Nous tenons à remercier le Dr Garry Nolan de l&#39;Université Stanford pour fournir la lignée cellulaire d&#39;emballage Phoenix GP pour la production de particules rétrovirales. Nous remercions le Dr Roger Tsien à l&#39;Université de Californie à San Diego pour fournir td tomate. Nous tenons également à remercier le Fonds de San Diego State University cytométrie de flux de base pour leur service et de l&#39;aide.

1. Préparation de cellules de mammifères, la production virale et la transduction des codes à barres génétique <ol><li> Plate 2,5 x 10 6 cellules adhérentes dans une plaque de 10 cm (soit environ 50-60% de confluence) un jour avant la transfection dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Pour une utilisation en production rétrovirale emballage lignée cellulaire de choix tels que Phoenix-GP (une sorte cadeau de Gary Nolan, l&#39;Université de Stanford). NOTE: La lignée cellulaire d&#39;emballage exprime de manière stable Gag et Pol protéines pour la formation de particules rétrovirales en trans. Assurez-vous que les cellules sont en bonne santé et collée à la plaque dans une monocouche, avant la transfection. </li><li> 24 h plus tard, préparer le mélange d&#39;ADN de transfection. <ol><li> Pour 125 ul de DMEM sans sérum ajouter 3 ug d&#39;enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire vecteur glycoprotéine (pCI-VSVg) et 3 ug de vecteur de transfert portant le gène de la protéine fluorescente d&#39;intérêt. Mélanger et ajouter 15 pi de polyéthylimine (2 mg / ml). </li><li> Incuber mélange à la température ambiante pendant 15 minutes et ajouter aux cellules goutte à goutte. REMARQUE: polyéthylimine est ajouté au mélange homogène de l&#39;ADN en tant que réactif de transfection pour la formation de polyplexes. Afin d&#39;obtenir des particules virales portant différents marqueurs protéiques fluorescents, chaque transfection effectuer de façon indépendante avec le marqueur de sélection. Rappelez-vous que le vecteur de transfert rétroviral est d&#39;environ 7 kb de longueur et ne peut être emballé si supérieure à 10 ko. </li></ol></li><li> Incuber les plaques à 37 ° C. Afin d&#39;augmenter virales lieu de production des plaques à 30 ° C ou 32 ° C à la place. NOTE: 24 heures après les médias de transfection peuvent être remplacés par 7 ml de milieu frais, et bien que cela peut améliorer la santé cellulaire, il peut diminuer la charge virale dans le surnageant. </li><li> 48 heures après transfection recueillir les particules virales contenant surnageant et le filtre avec un filtre de 0,45 uM de polytétrafluoroéthylène. Utilisez surnageant viral fraîchement prélevé pour la transduction. OthErwise garder surnageant en aliquots à -80 ° C et éviter le gel-dégel. Rappelez-vous que le titre viral diminuera probablement jusqu&#39;à 50% à chaque cycle de congélation-décongélation. </li><li> ligne de choix 24 heures avant de la cellule de la plaque à transduction si adhérent, ou immédiatement avant transduction si non-adhérent. Graine 2,0 x 10 5 à 3,0 x 10 5 cellules adhérentes (ici Huh 7.5.1 et HEK 293T) ou 5,0 x 10 5 à 1 x 10 6 cellules non adhérentes (ici SupT1) par puits dans une plaque à 6 puits. REMARQUE: Assurez-vous de calibrer le nombre de cellules à ensemencer avant transduction, particulièrement pour les cellules adhérentes, afin d&#39;atteindre un cellules confluence d&#39;environ 60% au moment de la transduction. </li><li> Ajouter 5 ug / ml Polybrene (bromure de hexadimethrene) aux cellules ensemencées puis ajouter surnageant viral déjà recueillis pour obtenir autour de 20 à 40% d&#39;infection (ici 2 ml). NOTE: Le MOI ou le pourcentage d&#39;infection est le plus souvent arbitraires, comme le tri permettra d&#39;amplifier toute subpopulation de cellules. De toute évidence, un taux d&#39;infection élevé facilite et accélère le processus d&#39;amplification. </li><li> Transduire des cellules par centrifugation dans un rotor à godets de suspension à 1500 xg pendant 32 min à 120 ° C. Remettre en suspension les cellules non adhérentes par du milieu frais avant l&#39;incubation. Pour les cellules adhérentes, remplacer par Fresh Media 24 h post-transduction. NOTE: Il est recommandé de sceller les plaques avant la centrifugation avec du parafilm pour éviter de renverser plus. Pour augmenter la diversité des cellules génétiquement code-barres, la transduction de cellules avec des particules virales portant différentes protéines fluorescentes (obtenus à partir de l&#39;étape 1.4). Lors du choix des marqueurs fluorescents, assurez-vous qu&#39;ils sont compatibles avec l&#39;instrumentation et ils ont des paramètres fluorescents distinguables. </li></ol> 2. Sélection et amplification de cellules génétiquement BarCoded <ol><li> Analyser les cellules de mammifères transduites par cytométrie de flux au moins 72 heures après transduction pour quantifier le taux de pourcentage de transduction. Utilisez une lignée de cellules non-transduites comparables comme contrôle négatif. NOTE: Comme tri sera utilisé pour purifier des populations de cellules individuelles à code-barres, un pourcentage élevé de transduction initiale, tout pas nécessaire, devrait accélérer le processus d&#39;amplification. </li><li> Utiliser le trieur cellulaire de choix pour obtenir les cellules qui expriment la protéine d&#39;intérêt. <ol><li> A cet effet, se assurer que les portes sont correctement réglés dans les bons canaux. <ol><li> Pour ce faire utiliser la même lignée cellulaire naïve comme contrôle négatif et régler la tension paramètre / canal de sorte que la population négative, est inférieure à la valeur de 10 trois sur chaque axe fluorescent. Déterminer déclenchement pour une fluorescence positive que les événements qui apparaissent au-dessus de celui du témoin négatif pour chaque canal fluorescent. </li></ol></li><li> Soyez conscient que chaque instrument peut varier et la tension correcte pour déterminer déclenchement devrait être ajustée en conséquence, ce qui rend les contrôles positifs et négatifs impératives dans chaque experimental configuration. <ol><li> Pour la détection de fluorescence dans ce dispositif expérimental utiliser le canal FITC (530/30 du filtre passe-bande a procédé par une longue filtre 502 passe) pour eGFP, le canal de PE (585/42 filtre passe-bande a procédé par un filtre 556 long passe) pour td tomate et le canal APC (660/20 filtre passe-bande) pour E2 Crimson. NOTE: Le laser 488 nm excite eGFP et td Tomato tandis que Crimson E2 est excité par le laser 633 nm. </li></ol></li></ol></li><li> Trier dans 15 ml tubes coniques avec 1 ml de 100% de SVF. NOTE: Le processus de tri des populations de cellules fluorescentes ne est pas obligatoire que l&#39;on peut directement procéder à la sorte de clones individuels (voir ci-dessous). Tri populations stricts basés sur la fluorescence choisie garantit une population de sauvegarde pour la sélection future des clones individuels. Gardez à l&#39;esprit que les cellules individuelles sont parfois difficiles à cultiver alors qu&#39;une grande population de cellules peut être facilement congelé, puis décongelé et amplifié à un stade ultérieur. </li><li> Spvers le bas dans les populations triées dans un rotor centrifuge suspension du godet à 524 g à 32 ° C pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Remettre en suspension dans 1 ml de milieu frais, et ré-plaque afin que la confluence des cellules de la cellule est inférieur à 60% pour permettre la croissance et la division d&#39;au moins deux jours. <ol><li> Par exemple, les cellules adhérentes dans des plaques à environ 3 x 10 5 cellules dans 2 ml de milieu par puits dans une plaque à 6 puits et 2 x 10 6 cellules dans 2 ml de milieu dans une plaque de 6 cm. Utilisation du DMEM pour les cellules adhérentes et un milieu RPMI pour les cellules non adhérentes (ou ne importe quel support spécifié si nécessaire). Passer cellules étalées dans un incubateur à 37 ° C pendant plusieurs jours pour permettre l&#39;amplification. </li></ol></li></ol> 3. Obtenir des populations de cellules clonales génétiquement BarCoded à différentes intensités <ol><li> Obtenir des populations clonales de cellules transduites initialement (étape 1.7) ou de la population triée (étape 2.3). NOTE: Cela permettra d&#39;assurer un niveau égal ou similaire d&#39;expression de la protéine fluorescente entre tous la cellules au sein de la population (une population serré avec un petit CV en intensité de fluorescence moyenne de près de 40%). <ol><li> A cet effet, les cellules de tri simples dans des plaques à 96 puits avec une unité de dépôt de cellules automatisé (ACDU). Réglez portes pour le tri selon les populations d&#39;intérêt. Assurer portes sont fixés au moins une échelle logarithmique à part pour obtenir des populations distinctes au moment de choisir les cellules à différentes intensités fluorescentes. Pour la procédure indiquée ici, utiliser le même cytométrie en flux expérimental mis en place que celle décrite dans l&#39;étape 2.2. </li></ol></li><li> Amplifier clones individuels dans un incubateur à 37 ° C pendant au moins deux semaines. Par l&#39;intermédiaire du processus d&#39;amplification analyser les cellules au microscope pour se assurer que les populations croissantes proviennent de cellules individuelles et non pas à partir de plus d&#39;un. NOTE: Rappelez-vous que la trieuse placera une cellule par puits en moyenne, et même si certains puits peuvent ne pas avoir ne importe quelle cellule du tout, d&#39;autres peuvent avoir plus d&#39;un. <ol><li> Pour se assurer qu&#39;un population se pose d&#39;une cellule seule, être extrêmement doux avec la plaque et ne jamais déranger les puits par pipetage. Observer la plaque, puits par puits, sous le microscope. REMARQUE: Alors que les cellules individuelles peuvent parfois être difficiles à identifier, une fois qu&#39;ils commencent à se diviser, ils seront facilement reconnaissables. </li><li> Soyez conscient que, souvent, les cellules &#39;bouquet&#39; le long des bords. Jeter ces puits où plusieurs populations clonales peuvent être observés et de garder ceux qui ont une population serré. NOTE: Il est conseillé de transférer ceux en plaques plus grandes pour l&#39;amplification. </li></ol></li><li> Tamiser les populations clonales putatifs en les analysant par cytométrie en flux. Comparez-les à un contrôle négatif en utilisant le même dispositif expérimental cytométrie de flux. <ol><li> Analyser seulement un pourcentage de l&#39;échantillon et de garder le reste comme sauvegarde. Choisissez les populations les plus nettement distincts fondés sur l&#39;intensité moyenne et l&#39;étanchéité de la population. Amplifier au besoin ou congeler stocksdes milieux de congélation avec 20% de glycérol à -80 ° C pour de courtes périodes de temps ou de l&#39;azote liquide pour plus longtemps. NOTE: Ne oubliez pas qu&#39;un «véritable» population clonale devrait avoir un profil de fluorescence très serré. </li></ol></li></ol> 4. Assurer capacités de multiplexage pour criblage à haut débit (HTS) <ol><li> Moissonneuse autant de populations clonales distinctes selon les besoins qui peuvent être en outre utilisée dans un format multiplexé. Choisir clones avec absorption / spectres d&#39;émission distinguables et / ou des intensités différentes. Si un format de plaque à 96 puits est utilisée, qui est approprié pour HTS, ensemencer 50 000 cellules dans 200 pi par puits. NOTE: Gardez à l&#39;esprit que le nombre de cellules est seulement une estimation et peut changer en fonction du type de cellule et se il est adhérent ou non. </li><li> Analyser l&#39;échantillon en utilisant la cytométrie de flux pour assurer que chacune des lignées cellulaires indépendantes établies fluorescentes peuvent être distingués les uns des autres. Avant de préparer l&#39;analyse négativeet les contrôles de couleur unique pour définir les paramètres et les valeurs de rémunération. NOTE: Réglage des paramètres de distinguer clairement les populations mixtes leur permettra d&#39;être encore utilisé dans un format multiplexé. </li></ol> 5. Adapter lignées cellulaires génétiquement Barcoded à l&#39;application biologique de choix <ol><li> Transduction établies génétiquement code-barres lignées cellulaires avec des particules virales qui contiennent les éléments d&#39;analyse de choix, tel que décrit ici, à Stolp et al., 2013 59. Ne oubliez pas que le test de choix devrait occuper un canal supplémentaire fluorescente et distinguables et donc il doit être transféré à la ligne de code à barres cellulaire appropriée. NOTE: Chaque lignée cellulaire code-barres peut supporter un dosage différent. </li><li> Cellules à code-barres Trier génétiquement fluorescentes pour ceux qui contiennent des éléments dosage. NOTE: les éléments de dosage peuvent être conçus couplé à un marqueur fluorescent ou d&#39;une protéine (comme une fusion ou à travers un site d&#39;entrée interne du ribosome) fou la détection directe par Western blot, cytométrie en flux ou microscopie. Le système utilisé dans ce protocole repose sur l&#39;expression en surface HA epitope seul, ou avec plus d&#39;expression de l&#39;épitope FLAG. <ol><li> Colorer les populations clonales contenant le dosage avec des anticorps couplés HA et APC-fluorescence. Puis analyser les populations clonales avec anti-FLAG et la coloration d&#39;anticorps conjugué à FITC. </li><li> Pour retracer l&#39;essai, analyser ou «décoder» les populations dans le canal approprié où les lignées cellulaires génétiquement distinctes code-barres peuvent être distingués. Ici, décoder la nature du substrat en analysant dans le canal pour la détection du PE td tomate. </li></ol></li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Voici deux procédures bien établies ont été combinées; génie génétique grâce à la technologie rétroviral et la détection des protéines fluorescentes utilisant la cytométrie de flux. Fluorescent codes-barres génétique à base de protéines pour la production de lignées de cellules uniques fournit un moyen simple et robuste pour les applications multiplexées. Générer des cellules génétiquement modifiées à code-barres grâce à la technologie rétroviral, est d&#39;abord un processus de longue halei...

Les technologies telles que la spectroscopie de fluorescence, microscopie par fluorescence et la cytométrie en flux, toutes reposent sur la fluorescence, une propriété largement exploitée dans les applications biochimiques, biomédicales et chimiques. La fluorescence, si intrinsèque ou par un étiquetage, a été exploitée pour l&#39;analyse du profil des protéines d&#39;expression et profilés, le destin des cellules, les interactions entre protéines et les fonctions biologiques 9.1, et par fluorescence / Förster transfert d&#39;énergie de résonance pour la détection d&#39;interactions biomoléculaires et des changements conformationnels 10-13. Depuis l&#39;isolement de la Aequorea victoria protéine fluorescente verte (GFP) 14, la découverte des protéines fluorescentes naturels supplémentaires provenant d&#39;autres cnidaires, en particulier les coraux, a largement augmenté le nombre de protéines fluorescentes existantes avec des spectres d&#39;excitation / émission distinguer. Ceux-ci, ainsi que l&#39;introduction de mutations dans leurs gènes 15-19, VHAe élargi les possibilités, obtenir une véritable palette de protéines fluorescentes disponibles pour les scientifiques qui exploitent la microscopie, cytométrie en flux et d&#39;autres technologies basées sur la fluorescence pour leur recherche. En parallèle, bien que de façon indépendante, le développement de la technologie rétroviral a considérablement facilité l&#39;expression stable de l&#39;information génétique dans des cellules de mammifères ectopique 20-23. Il ne est donc pas surprenant que cette technologie a été utilisée pour transférer des gènes de protéines fluorescentes dans un large nombre de types cellulaires et tissus 24-28 ou pour la production d&#39;animaux transgéniques 29-31. Suite à la nature des rétrovirus, de l&#39;information génétique de la protéine fluorescente ectopique est introduit dans le génome de la cellule 32 et la cellule devient fluorescent pour ever&#39; `. Cette propriété a permis le suivi du destin cellulaire, ou d&#39;une seule cellule dans une population de cellules. La cellule a donc maintenant fluorescente acquiRED sa propre biosignature et peut être défini comme un code à barres. Son biosignature unique identifie des autres cellules, et surtout, le distingue des cellules génétiquement manipulées pour exprimer différentes protéines fluorescentes avec des spectres d&#39;absorption / émission distinguables. Applications biologiques tels que le suivi des facteurs de reprogrammation vers la pluripotence 33, l&#39;analyse des facteurs subnucléaires pour l&#39;élucidation de localisation nucléolaire 34, la construction de plasmides rapporteurs fluorescents pour les études de la transcription 35 ou l&#39;étiquetage génétique de neurones pour l&#39;étude de l&#39;architecture de réseau neuronal 36 , ne sont que quatre exemples de nombreux qui ont exploité différents gènes de la protéine fluorescente pour le même dispositif expérimental. La cytométrie en flux a été largement utilisé pour l&#39;analyse de processus biologiques au niveau de la cellule unique, comme l&#39;expression du gène, le cycle cellulaire, l&#39;apoptose et la signalisation par phosphoryleation 37-43 .Le expression stable de gènes de protéines fluorescentes dans les cellules de mammifères a encore amélioré l&#39;utilité de la cytométrie en flux pour l&#39;analyse cellulaire 38,44 et interactions ligand-récepteur 45. Renforcement des capacités ont permis cytométrie en flux pour devenir une méthode largement utilisée pour à haut débit et à haute teneur de dépistage 46. Malgré le nombre de fluoromètres maintenant élargi et technologies robotiques que les systèmes de lecteur de quelques plaques, l&#39;imagerie et peuvent cytométrie en flux, il semble y avoir un manque dans la conception expérimentale qui peut exploiter et adapter ces capacités technologiques accrues. Méthodologies à base de cellules rapides, fiables, simples et robustes sont nécessaires pour des applications radicalement multiplexés qui améliorent la capacité à haut débit. Cela est particulièrement vrai dans le domaine de la découverte de médicaments où les dosages à base de cellules ingénierie dans un format multiplexé peuvent améliorer la puissance de criblage à haut débit 39,47-50 </sup&gt;. Multiplexage, car il permet des analyses simultanées dans un échantillon, améliore encore les capacités à haut débit de 51 à 54. Codes-barres génétique fluorescent permet non seulement de multiplexage élégant, mais aussi, une fois conçu, contourne la nécessité de protocoles de longs, de réduire les coûts accompagnés avec des anticorps, des perles et des taches 39,52,55, et peut réduire le nombre d&#39;écrans nécessaires à haute les demandes de débit. Nous avons récemment décrit comment la technologie retroviral peut améliorer multiplexage par codes à barres génétique fluorescent pour des applications biologiques, en exprimant un dosage précédemment développé pour surveiller le VIH-1 l&#39;activité de protease avec différentes variantes 56,57 cliniquement 58 prévalents. La méthodologie est expliquée de manière plus descriptive en se concentrant sur la façon de sélectionner et amplifier les cellules fluorescentes génétiquement code-barres et comment produire des panneaux de populations clonales exprimant des protéines fluorescentes distinctes et / ou différente fluorescence intensits. Panneaux de populations cellulaires distinctes en fonction de leurs caractéristiques fluorescentes améliorer les capacités multiplexées, qui peut encore être exploité en combinaison avec les tests cellulaires qui abordent différentes questions biologiques. Le protocole décrit également comment concevoir un panneau de cellules portant un code à barres des tests cellulaires précédemment développés dans le laboratoire, à titre d&#39;exemple 59. Ce protocole est donc pas destinée à présenter la technologie bien établie rétroviral / lentiviral pour le transfert génétique, la valeur des protéines fluorescentes ou les applications de la cytométrie de flux 60,48, mais plutôt de démontrer l&#39;amélioration de la puissance de combiner les trois pour les applications multiplexées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Multiplexage fluorescente cellules génétiquement barres pour le but d&#39;applications biologiques ne peut être atteint une fois populations clonales individuelles ont été générés. Le multiplexage est plus efficace lorsque les populations code-barres ont des caractéristiques fluorescentes claires et distinctes avec chevauchement spectral minimal. L&#39;exemple de la figure 1 avec les populations clonales de cellules de mammifères SupT1 illustre que les cellules à code-barres avec mCherry et c...

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Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Code-barres génétique avec protéines fluorescentes pour des applications multiplexés

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.2K vues.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

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Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l&#39;imagerie optique

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Recherche

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Les études génétiques des protéines humaines réparation de l&#39;ADN utilisant de la levure comme système modèle

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marquage fluorescent du COS-7 exprimant des protéines de fusion SNAP-tag pour imagerie de cellules vivantes

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Absolute mesure du rendement quantique des échantillons de poudre

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

ADN électroporation, isolement et d&#39;imagerie de myofibres

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.