זיהוי של חלבון פריון חריג על ידי אימונוהיסטוכימיה

הטכניקה מאפשרת אבחנה מאשרת של מחלות פריונים על ידי הטכניקה PrP scrapie ברקמות, ניתוח סוגי PrP scrapie והפצה כדי להעריך סטייה עונשית לפרופיל התצהיר הידוע PrP scrapie. הטכניקה מתוקננת ומשתמשת בנוגדנים ספציפיים ל- PrP scrapie, מה שמאפשר הדמיה של תצהיר PrP scrapie ברקמות. הטכניקה גם נותנת מידע על האזור הנוירואנטומי וסוג התאים.

התחילו בהנחת השקופיות עם חלקי הרקמה בסלסלת צביעה מנירוסטה. צאו מהסל באמבט קסילן. לאחר שלוש דקות, מוציאים וטובלים שוב את הסל.

כדי להסיר קסילן ולהחזיר לחות את הסעיפים, לטבול את הסל באמבט אתנול מוחלט. לאחר שלוש דקות, מוציאים וטובלים שוב את הסל. ייבשו את החלקים באוויר לפני הכנסתם לאמבט אתנול 90% למשך דקה אחת.

לאחר מכן, להעביר את החלק לאמבט אתנול 70% במשך דקה נוספת. בכל טיפול באמבט אתנול, יש להסעיר בעדינות את סל המגלשה פעמיים ולרוקן את הסלסלה לפני ההעברה הבאה. מעבירים את הסל לאמבט אתנול 50% למשך דקה.

טבלו בזהירות את חלקי הרקמה בחומצה פורמית 98% בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את המקטעים במי ברז במשך חמש דקות ולאחר מכן שטפו פעמיים במים מזוקקים. השתמשו במיכל צביעה מפלדת אל-חלד בתא הלחץ המלא ב-500 מיליליטר מים מזוקקים לטיפול בחיץ ציטראט 10 מילימולרי בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

למטרות בקרת איכות, הניחו על הסל קטע של סרט חיווי אוטוקלאבי דביק כדי לפקח על הטמפרטורה והלחץ. ברגע שהאזעקה מציינת שהציוד השיג את זמן התוכנית ואת הטמפרטורה, לטבול את הסל עם שקופיות. לאחר מכן, הפעל את התוכנית על תא הלחץ כדי להגדיר נקודה 2 ולהקליט את הלחץ הראשוני והסופי של תוכנית זו.

עבור inactivation של peroxidase אנדוגני, לטבול את סל שקופיות המכיל את קטעי הדגימה באמבטיה של 3% מי חמצן מתנול במשך 30 דקות. גשר על המקטעים מתחת למים זורמים למשך חמש דקות לאחר הניקוז, טובלים את המקטעים במי מלח חוצצים של טריס למשך חמש דקות נוספות. לזיהוי חיסוני, הניחו כל שקופית על מחזיק צלחת כיסוי מסחרי שהורטב מראש במי מלח חוצצים עם טריס, כאשר צד הרקמה פונה למחזיק וקצוות ההחלקה חופפים לשתי הנקודות התחתונות של המחזיק.

הקפידו להימנע מבועות אוויר. החזק את מכלול מחזיק השקופיות בין האגודל לאצבע. השאר אצבע אחת מעל שקופית הדגימה ואת השנייה בתחתית המחזיק, ולאחר מכן מקם את המכלול בגלריה של המערכת.

כדי להבטיח שהערכה מורכבת היטב, מלא את הבאר בין שקופית הדגימה לבין המחזיק במי מלח חוצצים בטריס מבלי לעלות על גדותיה. מנקודה זו, ודא כי כ 80 מיקרוליטר של מלח חוצץ טריס חייב להישמר בין המחזיק לבין המגלשה. אין לאפשר לחלקים להתייבש.

הפחת את כתמי הרקע לפני הטיפול בנוגדן הראשוני על ידי דגירה מראש של דגימות השקופיות למשך 30 דקות עם סרום תקין של 20% מאותו מין כמו הנוגדן המשני המארח במי מלח חוצצים של טריס. מבלי לשטוף את הסעיפים, יש למרוח 200 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים הראשונית ישירות לתוך כל באר של ערכת מחזיק השקופיות ולדגור במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף את החלקים, ממלאים את הבארות במי מלח חוצצים טריס, ומחכים חמש דקות.

חזרו על הכביסה פעמיים. לאחר מכן, לדלל את הנוגדן המשני biotinylated בריכוז 1 עד 200 במי מלח Tris-buffered עם 10% סרום סוס. תקן את אמצעי האחסון הנדרש בהתאם למספר הסעיפים שיש לטפל בהם.

החל 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית על כל באר של ערכת מחזיק השקופיות. לאחר 30 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, חזרו על שטיפת המלח בחציצה של טריס. עבור הדגירה עם peroxidase avidin-biotin מורכב, להכין את מגיב 30 דקות לפני השימוש ולהחיל 200 מיקרוליטר של הפתרון בכל באר של מחזיק צלחת שקופיות.

בסיום, דוגרים על מחזיק הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. רמת התיוג החיסוני הלא ספציפי בחיות ביקורת שליליות ידועות של אנצפלופתיה ספוגית - שליליות נקבעה כדי לפרש כראוי את התיוג החיסוני של חלבוני פריון חריגים ספציפיים. תיוג לא ממוקד על ידי נוגדנים נגד PrP נצפה כצביעה תוך-עצבית בדידה, חוטים ליניאריים עדינים לא סדירים של כתמים בנוירופיל, תיוג לא חלקיקי מפוזר בכמה אזורים של חומר אפור ולבן, ותיוג ציטופלזמי מפוזר של נוירונים.

הטבלה מסכמת את התיאור של סוגי חלבון פריון חריגים בעלי תווית חיסונית שנצפו באנצפלופתיה ספוגית בקר, סקראפי קלאסי ולא טיפוסי, ומחלת בזבוז כרונית של צרבידים לאבחנה חיובית וקריטריונים שנקבעו לתוצאות שליליות, לא חד משמעיות ולא מתאימות. כל השלבים חשובים מאוד. ה- pH של הפתרונות וטמפרטורת החדר הם תכונות חשובות להצלחת טכניקה זו.

פיתוח אימונוהיסטוכימיה לזיהוי הן של PrP והן של סוג התאים יכול לתת מידע על כל תא המעורב בפתוגנזה ראשונית.