Name: macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse AI56168, AI71142, AI87541 und AI100631 zu MDP unterstützt. Maurizio del Poeta ist Burroughs Wellcome Investigator in Infectious Diseases.

1. Cholesterin Depletion von J774A.1 Zellen mit MßCD <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 J774A.1-Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 ul Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S). Bei 37 ° C und 5% CO &amp; sub2; O / N. </li><li> Medium entfernt von der Zellmonoschicht und die Zellen werden zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die gefiltert und autoklavierbar ist. </li><li> Fügen Sie 200 ul MßCD Lösung in der gewünschten Konzentration (10 mM oder 30 mM in PBS) oder 1x PBS als Kontrolle und Inkubation für 30 min bei 37 ° C unter Schütteln. Überstand entfernen und Reserve bei RT für die quantitative Analyse mit im Handel erhältlichen Kits unmittelbar nach dem Eingriff. </li><li> Mit 1x PBS oder serumfreiem DMEM Waschen Sie die Zellen zwei bis drei Mal und fahren Sie mit Infektion oder Lyse von Zellen pipetting zwei bis drei Mal mit deionisiertem H 2 O für die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie oder mit einem Kit. HINWEIS: Nach Cholesterinabbau ein kommerziell erhält Cholesterin Quantifizierung Kit kann verwendet werden. Siehe Materialien Abschnitt. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers geschrieben. </li></ol> 2. Beobachtung von Cholesterin Inhalt von Dünnschicht-Chromatographie (TLC) <ol><li> Zweimal mit Aceton und einmal zu waschen eine TLC-Tank mit einer Lösung von Petrolether: Diethylether: Essigsäure (65: 30: 1 nach Volumen). Sättigen den Tank mit dem Petrolether: Diethylether: Essigsäure (65: 30: 1 nach Volumen) Lösung und lassen O / N. HINWEIS: Organische Lösemittel sollten immer unter einer Abzugshaube verwendet werden, um das Einatmen von Dämpfen zu verhindern. Handschuhe und Labormantel müssen immer getragen werden. Essigsäure ist eine starke Säure und sollte mit Vorsicht verwendet werden. </li><li> In einer sterilen Biosicherheitswerkbank, Samen 10 6 J774A.1 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-cell Kulturplatte in einem Volumen von 5 ml warmem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. Bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Abbau Makrophagen von Cholesterin durch folgende Schritte 1,2 bis 1,4, und ersetzen Sie 1 ml für 200 &amp; mgr; gegebenenfalls für die größeren und Größe zu berücksichtigen. </li><li> Fügen Sie 500 ul Trypsin-EDTA in jedes Loch, Inkubation für 3 min bei 37 ° C, und sanft kratzen Zellen mit einem Zellschaber. </li><li> Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und zusätzlich 500 ul warmem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. </li><li> Drehen Sie die Zellen für 5 min bei 300 g und Überstand. </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 500 ul warmes DMEM mit 10% FBS und 1% P / S zu dem Zellpellet ergänzt und sorgfältig resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Entfernen Sie 10 ul der Zellen und zählen Zellen auf einem Hämozytometer. Normalisieren die Zellkonzentrationen von jeder Probe, und fügen Sie die gleiche Anzahl von Zellen auf Glasröhren. HINWEIS: Bei diesem Schritt ist, kann manwählen, um Zellen, die aus den gleichen Behandlungsgruppen zu kombinieren, um eine stärker konzentrierte endgültige Lipidextrakt zu erhalten. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei RT inkubiert und das Medium entfernt. </li><li> 2 ml Methanol und Wirbel. Dann fügen Sie 1 ml Chloroform und Wirbel. Überprüfen Sie die Phasenlage um sicherzustellen, dass die Lösung in einphasigen machen. HINWEIS: Die Schläuche können bei 4 ° CO / N gespeichert werden. </li><li> Zentrifuge bei 1.700 xg für 10 min bei RT und den Überstand in ein neues Röhrchen </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 1 ml Chloroform, gefolgt von 1 ml dH 2 O Vortex zweimal für 30 Sekunden. Zentrifuge bei 1.700 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Wiege eine Glasröhre auf einem empfindlichen Gleichgewicht und einen Glas-Pasteur-Pipette, um die Unterphase in das Glasrohr mit bekanntem Gewicht zu übertragen. </li><li> Trocknen Sie nach unten Lipiden in einer Zentrifugalverdampfer bis trocken (ca. 2 h). Wiegen Rohr mit getrockneten Lipide und berechnen Sie die trockene Lipidgewicht. HINWEIS: Dry Lipide können in -20 ° C bis zu seiner TLC führen gespeichert werden. </li><li> Verdünne getrockneten Lipide in Chloroform ausreichend, um die Konzentration von Lipid zu normalisieren (üblicherweise 20-50 ul) und der Last 20 ul der verdünnten Lipid auf eine Kieselgel-DC-Platte. Last 20 ug Cholesterin in 20 ul Chloroform als Standard verdünnt. </li><li> Fügen getrocknet DC-Platte auf den gesättigten TLC Tank und lassen Sie Lösungsmittel für die Migration von bis zu 1 cm vor der Plattenkante. Entfernen DC-Platte aus dem Tank und lassen Sie es ca. 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Visualisieren Lipide, indem in einem Joddampf Tank Migration überprüfen. Entfernen Sie und lassen Sie Flecken auf etwa 10 verblassen - 15 Minuten unter der Haube. HINWEIS: Jod ist ein Inhalationsrisiko. Verwenden Sie immer unter einer Abzugshaube. </li><li> Es wird eine Lösung für die Neutrallipid-Anfärbung durch Kombinieren von 60 ml Methanol mit 60 ml entionisiertem H 2 O, 4 ml Schwefelsäure und 630 mg Manganchlorid. </li><li> Die DC-Platte vorsichtig und langsam tauchen in das neutrale Lipid Farblösung in einer Schale und ohne Abgleitens der Kieselsäure l entfernenayer. ANMERKUNG: Das neutrale Lipid Färbelösung kann mehrere Male wiederverwendet werden, und so kann sie aus dem Fach abgerufen und in einer Flasche zur späteren Verwendung zurück gelegt. </li><li> Lassen Sie die Platte unter die Haube bei RT trocknen, bis alle Blasen verschwunden. Erhitzen Sie die DC-Platte auf einem Heizblock Satz bis 160 ° C und Saibling auf die gewünschte Farbe. HINWEIS: Eine Dichtemessung Programm wie Sehen funktioniert LS kann zur Quantifizierung der verkohlten Bands Lipidproben zu vergleichen. </li></ol> 3. Die Infektion von Makrophagen mit C. neoformans (H99) <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 &amp; mgr; l DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% P / S. Bei 37 ° C, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N. HINWEIS: Die Infektion kann auch in Glas ausgeführt werden Talsohle konfokalen Gerichte für einfachere Bild; Alle Beträge bleiben gleich. </li><li> Wachsen einer Kultur der C. neoformans (H99)durch Inokulation von 10 ml YNB mit einer Kolonie von einem geschlagen Platte erhalten und Inkubation O / N bei 30 ° C unter Schütteln. </li><li> Waschen Sie und zählen C. neoformans (H99) Zellen. <ol><li> Centrifuge C. neoformans O / N-Kultur bei 1700 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie das Medium und entsorgen. Wash-Zellen mit 5 ml 1x PBS. Zentrifuge bei 1.700 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> PBS entfernen und wäscht mit 5 ml gefiltert 1x PBS. Zentrifuge bei 1.700 × g für 10 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. </li><li> Entfernen PBS und Resuspendieren in 5 ml 1x PBS. </li><li> Stellen Sie eine serielle Verdünnung in PBS, um eine 1 zu erhalten: 500 Verdünnung der Kultur gewaschen. <ol><li> Füge 100 ul der ursprünglichen Probe zu 900 ul 1x PBS, um eine Verdünnung von 1:10 zu erhalten. </li><li> 100 l 1:10 verdünnten Probe zu 900 ul 1X PBS, um eine 1 zu erhalten: 100-Verdünnung. </li><li> Gib 200 ul der 1: 100 verdünnt Probe auf 800 &amp; mgr; l 1x PBS, um eine 1 zu erhalten: 500 dilutiauf </li></ol></li><li> Nehmen Sie 10 ul einer 1: 500-Verdünnung und zählen auf Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen zu berechnen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Arbeitslösung für die Aktivierung von Makrophagen und opsonisierenden C. neoformans. <ol><li> Verdünnen LPS und IFN 100x aus Stammlösungen durch Zugabe von 10 ul bis 990 ul. HINWEIS: LPS und IFN &amp; ggr; werden verwendet, um Phagozytose zu verbessern, sind jedoch nicht für die Phagozytose erforderlich. Wenn es ein Interesse an der fungiziden Aktivität von Makrophagen, führen Aktivierungs O / N bei 37 ° C mit Schütteln vor der Infektion. </li><li> Pro Probe kombinieren 7,5 ul verdünnt LPS, 1,25 &amp; mgr; l verdünnt IFNy, 1,25 ul GXM Antikörper und das Volumen des C. neoformans Kultur, die 1,25 x 10 5 Zellen gibt. Bringen Volumen bis zu 250 &amp; mgr; l multipliziert mit der Anzahl von Proben mit DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. </li><li> Vortex und Inkubation Lösung für 20 min bei 37 ° C unter Schütteln. HINWEIS:Cholesterinabbau (Schritte von 1,2 bis 1,4) kann gleichzeitig mit der Opsonisierung Schritt erfolgen. Achten Sie darauf, Makrophagen vor dem Kombinieren der Arbeitslösung zu behandeln, da die opsonisierte Zellen sind optimal zu nicht mehr als 20 min nach dem Schritt 3.4.3 Inkubation verwendet werden. </li></ol></li><li> Infizieren Makrophagen <ol><li> Wash Makrophagen zweimal mit serumfreiem DMEM und fügen Sie 200 ul opsonisierten C. neoformans Arbeitslösung in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren für 2 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Fix und Stain Cells <ol><li> Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 2 mal mit DMEM. </li><li> Luft trocknen die Zellmonoschicht für 10 Minuten und mit 200 ul eiskaltem Methanol, um die Zellen zu fixieren. </li><li> Inkubieren für 15 min bei RT und entfernen Sie alle verbleibenden Methanol. </li><li> Fügen Sie 200 ul von 10x Giemsa und Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> Mit VE-Wasser und trocken O / N mit Kappe aus 3 mal - Waschen 2. HINWEIS: Imaging können am nächsten Tag bis zu einer Woche followi erfolgen oder bisng-Färbung. </li></ol></li><li> Visualisieren und Graf <ol><li> Mit einem Mikroskop, zählen 300 Zellen pro Datenpunkt (bei ​​2 von der gleichen Behandlung zählen 150 pro Vertiefung), und notieren Sie die Anzahl der infizierten Makrophagen und Anzahl der verschlungen Cryptococcus Zellen. HINWEIS: Wenn Sie auch sicher, Probenahme pro Datenpunkt Einsatz 2 Platten pro Bedingung, wählen Sie 3 nicht überlappende Bereiche pro Platte und zähle 50 Zellen pro Fläche. </li><li> Berechnen phagozytischen Index, indem der Prozentsatz der infizierten Makrophagen durch die mittlere Anzahl von C neoformans pro Makrophagen. Normalisieren phagozytischen Index ausdrückt Werte als ein Prozentsatz des 1x PBS behandelten Kontroll. Nach mehreren Versuchen berechnet den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts, um Trends in phagozytischen Index zu bestimmen. Verwenden Student t-Test auf Signifikanz zu bestimmen. </li><li> Nehmen Sie Aufnahmen von Zellen bei 1,000x oder 400-facher Vergrößerung. </li></ol></li></ol> 4. Trypanblau-Assay <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 6 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-Zellkultur-Platte in einem Volumen von 5 ml Dulbecco-Minimal-Essential-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt . Bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Abbau Makrophagen von Cholesterin durch folgende Schritte 1,2-1,4 daß 2 ml für 200 &amp; mgr; gegebenenfalls für die größeren und Größe zu berücksichtigen. HINWEIS: Achten Sie darauf, eine Steuerung mit 1x PBS sowie eine Steuerung, die vor jeder Behandlung gekratzt behandelt sind. </li><li> Gib 500 ul 1x PBS in jede Vertiefung und sanft kratzen Zellen mit einem Zellschaber. Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und die Zellen zu suspendieren durch leichtes Auf- und Abpipettieren. </li><li> Entfernen Sie 10 ul der Zellen und Fleck mit 1 ul 4% Trypanblau. </li><li> Zählen von Zellen an einem Hämozytometer und berechnen die Lebensfähigkeit unter Verwendung der folgenden Gleichung:% Lebensfähigkeit = [1 - (blaue Zellen / Gesamtzellen)]x 100. Normalisieren Werte an die Steuerung, die unbehandelt war. Nach mehreren Versuchen berechnet den Mittelwert und die Standardabweichung zu Trends in der Lebensfähigkeit zu bestimmen. Verwenden Student t-Test auf Signifikanz zu bestimmen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Bei der Arbeit mit diesem Protokoll ist es wichtig, genaue Zellzählungen beim Plattieren Säugetierzellen und opsonisierenden C erhalten neoformans Zellen. Dies minimiert die Unterschiede zwischen Studien und gewährleistet eine exakte 1: 1-Ziel-Effektor-Verhältnis während der gesamten Studie. Es ist auch wichtig, um das Timing des Cholesterinabbau und Infektion zu koordinieren, um die opsonisierten Hefezellen oder behandelten Makrophagen aus ruhenden bei RT zwischen den Verfahren zu verhindern. Lan...

Phagozytose ist ein Prozess, durch den extrazellulären Instanzen durch Wirtszellen internalisiert. Es ist eine wichtige Waffe im Arsenal des Immunsystems, gegen Krankheitserreger zu verteidigen, aber der Prozess kann oft von Krankheitserregern unterlaufen werden, um für die Internalisierung und Verbreitung im ganzen Körper 1 zu ermöglichen. Die Phagozytose wird durch mehrere Signalwege, die im Anhang und Einwirkung über Umlagerungen von Zytoskelett der Wirtszelle führen vermittelt. Professional &quot;Phagocyten können sich auf der Oberfläche des eindringenden Pathogens erkennen und binden an Opsonine zur Anbringung und die Bildung der Lamellipodia, die den Krankheitserreger zu verschlingen und bilden eine phagosome 2 zu signalisieren. Unter den so genannten &quot;professionellen&quot; Fresszellen sind Makrophagen. Makrophagen sind hoch spezialisierte Zellen, die durchführen, Schutzfunktionen, die die Suche nach und Beseitigung von Krankheitserregern, die Reparatur beschädigter Gewebe und Vermittlung Entzündung, die meisten schließendiese durch den Vorgang der Phagozytose 1,2. Cryptococcus neoformans ist eine Art von pathogenen Hefe, die eine schwere Krankheit wie Kryptokokkose bekannt verursacht. Cryptococcus Sporen werden durch den Host Einatmen und führen zu einer Lungeninfektion, die in der Regel asymptomatisch ist. Es wird vermutet, dass die Exposition ist extrem weit verbreitet; eine Stichprobe von 61 Kindern aus den Pediatric Infectious Diseases Clinic am Bronx-Lebanon Hospital Center stellte fest, dass alle Befragten hatten Antikörper gegen das Cryptococcus Polysaccharid glucuronoxylomannan und andere Studien haben Prävalenz sowohl in humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten und infizierten Erwachsenen 3 gezeigt, 4. Alveolarmakrophagen sind in der ersten Zeile als Reaktion auf die Lungeninfektion und in den meisten Fällen erfolgreich klare Erregers. , Bei immungeschwächten Personen (zB HIV und AIDS-Patienten), die Hefe jedoch in der Lage, innerhalb der Makrophagen zu überleben. In diesenFällen können die Makrophagen als Nischen für die Replikation des Pathogens dienen und ihrer Weitergabe an das zentrale Nervensystem (ZNS), wobei die Krankheit tödlich 5 erleichtern - 8. Es wird vermutet, dass Makrophagen sogar die Hefe liefern direkt in die Hirnhäute und hilft, die Hefe, um die Blut-Hirnschranke über die &quot;Trojanisches Pferd&quot; Modell 3,9 überqueren - 11. Somit ist es wichtig, den Prozess der Phagozytose und die Faktoren, die es beeinflussen, insbesondere in Kryptokokkeninfektionen verstehen. Frühere Arbeiten in anderen Erreger-Systeme weisen auf Cholesterin und Lipid Rafts von Cholesterin eine wichtige Rolle bei der Phagozytose 12 spielen gebildet - 15. Cholesterin ist die am häufigsten vorkommende Lipidspezies in Säugetierzellen und umfasst 25 - 50% der Säugerzelle Membran 16. Es wurde festgestellt, um eine Rolle bei der Modulation der BioP spielenhysical Eigenschaften von Membranen durch Veränderung ihrer Steifigkeit 17. Cholesterin und Sphingolipiden bilden Lipidmikrodomänen innerhalb der Membran als Lipid Rafts bekannt. Lipidflößen gefunden worden, um die Bildung von Caveolae, sowie Bereitstellen einer isolierten Domäne für bestimmte Typen von Signalisierungs 16 beteiligt - 18. Aufgrund ihrer geringen Größe, ist es schwierig, Lipidflößen in vivo zu studieren. Ein nützlicher Weg, um die Rolle von Lipidflößen zu untersuchen ist, um ihre Bestandteile zu verändern. Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) ist eine Verbindung, die gefunden wurde, um Cholesterin aus Säugetiermembranen führen und wird häufig verwendet, um die Rolle von Lipidflößen 18 zu studieren. In diesem Protokoll wird eine Methode, um Cholesterin aus Wirtszellmembranen abzureichern und Quantifizierung der Wirkung der Abreicherung von der Fähigkeit der Wirtszellen, um C. phagozytieren neoformans in vitro. Dieses Verfahren macht Gebrauch von Zellkultur techniques auf einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie (J774A.1) als Modell für die Infektion. Cholesterinabbau durch Einwirkung MßCD, die einen hydrophoben Kern spezifisch an die Größe von Sterolen hat und in der Lage ist, um als Senke für Cholesterin, um es aus der Membran 19 zu ziehen handeln bewerkstelligt. Cholesterinabbau wurde quantitativ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits und qualitativ mit einer modifizierten Bligh-Dyer Lipidextraktion, gefolgt von Dünnschichtchromatographie (TLC) 20 gemessen. . 23 - Phagozytose wurde durch Infizieren der Zelllinie mit einer Kultur der opsonisierten Hefe mit einem Cocktail von Interferon-γ und Lipopolysaccharid zur Aktivierung der Makrophagen gemischt gemessen Cryptococcus wurde mit einem glucuronoxylomannan (GXM) Antikörper 21 opsonisierten. Färbung und Mikroskopie Experimente zur Sichtbarmachung der Zellen und zur Berechnung der phagozytische Index erlaubt, den Grad der Phagozytose zu beurteilen. Zusammengenommen dieses Protokoll describes eine grundlegende Methode, die die Veränderung der Lipid-Zusammensetzung mit einem physiologischen Prozess integriert.

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 &amp;deg;C and warm to 37 &amp;deg;C prior to use</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Keep frozen at -20 &amp;deg;C and thaw before adding to DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Used to suplement DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well culture dish</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cut down to size needed for TLC tank</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td>Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards</td></tr><tr><td>6-Well plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures down to 0.1 mg</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Iodine chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td></tr><tr><td>Glass bottom confocal dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtained from Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift from Arturo Casadevall&#039;s Lab concentration is 1.98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 &amp;deg;C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

Cryptococcosis ist eine lebensbedrohende Infektion, die von pathogenen Pilzen der Gattung Cryptococcus verursacht. Die Infektion erfolgt beim Einatmen von Sporen, die in der Lage, in die tiefe Lunge replizieren. Phagozytose von Cryptococcus durch Makrophagen ist eine der Möglichkeiten, dass die Krankheit in der Lage, in das zentrale Nervensystem verteilt, um letale Meningoenzephalitis führen. Daher ist die Lehre der Assoziation zwischen Cryptococcus und Makrophagen wichtig für das Verständnis des Fortschreitens der Infektion. Die vorliegende Studie beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll, um Makrophagen-Infektiosität von C. studieren neoformans in vitro. Mit diesem Protokoll wird die Rolle des Gastgebers Sterole auf Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht. Verschiedene Konzentrationen von Methyl - Cyclodextrin (MCD) wurden verwendet, um Cholesterin aus murinen Retikulum Sarkom Makrophagen-ähnlichen Zellinie J774A.1 abzureichern. Cholesterinabbau bestätigt und quantifiziert unter Verwendung sowohl einer handels verfügbe Cholesterinquantifizierung Kit und Dünnschicht-Chromatographie. Cholesterin verarmte Zellen wurden unter Verwendung Lipopolysacharide (LPS) und Interferon gamma (IFN &amp; gamma;) aktiviert und mit Antikörper-opsonisiertes Cryptococcus neoformans Wildtyp H99 Zellen bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 1 infiziert: 1. Infizierte Zellen wurden nach 2 h Inkubation mit C. wachten neoformans und ihre phagozytische Index wurde berechnet. Cholesterinabbau führte zu einer signifikanten Reduktion der phagozytische Index. Die vorgestellten Protokolle bieten eine bequeme Methode, um die Einleitung des Infektionsprozesses in einer Laborumgebung nachzuahmen und Studium der Rolle von Wirtslipidzusammensetzung auf die Infektiosität.

Cholesterin Depletion Analyse des Überstands in Stufe 1.3 des Protokolls durch folgende Anweisungen des Herstellers im Amplex Red Cholesterol Assay Kit vorbehalten ergibt eine erhöhte Konzentration von Cholesterin in MßCD behandelten Probe im Vergleich zu der 1x PBS-Kontrolle. Je nach Zelltyp und MßCD Konzentration verwendet Cholesterinabbau kann variieren. Für J774 mit 10 mM MßCD behandelt wurde eine Abreicherung von ca. 50% beobachtet. Depletion kann mit aus dem Überstand und Zelllysat...

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K Aufrufe.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

Serie: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through fluorescence measurements of pH-sensitive dye.

Die Wirkung von Aspirin und Ibuprofen auf die phagozytäre Fähigkeit von Makrophagen

1. Safety considerations

	Personnel should use personal protective equipment (PPE).
	Handle the pathogen and macrophages in a Class II Biological safety ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Effect of Aspirin and Ibuprofen on Phagocytic Ability of Macrophages

Begin with a culture of the murine macrophage cell line, grown in complete RPMI 1640 medium, as described in the text protocol.
Additionally, prepare a culture of Cryptococcus neoformans resuspended in PBS to the desired concentration, as mentioned in the text protocol.&#160;
To stain the cryptococcal cells with the phagocytosis stain, dispense 999 microliters of the cells into a microcentrifuge tube. Add 1 microliter of the stain to the tube. Incubate the cells for 1 hour at room temperature, in the dark, with slow agitation.
After incubation, wash the cells by first centrifugation. Then, discard the supernatant. Resuspend the cells with PBS and repeat the washing step two additional times.
Dispense 100 microliters of the Cryptococcus neoformans cell suspension into the wells of the 96-well plate containing the cultured macrophages.
To study the effect of the test drugs on macrophage phagocytosis, dispense 100 microliters of the desired test drug into appropriate wells of the 96-well plate as described in the text protocol.
Incubate the plate in a carbon dioxide incubator for 2 to 6 hours. At the end of the incubation, measure the fluorescence from the phagocytic stain.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose

Zusammenfassung

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