות שטפה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של המדגם המקורי 100 μl 900 μl של 1x PBS להשיג דילול 1:10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של 1:10 מדגם מדולל 100 μl 900 μl של 1x PBS להשיג דילול 1: 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 1: המדגם המדולל 100 עד 800 μl של 1x PBS להשיג 1: diluti 500ב </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl של 1: 500 דילול ולסמוך על hemocytometer כדי לחשב את מספר התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד להפעלת מקרופאגים וopsonizing ג neoformans. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל LPS ו100x IFNγ מפתרונות מניות על ידי הוספת 10 μl 990 μl. הערה: LPS וIFNγ משמשים כדי לשפר את ספיגת phagocytic אך אינם נדרשים לphagocytosis. אם יש עניין בפעילות קוטלי פטריות של מקרופאגים, לבצע O ההפעלה / N על 37 מעלות צלזיוס עם רעד לפני ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימה לשלב 7.5 μl של LPS המדולל, 1.25 μl של IFNγ המדולל, 1.25 μl של נוגדן GXM והנפח של ג תרבות neoformans שנותנת 1.25 x 10 5 תאים. תביא נפח עד 250 μl מוכפל במספר הדגימות עם DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת דגירה פתרון למשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. הערה:כולסטרול דלדול (שלבים 1.2-1.4) יכולים להיעשות במקביל לצעד opsonization. הקפד לטפל מקרופאגים לפני שילוב הפתרון עובד, כצריכים בצורה אופטימלית לשמש תאי opsonized לא יותר מ -20 דקות הבאות הדגירה צעד 3.4.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק המקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרופאגים שטפו פעמיים עם הסרום ללא DMEM ולהוסיף 200 μl של ג opsonized neoformans עובד פתרון לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לתקן וכתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה ולשטוף תאים 2 פעמים עם DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש monolayer התא במשך 10 דקות ולהוסיף 200 μl של מתנול הקר כקרח כדי לתקן את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 15 דקות ב RT ולהסיר כל מתנול שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 10x Giemsa ודגירה של 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 - 3 פעמים במים ללא יונים וO היבש / N עם פקק. הערה: הדמיה ניתן לעשות ביום שלמחרת או עד followi שבועצביעת ng. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו והרוזן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, לספור 300 תאים לכל נקודת נתונים (אם יש 2 של אותו הטיפול לספור 150 לכל טוב) ורשום את המספר של מקרופאגים הנגועים ומספר תאי קריפטוקוקוס נבלעו. הערה: כדי להבטיח אפילו דגימה לשימוש נקודת נתונים 2 צלחות לכל מצב, לבחור 3 אזורים שאינם חופפים לכל צלחת ולספור 50 תאים לכל אזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מדד phagocytic על ידי הכפלת השיעור של מקרופאגים הנגועים במספר הממוצע של ג neoformans למקרופאג. לנרמל מדד phagocytic בהבעת ערכים כאחוז מPBS 1x טופל שליטה. לאחר כמה ניסויים לחשב את הערך הממוצע וסטיית התקן של הממוצע כדי לקבוע מגמות במדד phagocytic. השתמש במבחן t תלמיד כדי לקבוע משמעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח micrographs של תאים ב1,000X או הגדלת 400X. </li></ol></li></ol> 4. Trypan הכחול Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי סטרילי, זרע 10 6 תאים כמו מקרופאג-לכל גם על צלחת תרבית תאי 6 גם בנפח של 5 מיליליטר של המדיום של Dulbecco המינימלי החיוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין . לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן מקרופאגים של כולסטרול על ידי ביצוע צעדים 1.2-1.4 החלפת 2 מיליליטר ב -200 μl ישים כדי להסביר את הגודל גם הגדול יותר. הערה: הקפד לכלול שליטה טופלה ב1x PBS, כמו גם שליטה שגרדה לפני כל טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 1x PBS היטב כל אחד ועדינות לגרד תאים עם מגרד תא. להעביר לתוך צינור microfuge ולהשעות את התאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μl של תאים ואת הכתם עם 1 μl של 4% Trypan כחולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים על hemocytometer ולחשב את הכדאיות באמצעות המשוואה הבאה: כדאיות% = [1 - (תאים כחולים / תאים בסך הכל)]x 100. ערכים לנרמל לשליטה שהייתה שלא טופל. לאחר כמה ניסויים לחשב את הערך הממוצע וסטיית התקן כדי לקבוע מגמות בכדאיות. השתמש במבחן t תלמיד כדי לקבוע משמעות. </li></ol>

<ol>
	<li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival.">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host &amp; Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li><li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages:+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton.">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li><li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis.">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173 (2012).</li><li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection.">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li><li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice.">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococci+At+The+Brain+Gate:+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse.">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li><li>Chr&#233;tien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia.">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li><li>Luberto, C., Martinez-Mari&#241;o, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans.">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li><li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans.">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+Me+If+You+Can:+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans.">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans.">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li><li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin.">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).</li><li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol.">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li><li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection:+Implications+In+Leishmaniasis.">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li><li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms,+And+Their+Role+In.">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li><li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes.">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes.">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews.">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li><li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane.">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification).">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li><li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages.">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li><li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous.">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li><li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice.">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).</li><li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry.">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בעבודה עם פרוטוקול זה חשוב להשיג ספירת תאים מדויקת כאשר ציפוי תאי יונקים וopsonizing ג תאי neoformans. זה ממזער וריאציה בין ניסויים ומבטיח 1 מדויק: יעד 1 יחס מפעיל לאורך כל תקופת המחקר. זה גם קריטי כדי לתאם את התזמון של דלדול הכולסטרול וזיהום כדי למנוע את תאי שמרי opsonized ?...

Phagocytosis הוא תהליך שבו גופים תאיים מופנמים על ידי תאי מארח. זהו נשק מרכזי בארסנל של מערכת החיסון להגן מפני פתוגנים, אך התהליך עשוי לעתים קרובות להיות חתר תחת ידי פתוגנים כדי לאפשר להפנמה ולהתפשט בכל הגוף 1. Phagocytosis מתווך על ידי מספר אירועי איתות שיביאו להתקשרות ובליעה באמצעות ארגון מחדש של שלד התא של התא המארח. phagocytes &#39;המקצועית&#39; מסוגל לזהות ולהיקשר לopsonins על פני השטח של הפולש לאותת להתקשרות והיווצרות lamellipodia, אשר לבלוע את הפתוגן ויוצר phagosome 2. בין phagocytes &quot;המקצועי&quot; שנקרא מקרופאגים. המקרופאגים הם תאים מאוד מיוחדים שיבצעו את התפקידים הגנתיים הכוללים לחפש וביטול גורמי מחלה גורמת, תיקון רקמות שנפגעו, ומתווך דלקת, רובאלה בתהליך של phagocytosis 1,2. neoformans קריפטוקוקוס הוא מינים של שמרים פתוגניים שגורם למחלה קשה הידועה בשם Cryptococcosis. נבגי קריפטוקוקוס הם נשאפים על ידי המארח ולגרום לדלקת ריאות שהיא בדרך כלל ללא תסמינים. הוא חשב כי החשיפה היא מאוד נפוצה; מדגם של 61 ילדים ממחל זיהומיות בילדי קליניקה במרכז בית החולים בברונקס-לבנון מצאה כי כל שהשתתפו בסקר היו אלה נוגדנים לglucuronoxylomannan פוליסכריד cryptococcal ומחקרים אחרים הראה שכיחות בשני וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגוע ומבוגרים נגועים 3, 4. מקרופאגים מכתשיים הם הקו הראשון של תגובה לדלקת ריאות וברוב המקרים בהצלחה ברור הפתוגן. עם זאת, אצל אנשים מדוכאי חיסון (חולים למשל, HIV ואיידס) השמרים הוא מסוגלים לשרוד בתוך מקרופאגים. באלהמקרים, מקרופאגים יכולים לשמש כנישה לשכפול של הפתוגן ועשויים להקל על הפצתו למערכת העצבים המרכזית (CNS) שבו המחלה הופכת קטלנית 5-8. הוא חשב כי מקרופאגים אולי אפילו לספק את השמרים ישירות לתוך קרומי המוח, עוזרים השמרים לחצות את מחסום דם המוח באמצעות המודל &quot;סוס טרויאני&quot; 3,9 - 11. לפיכך, חשוב להבין את התהליך של phagocytosis וגורמים המשפיעים עליו, בעיקר בזיהומי cryptococcal. העבודה קודמת במערכות פתוגן אחרות מצביעה על רפסודות כולסטרול ושומנים בדם נוצרות על ידי כולסטרול כבעל תפקיד חשוב בphagocytosis 12 - 15. כולסטרול הוא מיני שומנים הנפוצים ביותר בתאי יונקים וכולל 25-50% מקרום התא היונקים 16. זה כבר נמצא לשחק תפקיד בויסות הביופסיהמאפייני hysical של ממברנות על ידי שינוי קשיחותם 17. כולסטרול וsphingolipids יחד יוצרים microdomains שומנים בתוך הקרום הידוע כרפסודות שומנים בדם. רפסודות שומנים בדם נמצאו להיות מעורבת בהיווצרות caveolae, כמו גם מתן תחום מבודד לסוגים מסוימים של איתות 16-18. בשל גודלם הקטן, שקשה ללמוד רפסודות שומנים בגוף חי. דרך שימושית אחד כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים היא לשנות בוחריהם. מתיל-β-cyclodextrin (MβCD) היא תרכובת שנמצאה לרוקן את הכולסטרול מקרומי יונקים ומשמש בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים 18. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לרוקן את הכולסטרול מקרום תא מארח ולכמת את ההשפעה של הדלדול ביכולתם של תאי המארח לphagocytose ג neoformans במבחנה. הליך זה עושה שימוש בתרבית תאי techniques על מקרופאג הונצח כמו שורת תאים (J774A.1) כמודל לזיהום. כולסטרול דלדול הושג על ידי חשיפה לMβCD, שבו יש ליבה הידרופובי ספציפית לגודל של סטרולים והוא מסוגל לפעול ככיור לכולסטרול לצייר מתוך הקרום 19. כולסטרול דלדול נמדד כמותית באמצעות ערכה זמינה מסחרי ואיכותי באמצעות שאיבת שומנים בליי-דייר שונה ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) 20. . Phagocytosis נמדד על ידי הדבקה של תא הקו עם תרבות של שמרי opsonized מעורבבים עם קוקטייל של אינטרפרון-γ וlipopolysaccharide להפעלת מקרופאגים קריפטוקוקוס היה opsonized באמצעות נוגדן glucuronoxylomannan (GXM) 21 - 23. מכתים וניסויים במיקרוסקופ אפשרו להדמיה של התאים וחישוב מדד phagocytic להעריך את מידת הרס עצמי. יחדיו, ד פרוטוקול זהescribes שיטה בסיסית, המשלבת את שינוי הרכב שומנים בדם עם תהליך פיסיולוגי.

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 &amp;deg;C and warm to 37 &amp;deg;C prior to use</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Keep frozen at -20 &amp;deg;C and thaw before adding to DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Used to suplement DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well culture dish</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cut down to size needed for TLC tank</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td>Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards</td></tr><tr><td>6-Well plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures down to 0.1 mg</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Iodine chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td></tr><tr><td>Glass bottom confocal dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtained from Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift from Arturo Casadevall&#039;s Lab concentration is 1.98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 &amp;deg;C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

Cryptococcosis הוא זיהום מסכן חיים הנגרם על ידי פטריות פתוגניים של הסוג קריפטוקוקוס. זיהום מתרחש על שאיפה של נבגים, אשר מסוגלים לשכפל בריאה העמוקה. Phagocytosis של קריפטוקוקוס על ידי מקרופאגים הוא אחת הדרכים שהמחלה יכולה להתפשט למערכת העצבים המרכזית לגרום meningoencephalitis הקטלני. לכן, מחקר של הקשר בין קריפטוקוקוס ומקרופגים הוא חשוב להבנת ההתפתחות של הזיהום. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול צעד-אחר-צעד כדי ללמוד infectivity מקרופאג ידי ג neoformans במבחנה. השימוש בפרוטוקול זה, התפקיד של סטרולים מארח על אינטראקציות מארח הפתוגן הוא למד. ריכוזים שונים של מתיל - cyclodextrin (MCD) שמשו לרוקן את הכולסטרול מJ774A.1 שורת תאים העכברי סרקומה הרשתית כמו מקרופאג. כולסטרול הדלדול אושר ולכמת באמצעות שני מסחרי availablערכת דואר כימות כולסטרול וכרומטוגרפיה בשכבה דקה. תאי כולסטרול מדולדל הופעלו באמצעות Lipopolysacharide (LPS) ואינטרפרון גאמא (IFNγ) ונגועים בneoformans קריפטוקוקוס-opsonized נוגדן תאי H99 wild-type ביחס מפעיל ליעד של 1: 1. תאים נגועים היו במעקב אחרי 2 שעות של דגירה עם ג neoformans ומדד phagocytic חושב. כולסטרול דלדול הביא לירידה משמעותית במדד phagocytic. הפרוטוקולים שהוצגו מציעים שיטה נוחה לחקות את תחילת תהליך הזיהום בסביבת מעבדה וללמוד את התפקיד של הרכב שומנים מארח על infectivity.

כולסטרול דלדול ניתוח של supernatant שמורות בשלב 1.3 של הפרוטוקול על ידי ביצוע הוראות היצרן בערכת הכולסטרול Assay Amplex האדומה מניב ריכוז גבוה של כולסטרול במדגם MβCD טופל בהשוואה לשליטת 1x PBS. בהתאם לסוג תא ודלדול כולסטרול ריכוז MβCD משמש עשוי להש?...

Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K Views.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

Video: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

חזותי exocytosis ללא ממס של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em&gt; מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through fluorescence measurements of pH-sensitive dye.

השפעת אספירין ואיבופרופן על היכולת הפאגוציטית של מקרופאגים

1. Safety considerations

	Personnel should use personal protective equipment (PPE).
	Handle the pathogen and macrophages in a Class II Biological safety ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Effect of Aspirin and Ibuprofen on Phagocytic Ability of Macrophages

Begin with a culture of the murine macrophage cell line, grown in complete RPMI 1640 medium, as described in the text protocol.
Additionally, prepare a culture of Cryptococcus neoformans resuspended in PBS to the desired concentration, as mentioned in the text protocol.&#160;
To stain the cryptococcal cells with the phagocytosis stain, dispense 999 microliters of the cells into a microcentrifuge tube. Add 1 microliter of the stain to the tube. Incubate the cells for 1 hour at room temperature, in the dark, with slow agitation.
After incubation, wash the cells by first centrifugation. Then, discard the supernatant. Resuspend the cells with PBS and repeat the washing step two additional times.
Dispense 100 microliters of the Cryptococcus neoformans cell suspension into the wells of the 96-well plate containing the cultured macrophages.
To study the effect of the test drugs on macrophage phagocytosis, dispense 100 microliters of the desired test drug into appropriate wells of the 96-well plate as described in the text protocol.
Incubate the plate in a carbon dioxide incubator for 2 to 6 hours. At the end of the incubation, measure the fluorescence from the phagocytic stain.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video