Name: macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
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Este trabajo fue apoyado por becas del NIH AI56168, AI71142, AI87541 y AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta es Burroughs Wellcome Investigador en Enfermedades Infecciosas.

1. El colesterol agotamiento de las células J774A.1 con MβCD <ol><li> En una cabina de bioseguridad estéril, de semillas 10 5 J774A.1 células de tipo macrófago por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en 200 l de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N. </li><li> Retire el medio de la monocapa de células y se lavan las células dos veces con fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) que ha sido filtrada o tratada en autoclave. </li><li> Añadir 200 l de solución de MβCD a la concentración deseada (10 mM o 30 mM en PBS) o 1x PBS como control y se incuba durante 30 min a 37 ° C con agitación. Eliminar el sobrenadante y reserva a RT para el análisis cuantitativo con el kit comercialmente disponible inmediatamente después del procedimiento. </li><li> Lavar las células dos o tres veces con PBS 1x o DMEM sin suero y continuar con infección o lisar células por pipetting de dos a tres veces con H2O desionizada para el análisis con cromatografía de capa fina o con un kit. NOTA: Tras el agotamiento de colesterol un kit de cuantificación de colesterol disponible comercialmente se puede utilizar. Vea la sección de materiales para los detalles. Siga las instrucciones del fabricante como está escrito. </li></ol> 2. Observación de colesterol contenido cromatografía en capa fina (TLC) <ol><li> Lavar un tanque de TLC dos veces con acetona y una vez con una solución de éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 en volumen). Saturar el tanque con el éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 en volumen) solución y dejar O / N. NOTA: Orgánica disolventes siempre se deben utilizar bajo una campana de humos para evitar la inhalación de los vapores. Guantes y bata de laboratorio deben ser usados ​​en todo momento. El ácido acético es un ácido fuerte y se debe utilizar con precaución. </li><li> En un gabinete de bioseguridad estéril, semillas 10 6 J774A.1 como los macrófagos-células por pocillo en un ce 6 pocillosll placa de cultivo en un volumen de 5 ml de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. </li><li> Agotan los macrófagos de colesterol siguiendo los pasos 1.2 a 1.4, sustituyendo 1 ml para 200 l en su caso para tener en cuenta el tamaño bien grande. </li><li> Añadir 500 l de Tripsina-EDTA a cada pocillo, se incuba durante 3 min a 37 ° C, y raspar suavemente las células con un raspador de células. </li><li> Transferir a un tubo de microcentrífuga y añadir un adicional de 500 l de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. </li><li> Girar las células durante 5 min a 300 xg y eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir un adicional de 500 l de DMEM caliente suplementado con 10% de FBS y 1% P / S al sedimento celular y resuspender cuidadosamente por pipeteando arriba y abajo. </li><li> Retire 10 l de células y contar las células en un hemocitómetro. Normalizar las concentraciones de células de cada muestra y añadir un número igual de células a tubos de vidrio. NOTA: En este paso, se puedeelegir combinar las células de los mismos grupos de tratamiento para obtener un extracto final de lípidos más concentrada. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar los medios de comunicación. </li><li> Añadir 2 ml de metanol y vórtice. A continuación, añadir 1 ml de cloroformo y agitar. Compruebe el estado de fase para asegurarse de que la solución en monofásico. NOTA: Los tubos se puede almacenar a 4 ° CO / N. </li><li> Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a TA y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo </li><li> Añadir un adicional de 1 ml de cloroformo, seguido de 1 ml de dH 2 O. Vortex dos veces durante 30 segundos. Centrifugar a 1700 xg durante 5 min a TA. </li><li> Pesar un tubo de vidrio en un equilibrio sensible y utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir la fase inferior en el tubo de vidrio de peso conocido. </li><li> Seque los lípidos en un evaporador centrífugo hasta que se seque (aproximadamente 2 horas). Pesar tubo con lípidos secos y calcular el peso de lípido seco. NOTA: los lípidos secos se puede almacenar en -20 ° C hasta que esté listo para realizar TLC. </li><li> Diluir lípidos secos en suficiente cloroformo para normalizar la concentración de lípido (normalmente 20 - 50 l) y la carga de 20 l de la lípido diluido en una placa de TLC de sílice. Cargar 20 g de colesterol diluido en 20 l de cloroformo como un estándar. </li><li> Añadir placa de TLC se secó al tanque de TLC saturado y permitir disolvente para migrar hasta 1 cm antes de borde de la placa. Retire la placa de TLC en el tanque y deje que se seque unos 5 min. </li><li> Visualice los lípidos mediante la colocación de un tanque de vapor de yodo para comprobar la migración. Retirar y permiten manchas a desaparecer durante unos 10-15 min bajo el capó. NOTA: El yodo es un riesgo de inhalación. Utilice siempre bajo una campana de humos. </li><li> Preparar una solución para la tinción de lípidos neutros mediante la combinación de 60 ml de metanol con 60 ml de H2O desionizada, 4 ml de ácido sulfúrico, y 630 mg de cloruro de manganeso. </li><li> Con cuidado y lentamente sumergir la placa de TLC en la solución de tinción de lípidos neutros en una bandeja y quitar sin desprendimiento de la l de síliceayer. NOTA: La solución de tinción lípido neutro puede ser reutilizado varias veces y por lo que puede ser recuperada de la bandeja y se coloca de nuevo en una botella para su uso posterior. </li><li> Deje que la placa se seque bajo el capó a TA hasta que todas las burbujas ha desaparecido. Calentar la placa de TLC en un conjunto de bloque de calor a 160 ° C y Char al color deseado. NOTA: Un programa de densitometría como Vision Works LS puede utilizarse para cuantificar las bandas carbonizados para comparar muestras de lípidos. </li></ol> 3. La infección de macrófagos con C. neoformans (H99) <ol><li> En una cabina de bioseguridad estéril, semilla de 10 células 5 macrófagos como por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en 200 l de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2, 5% de CO 2 O / N. NOTA: La infección también se puede hacer de fondo de cristal platos confocal para formación de imágenes más fácil; todas las cantidades siguen siendo los mismos. </li><li> Cultivar una cultura de C. neoformans (H99)mediante la inoculación de 10 ml de YNB con una colonia obtenida a partir de una placa golpeado e incubando que O / N a 30 ° C con agitación. </li><li> Lave y contar C. neoformans células (H99). <ol><li> Centrífuga C. cultura neoformans O / N a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Retire el medio y desechar. Lavar las células con 5 ml de PBS 1x. Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Retirar PBS y se lava con 5 ml de PBS 1x filtrada. Centrifugar a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este paso 2 veces más. </li><li> Retirar PBS y resuspender en 5 ml de PBS 1x. </li><li> Hacer una dilución en serie en PBS para obtener una dilución 1: 500 de la cultura lavado. <ol><li> Añadir 100 l de la muestra original para 900 l de 1x PBS para obtener una dilución 1:10. </li><li> Añadir 100 l de muestra diluida 1:10 a 900 l de 1x PBS para obtener una dilución 1: 100. </li><li> Añadir 200 l de la 1: 100 muestra diluida a 800 l de PBS 1x para obtener un 1: diluti 500en </li></ol></li><li> Tomar 10 l de 1: 500 dilución y contar con hemocitómetro para calcular el número de células. </li></ol></li><li> Preparar la solución de trabajo para la activación de los macrófagos y opsonizantes C. neoformans. <ol><li> Diluir LPS y IFN 100x de soluciones madre añadiendo 10 l hasta 990 l. NOTA: LPS y IFN se utilizan para mejorar la absorción fagocítica pero no son necesarios para la fagocitosis. Si hay un interés en la actividad fungicida de los macrófagos, realizar la activación O / N a 37 ° C con agitación antes de la infección. </li><li> Por muestra combinar 7,5 l de LPS diluidos, 1,25 l de IFN diluido, 1,25 l de anticuerpo GXM y el volumen de la C. cultura neoformans que da 1,25 x 10 5 células. Llevar el volumen hasta 250 l multiplicado por el número de muestras con DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% P / S. </li><li> Vortex e incubar la solución durante 20 min a 37 ° C con agitación. NOTA:Agotamiento de colesterol (pasos 1.2 hasta 1.4) se puede hacer simultáneamente con la etapa de opsonización. Asegúrese de tratar los macrófagos antes de la combinación de la solución de trabajo, ya que las células opsonizadas óptimamente se deben utilizar no más de 20 minutos después de la incubación paso 3.4.3. </li></ol></li><li> Infectar a los macrófagos <ol><li> Macrófagos Lavar dos veces con DMEM libre de suero y añadir 200 l de opsonizado C. neoformans solución de trabajo a cada pocillo. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Fijar y teñir las células <ol><li> Retire el medio y lavar las células 2 veces con DMEM. </li><li> Aire seco en la monocapa de células durante 10 min y añadir 200 l de metanol enfriado con hielo para fijar las células. </li><li> Incubar durante 15 min a TA y eliminar cualquier metanol restante. </li><li> Añadir 200 l de 10x Giemsa y se incuba durante 5 min a TA. </li><li> Lave 2 - 3 veces con agua desionizada y se seca O / N con la gorra. NOTA: Imaging se puede hacer al día siguiente o hasta una semana followitinción ng. </li></ol></li><li> Visualizar y Conde <ol><li> Usando un microscopio, contar 300 células por punto de datos (si hay 2 de el mismo trato contar 150 por pocillo) y anote el número de macrófagos infectados y el número de células Cryptococcus envueltos. NOTA: Para garantizar incluso el muestreo por uso punto de datos 2 placas por condición, elija 3 áreas que no se solapan por placa y recuento de 50 células por área. </li><li> Calcular el índice fagocítico multiplicando el porcentaje de macrófagos infectados por el número medio de C. neoformans por macrófago. Normalizar índice fagocítico expresando los valores como porcentaje de la PBS 1x tratada control. Después de varios ensayos calcular el valor medio y la desviación estándar de la media para determinar las tendencias en el índice de fagocitosis. Utilice estudiante t-test para determinar la significación. </li><li> Tome micrografías de células en 1.000X o ampliación de 400X. </li></ol></li></ol> 4. Ensayo de azul de tripano <ol><li> En una cabina de bioseguridad estéril, las semillas 10 6 células de tipo macrófago por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos en un volumen de 5 ml de medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina / estreptomicina . Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. </li><li> Agotan los macrófagos de colesterol siguiendo los pasos 1.2 a 1.4 sustituyendo 2 ml para 200 l en su caso para tener en cuenta el tamaño bien grande. NOTA: Asegúrese de incluir un control tratado con 1x PBS, así como un control que se raspa antes de cualquier tratamiento. </li><li> Añadir 500 l de 1x PBS a cada pocillo y raspar suavemente las células con un raspador de células. Traslado en un tubo de microcentrífuga y suspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Retire 10 l de células y tinción con 1 l de 4% de azul de tripano. </li><li> Contar las células en un hemocitómetro y la viabilidad calcular utilizando la siguiente ecuación:% de viabilidad = [1 - (células azules / células totales)]x 100. Normalizar los valores al control que no fue tratada. Después de varios ensayos calcular el valor medio y la desviación estándar para determinar las tendencias en la viabilidad. Utilice estudiante t-test para determinar la significación. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

En el trabajo con este protocolo es importante para obtener recuentos de células precisos cuando chapado en células de mamíferos y opsonizantes C. células neoformans. Esto minimiza la variación entre los ensayos y asegura una precisa 1: 1 de destino para la proporción de efector durante todo el estudio. También es fundamental para coordinar la temporización de la depleción de colesterol y para prevenir la infección las células de levadura o células opsonizadas macrófagos tratados de reposo...

La fagocitosis es un proceso por el cual las entidades extracelulares son internalizados por las células huésped. Es un arma clave en el arsenal del sistema inmune para defenderse contra agentes patógenos, pero el proceso a menudo puede ser subvertido por patógenos para permitir la internalización y la difusión a través del cuerpo 1. La fagocitosis está mediada por varios eventos de señalización que resultan en la unión y la inmersión a través de reordenamientos de citoesqueleto de la célula huésped. Fagocitos &quot;profesional&quot; son capaces de reconocer y unirse a opsoninas en la superficie del patógeno invasor a la señal para la unión y la formación de lamelipodios, que sobresalgan del patógeno y formar un fagosoma 2. Entre los llamados fagocitos &quot;profesionales&quot; son los macrófagos. Los macrófagos son células altamente especializadas que realizan funciones de protección que incluyen la búsqueda y eliminación de agentes causantes de enfermedades, la reparación de los tejidos dañados, y la mediación de la inflamación, la mayoría deéstos a través del proceso de la fagocitosis 1,2. Cryptococcus neoformans es una especie de levadura patógena que causa una enfermedad grave conocida como criptococosis. Cryptococcus esporas son inhaladas por el anfitrión y dan lugar a una infección pulmonar que suele ser asintomática. Se cree que la exposición es muy frecuente; una muestra de 61 niños de las Enfermedades Infecciosas Pediátricas Clínica en el Hospital Centro de Bronx-Lebanon encontró que todos los encuestados tenían anticuerpos contra el polisacárido glucuronoxylomanan criptocócica y otros estudios han demostrado la prevalencia tanto en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) no infectado y adultos infectados 3, 4. Los macrófagos alveolares son la primera línea de la respuesta a la infección pulmonar y en la mayoría de los casos con éxito claro el patógeno. Sin embargo, en individuos inmunodeprimidos (pacientes por ejemplo, VIH y SIDA), la levadura es capaz de sobrevivir dentro de los macrófagos. En estosde los casos, los macrófagos pueden servir como un nicho para la replicación del patógeno y pueden facilitar su difusión en el sistema nervioso central (CNS), donde la enfermedad se vuelve mortal 5-8. Se cree que los macrófagos pueden incluso ofrecer la levadura directamente en las meninges, ayudando a la levadura para cruzar la barrera de sangre del cerebro a través del modelo &quot;caballo de Troya&quot; 3,9 - 11. Por lo tanto, es importante entender el proceso de fagocitosis y los factores que la afectan, especialmente en infecciones por criptococos. El trabajo previo en otros sistemas de patógenos apuntan a colesterol y lípidos balsas formadas por colesterol como teniendo un papel importante que desempeñar en la fagocitosis 12-15. El colesterol es la especie de lípidos más abundantes en las células de mamífero y comprende 25 - 50% de la membrana de células de mamíferos 16. Se ha encontrado a desempeñar un papel en la modulación de la BIOPpropiedades ÍSICA de membranas cambiando su rigidez 17. El colesterol y esfingolípidos juntos forman microdominios lipídicos dentro de la membrana conocida como balsas lipídicas. Se ha encontrado que las balsas de lípidos estar involucrado en la formación de caveolas, así como proporcionar un dominio aislado para ciertos tipos de señalización 16-18. Debido a su pequeño tamaño, es difícil de estudiar las balsas de lípidos in vivo. Una forma útil para estudiar el papel de las balsas lipídicas es alterar sus electores. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) es un compuesto que se ha encontrado para agotar el colesterol de las membranas de mamíferos y se utiliza comúnmente para estudiar el papel de las balsas de lípidos 18. En este protocolo, se presenta un método para agotar el colesterol de las membranas de la célula huésped y cuantificar el efecto de la disminución en la capacidad de las células huésped para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimiento hace uso de cultivo celular techniqUES en un macrófago como línea celular inmortalizada (J774A.1) como un modelo para la infección. Agotamiento de colesterol se llevó a cabo por la exposición a MβCD, que tiene un núcleo hidrófobo específico para el tamaño de los esteroles y es capaz de actuar como un sumidero para el colesterol para dibujar hacia fuera de la membrana 19. Agotamiento de colesterol se midió cuantitativamente usando un kit disponible comercialmente y cualitativamente utilizando una extracción de lípidos Bligh-Dyer modificada seguido por cromatografía en capa fina (TLC) 20. . La fagocitosis se midió mediante la infección de la línea celular con un cultivo de levadura opsonizado mezclado con un cóctel de interferón-γ y lipopolisacárido para la activación de los macrófagos Cryptococcus se opsonizó utilizando un glucuronoxylomanan (GXM) de anticuerpos 21-23. Tinción y experimentos de microscopía permitido para la visualización de las células y el cálculo del índice de fagocitosis para evaluar el grado de fagocitosis. En conjunto, este protocolo dEscribes un método básico que integra la alteración de la composición de lípidos con un proceso fisiológico.

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 &amp;deg;C and warm to 37 &amp;deg;C prior to use</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Keep frozen at -20 &amp;deg;C and thaw before adding to DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Used to suplement DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well culture dish</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cut down to size needed for TLC tank</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td>Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards</td></tr><tr><td>6-Well plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures down to 0.1 mg</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Iodine chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td></tr><tr><td>Glass bottom confocal dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtained from Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift from Arturo Casadevall&#039;s Lab concentration is 1.98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 &amp;deg;C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

La criptococosis es una infección potencialmente mortal causada por hongos patógenos del género Cryptococcus. La infección se produce después de la inhalación de las esporas, que son capaces de replicar en el pulmón profundo. La fagocitosis por los macrófagos de Cryptococcus es una de las formas en que la enfermedad es capaz de propagarse en el sistema nervioso central para causar meningoencefalitis letal. Por lo tanto, el estudio de la asociación entre Cryptococcus y macrófagos es importante para entender la progresión de la infección. El presente estudio describe un protocolo de paso a paso para estudiar la infectividad de macrófagos por C. neoformans in vitro. El uso de este protocolo, se estudia el papel de los esteroles de acogida en las interacciones huésped-patógeno. Diferentes concentraciones de metil - ciclodextrina (MCD) se utilizaron para suprimir el colesterol de murino sarcoma retículo-macrófago línea celular J774A.1. El agotamiento de colesterol se confirmó y cuantificó usando tanto un dis comercialmentekit de cuantificación de colesterol e y cromatografía en capa fina. Células de colesterol empobrecido se activaron usando lipopolisacárido (LPS) y el interferón gamma (IFN) y se infectaron con Cryptococcus neoformans anticuerpos opsonizado de tipo salvaje células H99 en una relación de efector a diana de 1: 1. Las células infectadas fueron monitorizados después de 2 h de incubación con C. se calculó neoformans y su índice de fagocitosis. Agotamiento de colesterol dio lugar a una reducción significativa en el índice de fagocitosis. Los protocolos presentados ofrecen un método conveniente para imitar la iniciación del proceso de infección en un entorno de laboratorio y estudiar el papel de la composición de lípidos de acogida sobre la infectividad.

El agotamiento Colesterol Análisis del sobrenadante reservado en el paso 1.3 del protocolo, siguiendo las instrucciones del fabricante en el kit de ensayo de colesterol de Amplex Red produce una concentración elevada de colesterol en la muestra MβCD tratado en comparación con el control PBS 1x. Dependiendo del tipo de célula y el agotamiento de colesterol concentración MβCD utilizado puede variar. Para J774 tratados con 10 mM MβCD, se observó una disminución de aproximadamente el 50%....

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K vistas.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Investigación

Inmunología e Infección

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

La visualización no lítico exocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando microscopía de luz digital

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through fluorescence measurements of pH-sensitive dye.

El efecto de la aspirina y el ibuprofeno en la capacidad fagocítica de los macrófagos

1. Safety considerations

	Personnel should use personal protective equipment (PPE).
	Handle the pathogen and macrophages in a Class II Biological safety ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Effect of Aspirin and Ibuprofen on Phagocytic Ability of Macrophages

Begin with a culture of the murine macrophage cell line, grown in complete RPMI 1640 medium, as described in the text protocol.
Additionally, prepare a culture of Cryptococcus neoformans resuspended in PBS to the desired concentration, as mentioned in the text protocol.&#160;
To stain the cryptococcal cells with the phagocytosis stain, dispense 999 microliters of the cells into a microcentrifuge tube. Add 1 microliter of the stain to the tube. Incubate the cells for 1 hour at room temperature, in the dark, with slow agitation.
After incubation, wash the cells by first centrifugation. Then, discard the supernatant. Resuspend the cells with PBS and repeat the washing step two additional times.
Dispense 100 microliters of the Cryptococcus neoformans cell suspension into the wells of the 96-well plate containing the cultured macrophages.
To study the effect of the test drugs on macrophage phagocytosis, dispense 100 microliters of the desired test drug into appropriate wells of the 96-well plate as described in the text protocol.
Incubate the plate in a carbon dioxide incubator for 2 to 6 hours. At the end of the incubation, measure the fluorescence from the phagocytic stain.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de

Resumen

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