Gostaríamos de agradecer ao Dr. Garry Nolan pela Universidade de Stanford para fornecer a linha de células de empacotamento Phoenix GP para a produção de partículas retrovirais. Agradecemos ao Dr. Roger Tsien da Universidade da Califórnia em San Diego para a prestação de td Tomato. Gostaríamos também de agradecer ao Facility San Diego State University Citometria de Fluxo do núcleo para o seu serviço e ajuda.

1. Preparação de células de mamíferos, Produção Viral e Transdução de Código de Barras Genetic <ol><li> Placa de 2,5 x 10 6 culas aderentes em uma placa de 10 cm (ou seja, cerca de 50-60% de confluência) um dia antes da transfecção em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal de vitelo (FCS). Para uso em produção de embalagens de células-line retroviral de escolha, como Phoenix-GP (a simpática oferta do Gary Nolan, da Universidade de Stanford). NOTA: A linha celular de empacotamento expressa estavelmente proteínas gag e pol para a formação de partículas retrovirais em trans. Adicione certeza células são saudáveis ​​e aderiu à placa numa monocamada, antes da transfecção. </li><li> 24 horas mais tarde, se preparar a mistura de transfecção de ADN. <ol><li> Para 125 uL de meio DMEM isento de soro, adicionar 3 ug Vírus da Estomatite Vesicular vector glicoproteína do envelope (pCI-VSVG) e 3 ug de vector de transferência que transporta o gene da proteína fluorescente de interesse. Misture e adicione 15 mL de polietilimina (2 mg / ml). </li><li> Incubar mistura à temperatura ambiente durante 15 min e adicionar às células gota a gota. NOTA: polietilimina é adicionada à mistura homogénea de ADN como reagente de transfecção para a formação de poliplexos. A fim de se obter partículas virais contendo diferentes marcadores de proteínas fluorescentes, executar cada transfecção, de forma independente com o marcador de escolha. Lembrar que o vector de transferência retroviral é de aproximadamente 7 kb de comprimento e não podem ser embalados se acima de 10 kb. </li></ol></li><li> Incubar as placas a 37 ° C. A fim de aumentar a produção de placas virais lugar a 30 ° C ou 32 ° C em seu lugar. NOTA: 24 h pós meios de transfecção pode ser substituído com 7 ml de meio fresco, e embora isto possa melhorar a saúde das células, pode diminuir a carga viral no sobrenadante. </li><li> 48 horas após a transfecção coletar as partículas virais contendo sobrenadante e filtro com um filtro de 0,45 mM de politetrafluoretileno. Use sobrenadante viral recém coletado para a transdução. OthDe outra manter sobrenadante em aliquotas a -80 ° C e evitar a congelação-descongelação. Lembre-se que título viral provavelmente diminuirá até 50% em cada ciclo de congelamento-descongelamento. </li><li> Linha celular placa de escolha de 24 horas antes da transdução se aderente, ou imediatamente antes de transdução se não-aderente. Semente de 2,0 x 10 5-3,0 x 10 5 células aderentes (aqui Huh 7.5.1 e HEK 293T) ou 5,0 x 10 5 a 1 x 10 6 células não-aderentes (aqui SupT1) por poço numa placa de 6 poços. Nota: certifique-se para calibrar o número de células a ser semeado antes da transdução, especialmente para células aderentes, de modo que as células atingir uma confluência de cerca de 60% no tempo de transdução. </li><li> Adicionam-se 5 ug / ml de polibreno (brometo de hexadimethrene) para células semeadas e, em seguida, adicionar o sobrenadante viral previamente recolhidas para se obter cerca de 20-40% de infecção (aqui 2 ml). NOTA: O MOI ou a percentagem de infecção é mais arbitrário, como triagem vai permitir a amplificar qualquer subpopulatião de células. Obviamente, um aumento da taxa de infecção facilita e acelera o processo de amplificação. </li><li> Transduzir as células por centrifugação num rotor de cesto de suspensão a 1500 xg durante 32 min a 120 ° C. Ressuspender as células não aderentes por meio fresco antes da incubação. Para as células aderentes, substitua por fresco media 24 horas após a transdução. NOTA: Recomenda-se a selar as placas antes da centrifugação com parafilme para evitar transbordando. Para aumentar a diversidade de células geneticamente com código de barras, a transdução de células com as partículas virais portadoras diferentes proteínas fluorescentes (obtidos a partir do passo 1.4). Ao escolher marcadores fluorescentes, verifique se eles são compatíveis com a instrumentação e eles têm parâmetros fluorescentes distinguíveis. </li></ol> 2. Escolha e amplificação de células geneticamente com código de barras <ol><li> Analise as células de mamíferos transduzidas por citometria de fluxo, pelo menos, 72 horas de pós transdução para quantificar a taxa percentual de transdução. Utilize uma linha de células não transduzidas comparável como controlo negativo. NOTA: Como triagem são utilizados para purificar as populações de células de códigos de barras individuais, uma alta taxa de transdução inicial, embora não necessário, deverá acelerar o processo de amplificação. </li><li> Utilizar a célula-classificador de escolha para obter as células que expressam a proteína de interesse. <ol><li> Para o efeito, assegurar as portas estão devidamente posicionados nos canais certos. <ol><li> Para isso utiliza a linha de células naïve como controlo negativo e ajustar a tensão parâmetro / canal de modo a que a população negativa é inferior ao valor de 3 a 10 em cada eixo fluorescente. Determinar gating por fluorescência positiva como eventos que aparecem acima da do controlo negativo para cada canal fluorescente. </li></ol></li><li> Esteja ciente de que cada instrumento pode variar e a voltagem correta para determinar gating devem ser ajustados em conformidade, fazendo controles positivos e negativos imperativos em cada expconfiguração erimental. <ol><li> Para a detecção de fluorescência nesta configuração experimental usar o canal FITC (filtro 530/30 passa banda passou por um filtro de 502 passe longo) para eGFP, o canal PE (filtro 585/42 passa banda passou por um filtro de 556 passe longo) para td Tomato eo canal APC (filtro passa banda 660/20) para E2 Carmesim. NOTA: O laser de 488 nm excita eGFP e td Tomato enquanto E2 Carmesim está animado com o laser de 633 nm. </li></ol></li></ol></li><li> Ordenar em 15 ml tubos cónicos com 1 ml de 100% de FCS. NOTA: O processo de triagem de populações de células fluorescentes não é obrigatório, como se pode proceder directamente com o tipo de clones individuais (ver abaixo). Classificando populações apertados com base em fluorescência escolhido garante uma população de backup para futura seleção de clones individuais. Tenha em mente que as células individuais são, por vezes, difícil de crescer, enquanto uma grande parte da população de células pode ser facilmente congelado, descongelado e depois amplificado e, numa fase posterior. </li><li> Spem baixo as populações classificadas num rotor de centrífuga balde suspensão em 524 g a 32 ° C durante 5 min para sedimentar as células. Re-suspender em 1 ml de meio fresco, e re-placa de modo a que as células de confluência de células é inferior a 60% para permitir o crescimento e divisão para pelo menos dois dias. <ol><li> Por exemplo, as células aderentes a placa cerca de 3 x 10 5 células em 2 ml de meio por poço numa placa de 6 poços e 2 x 10 6 células em 2 ml de meio em uma placa de 6 cm. Use DMEM para células aderentes e meio RPMI para células não-aderentes (ou qualquer meio especificado, se necessário). Coloque células plaqueadas numa incubadora a 37 ° C durante vários dias para permitir a amplificação. </li></ol></li></ol> 3. Obter clonais populações de células geneticamente com código de barras em diferentes intensidades <ol><li> Obtenção de populações clonais de células originalmente transduzidas (passo 1.7) ou a partir da população classificada (passo 2.3). NOTA: Este vai assegurar um nível igual ou semelhante da expressão da proteína fluorescente entre todas as célulass dentro da população (uma população apertado com uma pequena CV na intensidade de fluorescência média de até 40%). <ol><li> Para esse efeito, as células individuais tipo em placas de 96 poços com uma unidade de deposição de células automatizado (ACDU). Definir portas para a classificação de acordo com a população de interesse. Assegurar portões são apart definir pelo menos um log-escala para obtenção de populações distintas ao escolher células em diferentes intensidades fluorescentes. Para o procedimento mostrado aqui, utilizar a mesma citometria de fluxo montagem experimental que o descrito no passo 2.2. </li></ol></li><li> Amplificar clones individuais em uma incubadora a 37 ° C durante pelo menos 2 semanas. Através do processo de amplificação analisar as células ao microscópio para assegurar que as populações em crescimento surgem a partir de células individuais, e não a partir de mais do que um. NOTA: Lembre-se que o classificador irá colocar um celular por bem, em média, e enquanto alguns poços não podem ter qualquer célula em tudo, outros podem ter mais de um. <ol><li> Para garantir que a população surge de uma célula só, ser extremamente gentil com a placa e nunca perturbar os poços por pipetagem. Observar a placa, bem pelo bem, sob o microscópio. NOTA: Enquanto as células individuais podem às vezes ser difícil de identificar, uma vez que eles começam a dividir eles serão facilmente reconhecíveis. </li><li> Esteja ciente de que muitas vezes as células &#39;moita&#39; ao longo das bordas. Descarte esses poços onde várias populações clonais podem ser observados e manter aqueles que têm uma população apertado. NOTA: É aconselhável transferir aqueles em placas maiores para a amplificação. </li></ol></li><li> Peneirar os populações clonais putativos por analisadas por citometria de fluxo. Compará-los com um controlo negativo, utilizando o mesmo dispositivo experimental de citometria de fluxo. <ol><li> Analisar apenas uma porcentagem da amostra e manter o resto como backup. Escolha as populações mais nitidamente separadas com base em intensidade média e aperto da população. Amplificá-los conforme a necessidade ou congelar stocks emmeios com 20% de glicerol a congelação a -80 ° C, durante curtos períodos de tempo ou de azoto líquido para um maior tempo. NOTA: Lembre-se que a &quot;verdadeira&quot; população clonal deve ter um padrão de fluorescência muito apertado. </li></ol></li></ol> 4. Certifique-se de Capacidades de multiplexação para High Throughput Screening (HTS) <ol><li> Combinar o número de populações clonais distintos conforme a necessidade, que pode ainda ser utilizado num formato multiplex. Escolha clones com absorção de espectros distinguíveis / emissão e / ou intensidades diferentes. Se um formato de placa de 96 poços é utilizado, o qual é adequado para HTS, sementes 50.000 células em 200 ul por poço. NOTA: Tenha em mente que o número de células é apenas uma estimativa e podem mudar com base no tipo de célula e se é aderente ou não. </li><li> Analisar a amostra utilizando a citometria de fluxo para garantir que cada uma das linhas de células independentes estabelecidas fluorescentes podem ser distinguidos um do outro. Antes da análise preparar negativoe controles de cor única para definir parâmetros e valores de compensação. Nota: definir os parâmetros para distinguir claramente as populações mistas lhes permitam ser mais utilizado em um formato multiplexado. </li></ol> 5. Adaptar linhas celulares geneticamente com código de barras para a aplicação biológica of Choice <ol><li> Transduzir linhas de células estabelecidas geneticamente códigos de barras com partículas virais que contêm os elementos de ensaio de escolha, tal como descritos aqui em Stolp et al., 2013 59. Lembrar que o ensaio de escolha deve ocupar um canal fluorescente adicional e distinguíveis e, portanto, é para ser transferido para a linha celular de código de barras apropriado. NOTA: Cada linha celular com código de barras pode suportar um ensaio diferente. </li><li> Células com código de barras tipo geneticamente fluorescentes para aqueles que contêm elementos de ensaio. NOTA: elementos de ensaio podem ser manipuladas acoplado a um marcador fluorescente ou proteína (como uma fusão ou por meio de um local de entrada de ribossoma interno) fou detecção direta por meio de transferência de western, citometria de fluxo ou microscopia. O sistema utilizado neste protocolo baseia-se na expressão de superfície de HA epitopo sozinho, ou com expressão epitopo FLAG adicional. <ol><li> Corar as populações clonais contendo o ensaio com anticorpos acoplados HA e APC-fluorescentemente. Em seguida, analisar as populações clonais com anti-FLAG e coloração com anticorpo conjugado com FITC. </li><li> Para rastrear o ensaio, analisar ou &quot;decodificar&quot; as populações no canal apropriado, onde as linhas de células geneticamente distintas códigos de barras podem ser distinguidos. Aqui, decodificar a natureza do substrato por meio da análise no canal PE td para a detecção de tomate. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui dois procedimentos bem estabelecidos foram combinados; através de tecnologia de engenharia genética retroviral e detecção de proteínas fluorescentes utilizando citometria de fluxo. Fluorescent barcoding genética à base de proteínas para a produção de linhagens de células únicas fornece uma maneira simples e robusta para aplicações multiplexados. Geração de células geneticamente modificadas com código de barras por meio da tecnologia retroviral, é inicialmente um processo demorado, mas permite a o...

Tecnologias como a espectroscopia de fluorescência, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, todos dependem de fluorescência, uma propriedade amplamente explorado em aplicações bioquímicos, biomédicos e químicos. A fluorescência, quer intrínseca ou por meio de rotulagem, tem sido explorada para a análise dos padrões de expressão de proteína, e os perfis de destino celular, as interacções proteína e funções biológicas 1-9, e através de fluorescência / Förster transferência de energia de ressonância para a detecção de interacções biomoleculares e alterações conformacionais 10-13. Uma vez que o isolamento da proteína fluorescente verde victoria de Aequorea (GFP) 14, a descoberta de proteínas fluorescentes adicionais que ocorrem naturalmente a partir de outros cnidários, em especial os corais, aumentou marcadamente o número de proteínas fluorescentes existentes com os espectros de excitação / emissão distinguíveis. Estes, em conjunto com a introdução de mutações nos seus genes 15-19, Have expandiu ainda mais as possibilidades, a obtenção de uma verdadeira paleta de proteínas fluorescentes disponíveis para os cientistas que exploram microscopia, citometria de fluxo e outras tecnologias baseadas em fluorescência para a sua pesquisa. Em paralelo, embora de forma independente, o desenvolvimento da tecnologia retroviral tem facilitado drasticamente a expressão estável de informação genética em células de mamíferos ectópica 20-23. Assim, não é surpreendente que esta tecnologia tem sido utilizado para transferir genes de proteínas fluorescentes em uma ampla série de tipos de células e tecidos ou 24-28 para a produção de animais transgénicos 29-31. Seguindo a natureza dos retrovírus, a informação genética da proteína fluorescente ectópica é introduzido no genoma da célula 32 e a célula torna-se fluorescente `para ever&#39;. Esta propriedade permitiu a localização de destino celular, ou de uma única célula de uma população de células. A célula agora fluorescente tem assim acquivermelho sua própria bioassinatura e pode ser definida como com código de barras. A sua bioassinatura único identifica-lo a partir de outras células e, muito importante, que distingue a partir de células geneticamente manipuladas para expressar as proteínas fluorescentes diferentes com espectros de absorção / emissão distinguíveis. Aplicações biológicas, tais como a localização dos fatores de reprogramação para pluripotência 33, a análise dos factores subnucleares para a elucidação da localização nucleolar 34, a construção de plasmídeos repórter fluorescentes para estudos de transcrição 35 ou com a etiqueta genética de neurónios para o estudo da arquitectura da rede neuronal 36 , são apenas quatro exemplos dos muitos que têm explorado diferentes genes da proteína fluorescente para a mesma configuração experimental. A citometria de fluxo tem sido amplamente utilizada para a análise de processos biológicos ao nível de uma única célula, tais como a expressão do gene, do ciclo celular, apoptose, e a sinalização através de fosforiloção 37-43 .A expressão estável de genes de proteínas fluorescentes em células de mamíferos tem melhorado ainda mais a utilidade de citometria de fluxo para análise das células 38,44 e interacções ligando-receptor 45. Recursos avançados têm permitido citometria de fluxo para se tornar uma metodologia amplamente utilizada para alto rendimento e alto teor de triagem 46. Apesar de o número agora se expandiu de fluorímetros e robótica tecnologias que podem sistemas de leitor de placas pares, imagens e citometria de fluxo, parece haver uma falta no projeto experimental que poderá explorar e encaixar essas capacidades tecnológicas avançadas. Metodologias rápido, confiável, simples e robustas baseadas em células são drasticamente necessária para aplicações multiplexados que melhoram ainda mais a capacidade de alto rendimento. Isto é especialmente verdadeiro no campo da descoberta de drogas onde ensaios baseados em células de engenharia em um formato multiplex pode aumentar o poder de rastreio de alto rendimento 39,47-50 </sup&gt;. Multiplexing, pois permite análises simultâneas em uma amostra, aumenta ainda mais as capacidades de alto rendimento 51-54. O código de barras genético fluorescente não só permite a multiplexagem elegante, mas também, uma vez engenharia, contorna a necessidade de protocolos que consomem tempo, reduz os custos acompanhados com anticorpos, grânulos e manchas 39,52,55, e pode reduzir o número de telas necessários para alta aplicações de transferência. Descrevemos recentemente como a tecnologia pode melhorar retroviral multiplexing através barcoding genético fluorescente para aplicações biológicas, por expressar um ensaio previamente desenvolvido para monitorar o HIV-1 atividade protease 56,57 com diferentes variantes clinicamente prevalentes 58. A metodologia é explicada de forma mais descritiva com foco em como selecionar e ampliar células geneticamente com código de barras fluorescentes e como produzir painéis de populações clonais que expressam proteínas fluorescentes distintas e / ou diferente intensit fluorescênciaies. Painéis de populações celulares distintas com base nas suas características fluorescentes melhorar as capacidades de multiplexados, que pode ainda ser exploradas em combinação com ensaios baseados em células que atacam diferentes questões biológicas. O protocolo também descreve como a engenharia de um painel de células com código de barras com um dos ensaios baseados em células previamente desenvolvidos no laboratório, como exemplo 59. Este protocolo, assim, não se destina a mostrar a tecnologia bem estabelecida retroviral / lentivírus para transferência genética, o valor de proteínas fluorescentes ou as aplicações de citometria de fluxo 60,48 mas sim para mostrar o reforço do poder combinar os três para aplicações multiplexados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Multiplexing fluorescente células geneticamente barcoded para a finalidade de aplicações biológicas só pode ser alcançado quando as populações clonais individuais foram gerados. Multiplexing é mais eficaz quando as populações códigos de barras têm características distintas fluorescentes claras com sobreposição espectral mínima. O exemplo mostrado na Figura 1 com populações clonais de células de mamífero SupT1 ilustra que as células com o código de barras mCherry e proteína fluore...

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Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.2K visualizações.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

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Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Medição Rendimento Absoluto Quantum of amostras de pó

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.