Name: macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
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この作品は、NIHの助成金MDPにAI56168、AI71142、AI87541及びAI100631によってサポートされていました。マウリツィオ·デルポエタは、感染症にバロウズウェルカム調査官である。

MβCDとJ774A.1細胞の1コレステロール枯渇<ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5 J774A.1マクロファージ様細胞を播種ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）。 37℃でインキュベートし、5％CO 2 O / N。 </li><li>細胞単層から培地を除去し、ろ過またはオートクレーブ処理された1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄。 </li><li>コントロールとして、所望の濃度（10 mM以下PBS中30 mM）のまたは1x PBSでMβCD溶液200μlを加え、振とうしながら37℃で30分間インキュベートする。手順の直後に市販のキットを用いて定量分析をRTで上清と予備を削除します。 </li><li> 1X PBSまたは無血清DMEMで細胞を2〜3回洗浄しpipettiによる感染または溶解細胞を続行薄層クロマトグラフィーまたはキットを用いた分析のために、脱イオンH 2 Oで2〜3回ngの。 注：以下はコレステロール枯渇市販のコレステロール定量キットを使用することができる。詳細については、資料のセクションを参照してください。書かれたように、メーカーの指示に従ってください。 </li></ol>薄層クロマトグラフィー（TLC）により、コレステロール含有量の2観測<ol><li>石油エーテルの溶液で1回、アセトンで二回TLC槽を洗浄：ジエチルエーテル：酢酸（65：30：1容量）。 （体積で1：65：30）溶液及び/ NがOを残す酢酸：ジエチルエーテル：石油エーテルでタンクを飽和させる。 注：有機溶媒が常に蒸気の吸入を防ぐために、ヒュームフードの下で使用されるべきである。手袋と白衣を常に着用する。酢酸は強酸であると注意して使用する必要があります。 </li><li>無菌のバイオセーフティキャビネットでは、6ウェルCE上ウェル当たり10 6 J774A.1マクロファージ様細胞を播種10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM暖かいの5mlの容量でllの培養プレート。 37℃、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 </li><li> 、1.4より大きな井戸サイズを考慮するために適用可能な200μlのための1ミリリットルを代入する - 手順1.2に従うことによってコレステロールのマクロファージを枯渇。 </li><li> 、各ウェルにトリプシン-EDTAの500μl加え、37℃で3分間インキュベートし、静かにセルスクレーパーで細胞をこすり。 </li><li>微量遠心管に移し、10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM暖かいの追加の500μlを添加する。 </li><li> 300×gで5分間細胞をスピンし、上清を除去します。 </li><li>細胞ペレットに10％FBSおよび1％P / Sを補足した暖かいDMEMの追加の500μLを加え、ピペッティングにより慎重に懸濁します。 </li><li>細胞の10μlのを削除し、血球計数器上で細胞を数える。各試料からの細胞濃度を正規化し、ガラス管に等しい数の細胞を加える。 注：このステップでは、1月より濃縮された最終的な脂質抽出物を得るために、同一の処置群からの細胞を結合するために選択する。 </li><li> RTで5分間300×gで遠心細胞および培地を除去します。 </li><li>メタノールと渦の2ミリリットルを追加します。その後、クロロホルムと渦の1ミリリットルを追加します。単相で確認して溶液を作製した位相状態を確認してください。 注意：チューブを4℃CO / Nで保存することができる。 </li><li> RTで10分間1700×gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移す</li><li>のdH 2 Oの1ミリリットルが続くクロロホルムの追加の1ミリリットルを追加します。 30秒間ボルテックス二回。 RTで5分間1700×gで遠心分離する。 </li><li>敏感なバランスにガラス管を秤量し、既知の重量のガラス管に下相を転送するために、ガラスパスツールピペットを使用する。 </li><li>乾燥（約2時間）まで、遠心エバポレーターで脂質をドライダウン。乾燥した脂質とチューブを秤量し、乾燥脂質重量を計算する。 注：ドライ脂質はTLCを実行する準備ができるまで-20℃に保存することができます。 </li><li> （ - 50μlの通常20）及びシリカTLCプレート上で希釈した脂質の負荷20μlの脂質の濃度を正常化するのに十分なクロロホルム中で乾燥した脂質を希釈する。標準としてクロロホルム20μlの希釈されたコレステロールの負荷20μgの。 </li><li>飽和TLCタンクに乾燥したTLCプレートを追加し、プレートエッジの前に1センチメートルまで移行する溶剤が可能。タンクからTLCプレートを取り外し、それは約5分を乾燥させます。 </li><li>移行を確認するために、ヨウ素蒸気タンク内に配置することによって、脂質​​を可視化する。取り外し、スポットが約10のためにフェードすることができます - フードの下で15分。 注：ヨウ素は、吸入の危険性がある。ヒュームフードの下には、必ず使用してください。 </li><li>脱イオンH 2 Oの60ミリリットル、硫酸の4ミリリットル、および塩化マンガンの630 mgのメタノール60mlを組み合わせることにより、中性脂質染色のためのソリューションを準備します。 </li><li>注意深く、ゆっくりとトレイの中性脂質染色溶液にTLCプレートを浸し、シリカリットルを脱却することなく除去するAyerの。 NOTE：中性脂質染色溶液を数回再使用することができるので、それは、トレイから取り出すことができ、後で使用するためにボトルに戻した。 </li><li>すべての気泡が消失するまでプレートを室温でボンネットの下に乾燥することができます。所望の色に160℃、char型に設定したヒートブロック上にTLCプレートを熱し。 注：このようなビジョンワークスLSとしてデンシプログラムは、脂質サンプルを比較するために炭化したバンドを定量することができる。 </li></ol> C.とマクロファージの3感染ネオフォルマンス （H99） <ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、DMEM200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5種マクロファージ様細胞を、10％FBSおよび1％P / Sを補充した。 37℃、5％CO 2、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 注：感染は、ガラスで行うことができますが簡単に画像化のための共焦点料理を底。すべての量は同じまま。 </li><li> C.の文化を育てるネオフォルマンス （H99）打たプレートから得られた1コロニーをYNBの10ミリリットルを接種し、振盪しながら30℃でO / Nそれをインキュベートすることによって。 </li><li> C.を洗うとカウントネオフォルマンス （H99）細胞。 <ol><li>遠心機C. 4℃で10分間、1700×gでネオホルマンス O / N培養物。 </li><li>メディアを取り外し、廃棄します。 1×PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄。 4℃で10分間1700×gで遠心し。 </li><li> PBSを除去し、フィルター1×5mlのPBSで洗浄する。 4℃で10分間1700×gで遠心し。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li> PBSを除去し、1×PBS 5mlに懸濁します。 </li><li>洗浄した文化の500希釈：1を取得するためにPBSで段階希釈を行います。 <ol><li> 1:10希釈を得るために、1×PBSの900μlに元のサンプルを100μlを追加。 </li><li> 1：100希釈を得るために、1×PBS900μlの1:10希釈した試料を100μlを追加。 </li><li> 500 diluti：1を得るために、1×PBSの800μlに100希釈した試料：1の200μlのを追加します。上の</li></ol></li><li> 110μlのテイク：500希釈し、細胞数を計算するために血球計数器を頼りにしています。 </li></ol></li><li>マクロファージを活性化し、Cをオプソニン化するための作業溶液を準備ネオフォルマンス。 <ol><li> 990μlに10μlのを追加することによって、ストック溶液からのLPSおよびIFNγ100X希釈する。 NOTE：LPS及びIFNγは貪食取り込みを増強するために使用されているが、食作用のために必要とされない。マクロファージの殺菌活性に関心がある場合は、感染前に振とうしながら37℃で活性化O / Nを行う。 </li><li>サンプルあたり希釈されたLPSの7.5μL、希釈されたIFNγの1.25μL、GXM抗体の1.25μLとCのボリュームを組み合わせる1.25×10 5個の細胞を与えネオフォルマンス文化 。 10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEMを有するサンプルの数を乗じた250μlの最大容積をもたらす。 </li><li>振とうしながら37℃で20分間この溶液をボルテックスし、インキュベートする。 注意：コレステロール枯渇は、（1.2ステップ - 1.4）オプソニン化工程と同時に行うことができる。オプソニン化細胞が最適にステップ3.4.3のインキュベーション後にはもう20分以上使用されるべきであるように、事前のワーキング溶液を組み合わせることにマクロファージを扱うようにしてくださいませ。 </li></ol></li><li>マクロファージに感染する<ol><li>ウォッシュマクロファージ回無血清DMEMとし、オプソニン化C.200μlのを追加ネオフォルマンスを各ウェルに作業溶液。 </li><li> 37℃で2時間インキュベートする。 </li></ol></li><li>修正し、ステイン細胞<ol><li>メディアを取り出し、DMEMで細胞を2回洗浄する。 </li><li>空気は、10分間、細胞単層を乾燥させ、細胞を固定し、氷冷メタノールの200μlを添加する。 </li><li> RTで15分間インキュベートし、残りのメタノールを除去。 </li><li> 10倍ギムザ200μlを加え、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>オフキャップを脱イオン水とドライO / Nで3回 - 2を洗ってください。 注：イメージングは​​次の日に行わまたは週のfollowiまで可能NG染色。 </li></ol></li><li>視覚化し、カウント<ol><li>顕微鏡を使用して、データポイントあたり300個の細胞をカウントし（同じ治療回数ウェル当たり150の2がある場合）、感染したマクロファージおよび貪食さクリプトコッカス細胞の数の数に注意。 注：でも、データポイントの利用ごとに条件あたり2プレートをサンプリング確保するために、プレート当たり3の非重複領域を選択して、面積当たり50細胞を数える。 </li><li> C.の平均数によって、感染マクロファージの割合を乗じることによって食作用指数を計算マクロファージあたりのネオフォルマンス 。 1×PBSの割合がコントロールを扱うように値を発現することにより貪食インデックスを正規化する。いくつかの試験は、食作用指数の傾向を決定するために、平均値および平均値の標準偏差を計算した後。有意性を決定するためにスチューデントt検定を使用する。 </li><li> 1,000倍または400倍の倍率での細胞の顕微鏡写真を取る。 </li></ol></li></ol> 4.トリパンブルーアッセイ<ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ最小必須培地（DMEM）5mlを、1％ペニシリン/ストレプトマイシンの容量で6ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 6個のマクロファージ様細胞を播種。 37℃、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 </li><li>より大きな井戸サイズを考慮するために適用可能な200μlのための2ミリリットルを代入する1.4 - 手順1.2に従うことによってコレステロールのマクロファージを枯渇。 注：1×PBSで処理したコントロールだけでなく、以前の任意の治療に削られるコントロールを含めるようにしてください。 </li><li>各ウェルに1×PBS500μlのを加え、穏やかにセルスクレーパーで細胞をこすり。微量遠心チューブに移し、軽くピペッティングして細胞を一時停止。 </li><li> 4％のトリパンブルーの1μlの細胞や汚れの10μlのを削除します。 </li><li>血球計数器で細胞をカウントし、以下の式を使用して実行可能性を計算する：％の生存率= [1 - （ブルー細胞/全細胞）]未処理だったコントロールへ×100ノーマライズ値。いくつかの試験では、生存率の傾向を決定するために、平均値と標準偏差を計算した後。有意性を決定するためにスチューデントt検定を使用する。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

哺乳動物細胞をプレーティングし、C.オプソニン化するとき、このプロトコルでの作業では、正確な細胞数を得ることが重要であるネオフォルマンス細胞 。これは試行間の変動を最小限に抑え、正確な1を確実に：研究を通してエフェクター比に1ターゲットを。これは、手順の間にRTで休んでオプソニン化酵母細胞または処理されたマクロファージ細胞を防ぐために、コレステロ...

食作用は、細胞外のエンティティは、宿主細胞によって内在化されるプロセスである。これは、病原体に対して防御する免疫系の武器庫で重要な武器ですが、プロセスは、多くの場合、内在化および体1全体に拡散を可能にするために、病原体によって打倒することもできる。食作用は、宿主細胞の細胞骨格の再編成を経由して添付ファイルや飲み込みにつながるいくつかのシグナル伝達事象によって媒介される。 「プロフェッショナル」食細胞が病原体を巻き込むとファゴソーム2を形成し、添付ファイルや葉状仮足の形成のために知らせるために侵入病原体の表面にオプソニンを認識して結合することができる。いわゆる「プロ」食細胞の中では、マクロファージである。マクロファージは、ほとんどの、探し出しおよび疾患を引き起こす物質を排除し、損傷組織を修復し、炎症を媒介含む保護機能を遂行高度に特殊化した細胞である食作用1,2のプロセスを介してこれらの。 クリプトコックス·ネオフォルマンスクリプトコッカスとして知られている重大な疾患を引き起こす病原性酵母の種である。 クリプトコッカス胞子はホストによって吸入され、通常は無症候性である肺感染症につながるされている。これは、露光が極めて一般的であると考えられている。ブロンクス·レバノン病院センターの小児伝染病から61子どものサンプルクリニックは、非感染し、感染大人3すべての調査対象者は、クリプトコッカス多糖類glucuronoxylomannanと他の研究に対する抗体を持っていたが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の両方で有病率を示していることがわかった4。肺胞マクロファージは、肺感染への応答の最初の行であり、ほとんどの場合、成功して病原体をオフにします。しかし、免疫無防備状態の個体（ 例えば、HIVおよびAIDS患者）において酵母は、マクロファージ内で生存することがある。これらの中で例は、マクロファージが病原体の複製のためのニッチとしての役割を果たすことができると、疾患を5致命的になり、中枢神経系（CNS）への普及を容易にすることができる- 8。 11 -それは、マクロファージはあっても「トロイの木馬」モデル3,9を経由して、血液脳関門を通過するために酵母を支援し、髄膜に直接酵母を配信することができると考えられている。したがって、食作用のプ​​ロセス、特にクリプトコッカス感染において、それに影響を与える要因を理解することが重要である。 15 -他の病原体システムでの以前の研究は、食作用12でプレーする重要な役割を持つとコレステロールによって形成されたコレステロールと脂質ラフトを指す。コレステロールは、哺乳動物細胞中で最も豊富な脂質種であり、25を含む-哺乳動物の細胞膜16の50％。これは、BIOPの調節に役割を果たすことが見出されている彼らの剛性17を変更することにより、膜のhysical性質。コレステロールおよびスフィンゴ脂質は一緒に脂質ラフトとして知られている膜内の脂質マイクロドメインを形成する。 18 -脂質ラフトは、カベオラの形成、ならびに16シグナリングの特定の種類の単離されたドメインを提供することに関与することが見出されている。サイズが小さいために、それは、生体内で脂質ラフトを研究することは困難である。脂質ラフトの役割を研究するための1つの有用な方法は、それらの成分を変化させることである。メチルβシクロデキストリン（MβCD）は、哺乳動物の膜からコレステロールを枯渇させることが見出されており、一般的に脂質ラフト18の役割を研究するために使用される化合物である。 このプロトコルでは、宿主細胞膜からのコレステロール枯渇およびCを貪食する宿主細胞の能力に枯渇の影響を定量化する方法を提示in vitroでのネオフォルマンス 。この手順は、細胞培養物を利用するtechniq感染のモデルとしての細胞株（J774A.1）のような不死化マクロファージ上のUE。コレステロール枯渇は、ステロールのサイズに固有の疎水性コアを有し、かつコレステロールは、膜19の外に描画するためのシンクとして作用することができるMβCDに曝露することによって達成された。コレステロール枯渇は、市販のキットを用いて定性的に薄層クロマトグラフィー（TLC）20に続く改変ブライ-ダイアー脂質抽出を用いて定量した。 。23 -食作用は、マクロファージを活性化するためのインターフェロンγとリポ多糖のカクテルと混合したオプソニン化酵母の文化を持つ細胞株を感染させることにより測定したクリプトコッカスは glucuronoxylomannan（GXM）抗体21を使用してオプソニン化した。染色および顕微鏡実験は、食作用の程度を評価する細胞の視覚化および食作用指数の計算を可能にした。総合すると、このプロトコルD生理学的過程で脂質組成の変化を統合基本的な方法はescribes。

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 &amp;deg;C and warm to 37 &amp;deg;C prior to use</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Keep frozen at -20 &amp;deg;C and thaw before adding to DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Used to suplement DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well culture dish</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cut down to size needed for TLC tank</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td>Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards</td></tr><tr><td>6-Well plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures down to 0.1 mg</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Iodine chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td></tr><tr><td>Glass bottom confocal dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtained from Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift from Arturo Casadevall&#039;s Lab concentration is 1.98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 &amp;deg;C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

クリプトコッカス属、クリプトコッカスの病原性真菌によって引き起こされる生命を脅かす感染症である。感染は、肺深部に複製することができる胞子の吸入時に起こる。マクロファージによるクリプトコッカスの食作用は、疾患が致死髄膜脳炎を引き起こす中枢神経系に拡散することができる方法の一つである。したがって、 クリプトコッカスおよびマクロファージとの間の関連の研究では、感染の進行を理解する上で重要である。本研究ではCでマクロファージ感染性を研究するためのステップバイステップのプロトコルについて説明in vitroでのネオフォルマンス 。このプロトコルを使用して、宿主 - 病原体相互作用のホストステロールの役割が検討されている。メチルの異なる濃度 - シクロデキストリン（MCD）は、マウス細網肉腫マクロファージ様細胞株J774A.1からコレステロールを枯渇させるために使用された。コレステロール枯渇を確認し、商業的にご利用でき、両方を用いて定量した電子コレステロール定量キット、薄層クロマトグラフィー。コレステロール枯渇細胞は、リポ多糖（LPS）およびインターフェロンγ（IFNγ）を使用して活性化し、1のエフェクター対標的比での抗体-オプソニンクリプトコックス·ネオフォルマンス 、野生型H99細胞を感染させた：1。感染細胞をC.とのインキュベーションの2時間後にモニターしたネオフォルマンスおよびそれらの食作用指数を算出した。コレステロール枯渇は、食作用指数の有意な減少をもたらした。提示されたプロトコルは、実験室環境での感染過程の開始を模倣し、感染性に対するホスト脂質組成の役割を研究するための便利な方法を提供する。

コレステロール枯渇 1×PBS対照と比較してアンプレックスレッドコレステロールアッセイキットで、製造業者の指示に従って、プロトコルのステップ1.3で予約された上清の分析は、MβCD処理された試料中のコレステロール濃度の上昇をもたらす。細胞型およびMβCD濃度使用コレステロール枯渇に応じて変化してもよい。 10mMのMβCDで処理J774は、約50％の枯渇が観察された。枯渇...

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K ビュー.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

ビデオ: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

マウスのマクロファージの枯渇と再構成

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

免疫・感染学

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em&gt;クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em&gt;デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through fluorescence measurements of pH-sensitive dye.

マクロファージの食作用能力に対するアスピリンとイブプロフェンの効果

1. Safety considerations

	Personnel should use personal protective equipment (PPE).
	Handle the pathogen and macrophages in a Class II Biological safety ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

細胞免疫診断

Effect of Aspirin and Ibuprofen on Phagocytic Ability of Macrophages

Begin with a culture of the murine macrophage cell line, grown in complete RPMI 1640 medium, as described in the text protocol.
Additionally, prepare a culture of Cryptococcus neoformans resuspended in PBS to the desired concentration, as mentioned in the text protocol.&#160;
To stain the cryptococcal cells with the phagocytosis stain, dispense 999 microliters of the cells into a microcentrifuge tube. Add 1 microliter of the stain to the tube. Incubate the cells for 1 hour at room temperature, in the dark, with slow agitation.
After incubation, wash the cells by first centrifugation. Then, discard the supernatant. Resuspend the cells with PBS and repeat the washing step two additional times.
Dispense 100 microliters of the Cryptococcus neoformans cell suspension into the wells of the 96-well plate containing the cultured macrophages.
To study the effect of the test drugs on macrophage phagocytosis, dispense 100 microliters of the desired test drug into appropriate wells of the 96-well plate as described in the text protocol.
Incubate the plate in a carbon dioxide incubator for 2 to 6 hours. At the end of the incubation, measure the fluorescence from the phagocytic stain.

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響

要約

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