הקבוצה הרב-תחומית שלנו מנסה להבין כיצד חלבון זיהומי, פריון, יכול לבצע משימות ביולוגיות מורכבות. אנו מתעניינים גם באופן שבו פריונים יכולים להישאר בסביבה במשך שנים עד עשרות שנים. בעקבות הליכי טיהור פריונים, שיטה חזקה לקביעת היעילות של השבתת פריונים לא הייתה זמינה.
אנו מנסים לטפל בנושא זה באמצעות המחקר שלנו. שיטת המטוש, בשילוב עם RT-QuIC, מאפשרת לדגום מגוון רחב של משטחים כדי לזהות פעילויות זריעת פריונים. זה יכול לשמש לזיהוי פריונים הקשורים לפני השטח בסביבות מעבדה, קלינית או סביבתית.
אני מעוניין להבין כיצד פריונים מתקשרים עם משטחים ואת הדרישות של פריונים הקשורים לפני השטח כדי ליצור זיהום. כדי להתחיל, לזהות ולתייג אזורי מעקב מתאימים למטוש. הכינו שני צינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר לכל אזור מזוהה והוסיפו 250 מיקרוליטר של DPBS לצינור הראשון, תוך השארת השני ריק.
יש לאחזר מטושים מוקצפים מאחסון באזור נקי מזיהום פריונים. הכן את הבקרות החיוביות והשליליות באמצעות הומוגנאטים מתאימים במוח או BH ב- DPBS. בעזרת כפפות נקיות, שלפו את המספר הנדרש של מקלוני קצף מהאריזה והניחו אותם בצד כלפי מטה לתוך מדף צינורות.
לוודא שהקצוות אינם באים במגע עם משטחים אחרים. החזקת מקלון קצף נקי ליד הידית, להחיל 50 מיקרוליטר של דגימות ביקורת חיוביות ושליליות בהתאמה על קצות מטוש. בעזרת מספריים, חתכו את הידית העודפת של המקלון לכמחצית מאורכו והניחו את המקלון בצינור מיקרו צנטריפוגה טעון מראש כדי לטבול את קצה הקצף ב-DPBS.
החזיקו ליד הידית מקלון קצף נקי, הרטיבו מראש את קצה הקצף במים מולקולריים ונערו את עודפי המים. הניחו את קצה הקצף הלח על האזור שנבחר למעקב ובצעו ספוגית קדימה ואחורה כ-10 פעמים תוך סיבוב בו זמנית של קצה המקלון על פני השטח. בעזרת מספריים, חתכו את הידית העודפת של המקלון לכמחצית מאורכו והכניסו את המקלון לצינור מיקרו צנטריפוגה טעון מראש כדי לטבול את קצה הקצף ב-DPBS, מה שמבטיח שהמכסה יוכל להיסגר לחלוטין.
השליכו את הכפפות והחליפו אותן בכפפות חדשות לפני שתמשיכו לאתר המטוש הבא כדי למזער זיהום צולב. למיצוי מטוש, הניחו את צינור המיקרו צנטריפוגה במתלה צינור עגול והטביעו את המתלה באמבט המים של קרן הכוס. ודא שספוגית הקצף ב- DPBS בתוך הצינור נמצאת מתחת לפני המים, ומשאירה את חלקי הידית לא שקועים.
בצע סריקה של הדגימה למשך 15 שניות בסך הכל עם חמש שניות מופעלות וחמש שניות מחוץ למחזורים. לאחר הסוניקציה, צנטריפוגו את הצינור למשך כ-15 שניות כדי לאסוף את ה-DPBS בתחתית הצינור לפני ההעברה. באמצעות פיפטה P 1000 להגדיר 250 מיקרוליטר, בזהירות לאסוף את כל תמצית ספוגית נוזלית מלמטה לתוך הצינור הריק המתאים שכותרתו מראש.
יש להשליך את הצינור המשומש המכיל את המקלון. רכז את הדגימה ברכז ואקום, ודא שמכסה הצינור פתוח, עם סיום המחזור, ודא שהדגימה מרוכזת לחלוטין כשנותרה רק גלולה. יש לאחסן את הגלולה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
לניתוח RT-QuIC, הכינו פקדי צלחת שליליים וחיוביים עם הומוגנטים מתאימים במוח המדוללים בתמיסת דילול רקמות. כעת הפשירו את גלולת תמצית המקלון המאוחסנת מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס והשהו מחדש את תמצית המקלון המיובשת עם 50 מיקרוליטר מים באיכות מולקולרית על ידי פיפט. מערבלים לזמן קצר, ומניחים לדגימה לשבת בטמפרטורת החדר.
טען שני מיקרוליטרים של בקרות צלחת שליליות וחיוביות ולאחר מכן תמציות מטוש לתוך בארות צלחת RT-QuIC בהתאמה. מקלוני בקרה שליליים לא חצו את סף הפלואורסצנטיות החיובית, ואישרו כי לא היה זיהום במהלך ההליכים. תמציות ספוגית בקרה חיוביות הציגו זריעה עקבית בכל הבארות המשוכפלות, והפגינו רגישות גילוי נאותה.
דגימות מטוש משטח מאזורים לא מזוהמים לא הראו זריעה מעל הסף, מה שאישר שליליות פריונים. משטחים מזוהמים פריון, הוצגו זריעה מעל הסף עם יחסי נקודה מקסימלית מגוונים וזמני פלואורסצנטיות בהשוואה לבקרות. משטחים מזוהמים בפריונים שטופלו באקונומיקה לא הצליחו לזרוע RT-QuIC, והדגימו חיטוי יעיל.
חלק מהממצאים על פני השטח הציגו עקומות קינטיות משתנות וזמני פלואורסצנטיות ארוכים יותר המצביעים על תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות, ככל הנראה בשל נוכחות אבק או כימיקלים שיוריים על משטח.
