Vorremmo ringraziare il Dott Garry Nolan dalla Stanford University per la fornitura della linea cellulare di packaging Phoenix GP per la produzione di particelle retrovirali. Ringraziamo il Dr. Roger Tsien presso l&#39;Università della California a San Diego per la fornitura di td Tomato. Vorremmo anche ringraziare il Fondo San Diego State University Citometria a flusso di base per il loro servizio e aiuto.

1. Preparazione di cellule di mammifero, produzione virale e trasduzione per codici a barre genetico <ol><li> Tavola 2.5 x 10 6 cellule aderenti in un piatto di 10 cm (o intorno 50-60% confluenza) un giorno prima di trasfezione in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero di vitello fetale del 10% (FCS). Per retrovirale uso di produzione imballaggi linea cellulare di scelta, come Phoenix-GP (un gentile dono da Gary Nolan, Stanford University). NOTA: La linea cellulare di packaging esprime stabilmente Gag e Pol proteine ​​per la formazione di particelle retrovirali in trans. Assicurarsi cellule sono sani e aderito alla piastra in un monostrato, prima trasfezione. </li><li> 24 ore più tardi, preparare la miscela di trasfezione DNA. <ol><li> Per 125 ml di DMEM senza siero aggiungere 3 g Busta Virus stomatite vescicolare vettore glicoproteina (PCI-VSVG) e 3 mg di trasferimento vettore che trasporta il gene della proteina fluorescente di interesse. Mescolare e aggiungere 15 ml di polyethylimine (2 mg / ml). </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 min e aggiungere alle cellule goccia a goccia. NOTA: Polyethylimine viene aggiunto alla miscela omogenea DNA come reagente di trasfezione per la formazione di polyplexes. Al fine di ottenere particelle virali che trasportano diversi marcatori proteici fluorescenti, eseguire ogni trasfezione indipendentemente con il marcatore di scelta. Ricordate che il trasferimento vettore retrovirale è di circa 7 Kb di lunghezza e non può essere confezionato se superiori a 10 kb. </li></ol></li><li> Incubare le piastre a 37 ° C. Per aumentare virali Consiglio produzione piastre a 30 ° C invece o 32 ° C. NOTA: 24 mezzi trasfezione hr postali possono essere sostituiti con 7 ml di mezzi freschi, e anche se questo può migliorare la salute delle cellule che possono diminuire la carica virale nel surnatante. </li><li> 48 ore dopo la trasfezione raccogliere le particelle virali-surnatante contenente e filtrare con un filtro da 0,45 micron politetrafluoroetilene. Utilizzare surnatante virale raccolto di recente per la trasduzione. Othaltri- mantenere surnatante in aliquote a -80 ° C ed evitare di gelo-disgelo. Ricorda che titolo virale diminuirà probabilmente fino al 50% con ogni ciclo di congelamento-scongelamento. </li><li> Linea cellulare Piatto di scelta 24 ore prima della trasduzione se aderenti, o immediatamente prima trasduzione se non aderente. Seed 2.0 x 10 5-3,0 x 10 5 cellule aderenti (qui Huh 7.5.1 e HEK 293T) o 5,0 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule non aderenti (qui SupT1) per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. NOTA: Assicurarsi di calibrare il numero di cellule per essere seminati prima trasduzione, specialmente per cellule aderenti, cellule così raggiungere una confluenza di circa il 60% al momento della trasduzione. </li><li> Aggiungere 5 mg / ml Polybrene (hexadimethrene bromuro) a cellule seminate e poi aggiungere surnatante virale precedentemente raccolti per ottenere intorno al 20-40% di infezione (qui 2 ml). NOTA: Il MOI o la percentuale di infezione è in gran parte arbitraria, in quanto l&#39;ordinamento consente di amplificare qualsiasi subpopulatione delle cellule. Ovviamente, un più alto tasso di infezione facilita e velocizza il processo di amplificazione. </li><li> Trasdurre cellule mediante centrifugazione in un rotore secchio appeso a 1.500 xg per 120 min a 32 ° C. Risospendere le cellule non aderenti con mezzi freschi prima dell&#39;incubazione. Per le cellule aderenti, sostituirlo con fresco supporti 24 ore post-trasduzione. NOTA: Si raccomanda di sigillare le piastre prima della centrifugazione con parafilm per evitare fuoriuscite sopra. Per aumentare la diversità delle cellule geneticamente con codice a barre, trasdurre cellule con particelle virali che trasportano le proteine ​​fluorescenti diversi (ottenuti dal punto 1.4). Quando si sceglie marcatori fluorescenti, assicurarsi che siano compatibili con la strumentazione e hanno parametri fluorescenti distinguibili. </li></ol> 2. Selezione e Amplificazione delle Cellule geneticamente con codice a barre <ol><li> Analizzare le cellule di mammifero trasdotte mediante citometria di flusso di almeno 72 ore dopo la trasduzione per quantificare la percentuale di trasduzione. Utilizzare una linea paragonabile cellule non trasdotte come controllo negativo. NOTA: Come ordinamento verrà utilizzata per purificare singole popolazioni cellulari a barre, una percentuale elevata di trasduzione iniziale, mentre non necessario, dovrebbe accelerare il processo di amplificazione. </li><li> Utilizzare la cellula-sorter di scelta per ottenere le cellule che esprimono la proteina di interesse. <ol><li> A tal fine, verificare le porte siano impostati correttamente nei canali giusti. <ol><li> Per fare ciò utilizzare la stessa linea cellulare naive come controllo negativo e impostare la tensione parametro / canale in modo che la popolazione negativo è inferiore al valore di 10 3 su ciascun asse fluorescente. Determinare gating per fluorescenza positiva come eventi che appaiono sopra quella del controllo negativo per ciascun canale fluorescente. </li></ol></li><li> Essere consapevoli del fatto che ogni strumento può variare e la tensione corretta per determinare gating deve essere adeguato di conseguenza, rendendo i controlli positivi e negativi in ​​ogni imperativi expinstallazione erimental. <ol><li> Per il rilevamento della fluorescenza in questo setup sperimentale utilizzare il canale FITC (530/30 filtro passa banda proceduto da una lunga filtro passa 502) per eGFP, il canale di PE (585/42 filtro passa banda proceduto da un filtro 556 passaggio lungo) per td Tomato , e il canale di APC (660/20 filtro passa banda) per E2 Crimson. NOTA: Il laser 488 nm eccita eGFP e td pomodoro mentre E2 Crimson è eccitato dal laser 633 nm. </li></ol></li></ol></li><li> Ordina in 15 ml provette coniche con 1 ml di 100% FCS. NOTA: Il processo di smistamento popolazioni di cellule fluorescenti non è obbligatoria, come si può procedere direttamente con il tipo di singoli cloni (vedi sotto). Ordinamento popolazioni strette basate sulla fluorescenza scelta garantisce una popolazione di backup per la futura selezione dei singoli cloni. Tenere presente che le cellule individuali sono talvolta difficili a crescere, mentre una grande popolazione di cellule può essere facilmente congelato, e poi scongelato e amplificato in una fase successiva. </li><li> Spin giù per le popolazioni ordinati in un rotore di centrifuga appeso secchio a 524 g a 32 ° C per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere in 1 ml di mezzi freschi, e ri-piastra cellule in modo che confluenza cella è inferiore al 60% per consentire la crescita e la divisione per almeno due giorni. <ol><li> Ad esempio, piastra cellule aderenti a circa 3 x 10 5 cellule in 2 ml di media per bene in un 6-pozzetti e 2 x 10 6 cellule in 2 ml di media in un 6 centimetri. Utilizzare DMEM per cellule aderenti e RPMI per le cellule non aderenti (o qualsiasi supporto specificato, se necessario). Inserire cellule piastrate in un incubatore a 37 ° C per diversi giorni per consentire l&#39;amplificazione. </li></ol></li></ol> 3. Ottenere clonali popolazioni di cellule geneticamente con codice a barre a diverse intensità <ol><li> Ottenere popolazioni clonali di cellule originariamente trasdotte (punto 1.7) o dalla popolazione ordinata (punto 2.3). NOTA: Ciò garantirà livello uguale o simile di espressione proteina fluorescente fra tutti la cellas all&#39;interno della popolazione (una popolazione stretto con una piccola CV in media intensità di fluorescenza di fino al 40%). <ol><li> A tal fine, le cellule singole specie in piastre da 96 pozzetti con una unità di deposizione delle cellule automatizzato (ACDU). Set porte per l&#39;ordinamento in base alle popolazioni di interesse. Assicurarsi che cancelli sono fissati almeno un log scala a parte per ottenere popolazioni distinguibili quando si sceglie cellule a diverse intensità di fluorescenza. Per la procedura qui illustrato, utilizzare la stessa citofluorimetria sperimentale impostato come quello descritto nel passaggio 2.2. </li></ol></li><li> Amplifica singoli cloni in un incubatore a 37 ° C per almeno 2 settimane. Attraverso il processo di amplificazione analizzare le cellule sotto il microscopio per garantire che le popolazioni crescenti derivano da singole cellule e non da più di uno. NOTA: Ricordare che la selezionatrice inserirà una cella per pozzetto in media, e mentre alcuni pozzetti non possono avere qualsiasi cella affatto, altri possono avere più di una. <ol><li> Per garantire che un popopo- deriva da una cellula sola, essere estremamente gentile con la piastra e non disturbare i pozzetti pipettando. Osservare la piastra, così da bene, al microscopio. NOTA: Mentre le cellule individuali possono a volte essere difficili da identificare, una volta che iniziano dividendo che sarà facilmente riconoscibile. </li><li> Essere consapevoli del fatto che spesso cellule &#39;gruppo&#39; lungo i bordi. Eliminare quei pozzi, dove si possono osservare diverse popolazioni clonali e mantenere quelle che hanno una popolazione stretto. NOTA: Si consiglia di trasferire in piastre quelli più grandi per l&#39;amplificazione. </li></ol></li><li> Schermo popolazioni clonali putativi analizzando loro mediante citometria a flusso. Confronta loro di un controllo negativo utilizzando la stessa citometria a flusso setup sperimentale. <ol><li> Analizzare solo una percentuale del campione e mantenere il resto come backup. Scegli le popolazioni più nettamente separati in base intensità media e la tenuta della popolazione. Amplificarli come necessario o congelare le scorte incongelamento supporti con 20% glicerolo a -80 ° C per brevi periodi di tempo o azoto liquido per più. NOTA: Ricordate che un &#39;vero&#39; popolazione clonale dovrebbe avere un modello di fluorescenza molto stretto. </li></ol></li></ol> 4. Garantire capacità multiplexing per High Throughput Screening (HTS) <ol><li> Combinare come molte popolazioni clonali distinte come necessario che può essere ulteriormente utilizzato in un formato multiplexati. Scegli cloni con distinguibile assorbimento / spettri di emissione e / o intensità diverse. Se viene utilizzato un formato di piastra a 96 pozzetti, che è adatto per HTS, seme 50.000 cellule in 200 microlitri per pozzetto. NOTA: tenere presente che il numero di cellule è solo una stima e può variare in base a tipo cellulare e se è aderente o meno. </li><li> Analizzare il campione usando citometria a flusso per garantire che ciascuna delle linee cellulari fluorescenti indipendenti stabiliti possono essere distinte tra loro. Prima dell&#39;analisi preparare negativee controlli singoli colori per impostare i parametri ei valori di compensazione. NOTA: L&#39;impostazione dei parametri per distinguere chiaramente le popolazioni miste li permetterà di essere ulteriormente utilizzato in un formato multiplex. </li></ol> 5. Adattare linee cellulari geneticamente con codice a barre per l&#39;applicazione biologica della scelta <ol><li> Trasdurre stabilite linee cellulari geneticamente di codici a barre con particelle virali che contengono gli elementi di analisi di scelta, come descritto qui in Stolp et al., 2013 59. Ricordare che il saggio di scelta dovrebbe occupare un canale fluorescente aggiuntivo e distinguibili e quindi deve essere trasferito alla linea cellulare appropriata codice a barre. NOTA: Ogni linea cellulare codice a barre può sopportare un test diverso. </li><li> Celle a barre Ordina geneticamente fluorescenti per quelli che contengono elementi di analisi. NOTA: Elementi test può essere progettati accoppiato ad un tag o proteina fluorescente (come una fusione o tramite un sito di entrata ribosoma interna) fo il rilevamento diretto attraverso western blotting, citofluorimetria e microscopia. Il sistema utilizzato in questo protocollo si basa su HA espressione di superficie epitopi da solo, o con l&#39;aggiunta di espressione FLAG epitopi. <ol><li> Colorare le popolazioni clonali contenenti i test con gli anticorpi accoppiati HA e APC-modo fluorescente. Poi analizzare le popolazioni clonali con anti-FLAG e FITC-coniugato colorazione anticorpi. </li><li> Per rintracciare il test, analizzare o &#39;decodificare&#39; le popolazioni del canale appropriato caso è possibile distinguere le linee cellulari geneticamente distinte di codici a barre. Qui, decodificare la natura del substrato analizzando nel canale PE per td rilevamento pomodoro. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui sono stati combinati due procedure consolidate; l&#39;ingegneria genetica attraverso la tecnologia retrovirali e l&#39;individuazione di proteine ​​fluorescenti che utilizzano citometria a flusso. Codici a barre a base di proteine ​​fluorescenti genetica per la produzione di linee cellulari uniche fornisce un modo semplice e affidabile per applicazioni multiplex. Generazione di codici a barre cellule geneticamente modificate attraverso la tecnologia retrovirale, è inizialmente un processo lungo, ma permette...

Tecnologie come spettroscopia di fluorescenza, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso, tutti si basano su di fluorescenza, una proprietà ampiamente sfruttato in applicazioni biochimiche, biomediche, e chimici. Fluorescenza, sia intrinseca o tramite l&#39;etichettatura, è stata sfruttata per l&#39;analisi dei pattern di espressione di proteine ​​e profili, destino cellulare, interazioni proteina e le funzioni biologiche 1-9, e attraverso di fluorescenza / Förster trasferimento di energia di risonanza per la rivelazione di interazioni biomolecolari e cambiamenti conformazionali 10-13. Dal momento che l&#39;isolamento del victoria proteina fluorescente verde Aequorea (GFP) 14, la scoperta di proteine ​​fluorescenti aggiuntivi presenti in natura provenienti da altri cnidari, in particolare i coralli, ha ampiamente aumentato il numero di proteine ​​fluorescenti esistenti con spettri di eccitazione / emissione distinguibili. Questi, insieme con l&#39;introduzione di mutazioni nei loro geni 15-19, HAVe ulteriormente ampliato le possibilità, ottenendo una vera tavolozza di proteine ​​fluorescenti a disposizione degli scienziati che sfruttano la microscopia, citometria a flusso e altre tecnologie basate sulla fluorescenza per le loro ricerche. In parallelo, anche se in maniera indipendente, lo sviluppo della tecnologia ha drasticamente retrovirale facilitato l&#39;espressione stabile di informazioni genetiche ectopica in cellule di mammifero 20-23. Non è quindi sorprendente che questa tecnologia è stata utilizzata per trasferire geni di proteine ​​fluorescenti in un ampio numero di tipi di cellule e tessuti 24-28 o per la produzione di animali transgenici 29-31. Seguendo la natura dei retrovirus, l&#39;informazione genetica della proteina fluorescente ectopica viene introdotto all&#39;interno del genoma della cella 32 e la cella diventa fluorescente `per ever&#39;. La struttura, ha permesso il monitoraggio del destino delle cellule, o di una singola cella all&#39;interno di una popolazione di cellule. La cella ora fluorescente così acquicolore rosso proprio BioSignature e può essere definito come codice a barre. La sua unica BioSignature identifica da altre cellule, e, soprattutto, la distingue dalle cellule geneticamente manipolate per esprimere proteine ​​fluorescenti diversi con spettri di assorbimento / emissione distinguibili. Applicazioni biologiche quali il monitoraggio dei fattori di riprogrammazione verso pluripotency 33, l&#39;analisi dei fattori subnucleari per la delucidazione della localizzazione nucleolare 34, la costruzione dei plasmidi reporter fluorescenti per studi trascrizionali 35 o l&#39;etichettatura genetica dei neuroni per lo studio di architettura di rete neuronale 36 , sono solo quattro esempi dei molti che hanno sfruttato diversi geni di proteine ​​fluorescenti per lo stesso apparato sperimentale. La citometria a flusso è stato ampiamente utilizzato per l&#39;analisi dei processi biologici a livello di singola cellula, come l&#39;espressione genica, ciclo cellulare, apoptosi, e segnalazione attraverso fosforilzione 37-43 .Il espressione stabile di geni di proteine ​​fluorescenti in cellule di mammifero ha ulteriormente migliorato l&#39;utilità di citometria a flusso per l&#39;analisi delle cellule 38,44 e ligando-recettore interazioni 45. Capacità avanzate hanno permesso di citometria a flusso per diventare una metodologia ampiamente utilizzata per high-throughput e alto contenuto di screening 46. Nonostante il numero ampliato di fluorometers e robotica tecnologie che possano sistemi per la lettura paio piastre, imaging e citometria a flusso, sembra che ci sia una mancanza di disegno sperimentale che può sfruttare e montare queste capacità tecnologiche avanzate. Metodologie basate sulle cellule veloci, affidabili, semplici e robuste sono drasticamente necessari per le applicazioni canalizzate che migliorano ulteriormente la capacità high-throughput. Questo è particolarmente vero nel campo della scoperta di farmaci in cui saggi cellulari di ingegneria in un formato multiplex può migliorare la potenza di high-throughput di screening 39,47-50 </sup&gt;. Multiplexing, in quanto permette analisi simultanee in un campione, migliora ulteriormente le funzionalità high-throughput 51-54. Barcoding genetica fluorescente permette non solo elegante multiplexing, ma anche, una volta costruito, elude la necessità di protocolli in termini di tempo, riduce i costi accompagnate da anticorpi, perline e macchie 39,52,55, e può ridurre il numero di schermi necessari per alto applicazioni di throughput. Abbiamo recentemente descritto come la tecnologia può migliorare retrovirale multiplexing attraverso barcoding genetica fluorescente per applicazioni biologiche, esprimendo un test precedentemente sviluppato per monitorare HIV-1 proteasi 56,57 con diverse varianti clinicamente prevalenti 58. La metodologia è illustrata in modo più descrittivo concentrandosi su come selezionare e amplificare le celle a barre geneticamente fluorescenti e come produrre pannelli di popolazioni clonali che esprimono proteine ​​fluorescenti distinte e / o diversa intensit fluorescenzaIES. Pannelli di popolazioni di cellule distinguibili in base alle loro caratteristiche fluorescenti aumentano funzionalità multiplexing, che possono essere ulteriormente sfruttati in combinazione con saggi cellulari che affrontano diverse questioni biologiche. Il protocollo inoltre descritto come ingegnere di un gruppo di cellule con codice a barre che recano uno dei saggi cellulari precedentemente sviluppate in laboratorio, come ad esempio 59. Questo protocollo non è quindi lo scopo di mostrare la consolidata tecnologia retrovirale / lentivirali per il trasferimento genetico, il valore delle proteine ​​fluorescenti o le applicazioni di citometria a flusso 60,48 ma piuttosto per mostrare la potenza migliorando di combinare tre per le applicazioni canalizzate.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:515px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">10mL syringes</td>
			<td style="width:160px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td>309604</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45&#181;m plytetrafluoroethylen filter</td>
			<td style="width:160px;">pall corporation</td>
			<td>4219</td>
			<td>used for filtering the virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">45000-304</td>
			<td>cell growth media for HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PEI (Polyethylenimine)</td>
			<td style="width:160px;">poly sciences</td>
			<td>23966-2</td>
			<td>&#160;2mg/mL concentration used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Hanging bucket centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:160px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5805 000.017</td>
			<td>used for spin infection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>used for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Polybrene (hexadimethreen bromide)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689</td>
			<td>Used to increase viral infection efficiency.&#160; Used at a 5&#181;g/mL concentration.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSAria</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for sorting cell populations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">FACSCanto</td>
			<td style="width:160px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>instrument used for cell analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Phoenix-GP</td>
			<td style="width:160px;">Gift from Gary Nolan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cell line used to produced retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:160px;">Mediatech</td>
			<td>MT35015CV&#160;</td>
			<td>used for cell growth and sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">&#160;SupT1 cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1942</td>
			<td>Human T lymphoblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">HEK 293T cells</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:345px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>cell growth media for SupT1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic barcoding with fluorescent proteins for multiplexed applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Multiplexing fluorescenti geneticamente codice a barre cellule a fini di applicazioni biologiche possono essere realizzati solo dopo che siano stati generati singole popolazioni clonali. Multiplexing è più efficace quando le popolazioni di codici a barre hanno caratteristiche distinte fluorescenti nitide con il minimo sovrapposizione spettrale. L&#39;esempio illustrato nella figura 1 con popolazioni clonali di cellule di mammifero SupT1 illustra che le cellule a barre con mCherry e proteina fluorescen...

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Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Views.  San Diego State University. Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications. 

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Barcoding genetica con proteine fluorescenti per applicazioni multiplexati