Name: upright imaging of drosophila egg chambers
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education&#160;Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.

1. Dissection של Ovarioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כרבע זבובים נקבת 2-4 יום בן וכמה גברים לבקבוקון מזון טרי זבוב עם שמרים יבשים פעילים הוסיפו. השתמש כותנה כתוספת לבקבוקונים, ולהוסיף כמה טיפות של מים לכותנה כדי לשמור על לחות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון מקום בחממה C ° 25 ל14-16 שעות כדי למקסם את מספר שלב 8-10 תאי ביצה. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לטמפרטורה ושלב רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת לנתיחה, פתרונות 0.1M KPO 4 וNP40 כנדרש ליום המחרת (ראו חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים באמצעות CO 2, ומניח תחת מיקרוסקופ לנתיחה. Pipet כמה טיפות של תקשורת לנתיחה לכל חלל בשקופית זכוכית הדיכאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק מלקחיים בכל יד בכ 30 מעלות זווית לראש הטבלה ולהתמצא זבוב נקבה אחת עם הכנפיים כלפי מטה. עם היד הלא הדומיננטית שלך, להרים את הנקבה באמצעות מלקחיים, האחיזה בnterior של הבטן, ליד בית החזה, ולהטביע אותה לתקשורת לנתיחה בשקופית הדיכאון (הבלעה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מלקחיים האחר, לתפוס את השלד החיצוני באחורית הגחון של הבטן ולחדור מבעד. תפוס את השחלות בקצה האחורי, ואז למשוך אותם אל מחוץ לבטן ומניח לתקשורת טרי בצד השני של שקופית הדיכאון האחר. (הבלעה איור 1 א). הימנע קרע לגזרים את המעיים. מחק את הפגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עם זבובי נקבה האחרים עד שכל השחלות הם גזורים. מחק את הזכרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים, להחזיק השחלה בסוף האחורי (סמוך לתאי הביצה הגדולים ביותר), ועם היד השנייה להשתמש זוג המלקחיים לצבוט אחד מהתאים קדמי ביותר הביצה (germarium). (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט ובהתמדה, למשוך שרשרת ovariole מתוך מעטפת השחלה. תמשיך לנתח את ovarioles בנפרד עד שכל תאי הביצה הרצויות הם removed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.7-1.8 לכל השחלות גזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת פעולה, להעביר ovarioles לצינור 0.6ml בעזרת פיפטה העברה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו ovarioles ליישב לתחתית של צינור, ולאחר מכן להמשיך לשלבים תיקון וצביעה. </li></ol> 2. Immunofluorescent (IF) הכתמה של Ovarioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את התקשורת לנתיחה מovarioles עם טפטפת. הקפד שלא להסיר את כל ovarioles או תאי ביצה. השאר כ -50 μl של ovarioles ותקשורת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של paraformaldehyde 16% ל -150 μl של 0.1 מ &#39;4 מאגר KPO בצינור, ולהוסיף פתרון לתאי ביצה כדי לתקן אותם. דגירה בעוד נדנדה במשך 10 דקות. זהירות: paraformaldehyde הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשטוף פעמיים עם חיץ לשטוף NP40 0.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים במשך 15 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין סטנדרטי IF פרוטוקול 15 לשלבים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לאחר קיבוע, להוסיףנוגדנים עיקריים בדילולים המתאימים דגירה O / N ב 4 ° C. לשטוף מספר פעמים בNP40, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משני (1: 200 דילולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מספר פעמים בNP40, ולאחר מכן להוסיף DAPI (1: 1000) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לחזור שוטף. פעם אחת אם הפרוטוקול הוא מלא, להוסיף 200 μl של גליצרול 50% ב- PBS לתאי ביצה ותן לו לשבת בRT עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון, להחליף אותו עם גליצרול 70% ב- PBS, ומכסה בנייר כסף. הנח מדגם ב 4 ᵒC עד מוכן להרכבה. בינתיים, תמשיך עם שלב 3. </li></ol></li></ol> 3. Advance הכנת שקופיות ג&#39;לי גליצרין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד לפחות 4 מיליליטר של גליצרין ריבה בעזרת מרית ולמלא צינור תרבות תא זכוכית לסימן חצי הדרך. להמס ריבת גליצרין באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים טיפה קטנה של גליצרול, כ -300 μl, מפתרון המניות על שתי שקופיות מיקרוסקופ. שימוש ברקמה, להפיץ גליצרול בla דקYer פני כל אחת מהשקופיות. זה מספק בסיס ומאפשר להסרת קלה של ג&#39;לי גליצרין בשלב 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקצה של קצה פיפטה 1,000 μl מסונן. קצה פיפטה לחתוך שימוש להעברת 1,000-1,500 μl של ג&#39;לי גליצרין החם לאט לכל שקופית מיקרוסקופ. לטפל כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות ג&#39;לי גליצרין לשבת במשך 5 דקות בRT להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל שקופית ג&#39;לי גליצרין ב 60 מ&quot;מ × 15 מ&quot;מ צלחת פטרי ולכסות בניילון הנצמד. מקום 4 ° CO / N. לחלופין, חנות גליצרין שקופיות ריבה עד 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הרכבה צ&#39;יימברס הביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגימות מהשלב 2.5, טיפות 3 μl כמה פיפטה של ​​תאי ביצה בגליצרול 70% על פני שקופית ג&#39;לי גליצרין אחד. המשך pipetting 3 טיפות μl עד שכל תאי הביצה בשקופית זו. ודא שכל טיפה מכילה לפחות עשרה תאי ביצה. בינתיים, מחמם צינור תרבות של ג&#39;לי גליצרין באמבט המים C ° 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף ג&#39;לי גליצרין עם תאי ביצה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. התאם הגדלה, כך שרק טיפה אחת של תאי ביצה היא בשדה הראייה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 30 מד ככפית, להרים את תא ביצת שלב הרצוי. כאשר תאים נחוצים, נפרדים רצויים ביצה משרשרת ovariole באמצעות המחט כסכין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מפסולת שעלול להפריע להדמיה, להעביר את תא הביצה לשקופית ג&#39;לי גליצרין השני, עם הקדמי פונה שמאלה (איור 1E -1). חזור על פעולה עד שיש לפחות שבעה תאי ביצה בשורה בטור (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופס עמודות חדשות של שבע עד שכל תאי הביצה הרצויות מועברים לשקופית ג&#39;לי גליצרין השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתלוש פיסה קטנה של רקמה ושזירה. להשתמש בזה כדי לספוג את PBS-גליצרול העודף מתאי הביצה על ידי נוגע בקלילות כל אחד. יש להיזהר שלא להסיר את תאי ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנותקקצה קצה פיפטה 200 μl מסונן. להשתמש בזה כדי להעביר 150 μl של גליצרין ג&#39;לי כדי לכסות את כל העמודות של תאי ביצה. הערה: כמות ריבת גליצרין הדרושה כדי לכסות את העמודות מבוססת על שלבי תא ביצה ומספר העמודות. הסכום עשוי להיות מותאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תאי ביצה רכובים לשבת במשך 5 דקות ב RT עד השכבה העליונה של ג&#39;לי גליצרין הוא התגבש לגמרי (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית מקום תאי ביצה רכובים בצלחת פטרי מ&quot;מ 60 מ&quot;מ × 15 ומכסים בניילון נצמד. חנות ב 4 ° CO / N כדי לאפשר את שכבות ריבת גליצרין כדי לחזק יחד (מקום בחושך, אם קיים חשש לגבי photobleaching). </li></ol> 5. הכנת לשכות ביצת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות של תאי ביצה רכובים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. התאם הגדלה, כך שרק אחד עמודה של תאי ביצה היא בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל זעיר 45 ° זווית, לחתוך straigקו ht בצדו הימני של העמוד הראשון של תאי ביצה (קרובים לצד האחורי של תאי הביצה). (איור 1D-E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לחתוך מעל תא הביצה הראשון בחלק העליון ומתחת לתא הביצה האחרון בטור. בשלב זה הטור של תאי ביצה יש לחתוך משלושה צדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microknife, הפרוסה בצדו השמאלי של העמוד, קרוב ככל האפשר לצד הקדמי של תאי הביצה (איור 1E -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​קר 1X PBT 100 μl על העמודה לחתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במרית קצוות עגול כדי להסיר את ג&#39;לי גליצרין העודף סביב שלושה צדדים של טור החתך של תאי ביצה וזורקים, והשאיר את שאר בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המרית בחתך שנעשה בצד הקדמי של תאי ביצה ולהפריד את העמודה מגוש ג&#39;לי גליצרין העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות מיקרוסקופית לאו הפוך (5.8.1) או זקוף (5.8.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך מיקרוסקופים: העברה tהוא הטור של תאי ביצה לcoverslip עם הצד קדמי של תאי ביצה פונה כלפי מטה. חזור על שלבים 5.2-5.8 עד שכל העמודות של ג&#39;לי גליצרין הוסרו ורכובה. הוסף כמה טיפות של 50% PBS-גליצרול על כל בלוק של תאי ביצה כדי למנוע מהם מהתייבשות. תאי ביצת תמונה ישירות על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופ הזקוף: העבר את העמודה של תאי ביצה לשקופית מיקרוסקופ עם הצד הקדמי פונה כלפי מעלה. חזור על שלבים 5.2-5.9 עד שכל העמודות של ג&#39;לי גליצרין הוסרו ורכובות על שקופיות מיקרוסקופ. הוסף כמה טיפות של 50% PBS-גליצרול על כל בלוק של תאי ביצה וחוסם כיסוי עם coverslip ½ # 1. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+oogenesis.">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li><li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+oogenesis.">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li><li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+follicle+cells:+morphogenesis+in+an+eggshell.">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li><li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+morphogenetic+repertoire:+perspectives+from+the+Drosophila+egg.">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li><li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+choreography:+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells.">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Border-cell+migration:+the+race+is+on.">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li><li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+JAK/STAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila.">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li><li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis.">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li><li>Denef, N., Sch&#252;pbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning:+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium.">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li><li>Beccari, S., Teixeira, L., R&#248;rth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis.">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li><li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=slow+border+cells,+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis,+encodes+Drosophila+C/EBP.">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li><li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium.">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li><li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells.">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li><li>Van de Bor, V., Zimniak, G., C&#233;r&#233;zo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK/STAT+activation+during+cell+invasiveness.">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li><li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypicans+regulate+JAK/STAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen.">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li><li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells.">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li><li>R&#248;rth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila).">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li><li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis.">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li><li>Qui&#241;ones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li><li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upright+imaging+of+Drosophila+embryos.">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

כאן אנו מתארים שיטה להר ותמונה קטנה, פיתוח תאי ביצה מנקודת מבט סוף-על. טכניקות נפוצות לתאי ביצת הדמיה מותאמות להשקפות לרוחב ובעיקר לאפשר להדמיה מדויקת של תאי זקיק Medio-צדדי כאשר מוכתם עם נוגדני ניאון. השימוש בZ- ערימות או עזרי שחזורים 3-D בצפיית מטוסי מוקד מרובים, אבל עדי?...

מחקר של melanogaster תסיסנית סיפק תובנות גדולות לרגולציה הגנטית של מגוון רחב של תופעות. בפרט, חל מחקר מקיף על התפתחות ביצית, כי אאוגנזה מספקת דרך צייתנית לחקור תהליכים רבים ושונים התפתחותיות, כוללים דפוסי רקמה, שינויי קוטביות תא, מיתוג מחזור התא, ורגולצית translational 1,2,3,4. אירוע morphogenic אחד חשוב במהלך אאוגנזה הוא המפרט, הרכישה של תנועתיות, וההגירה של קבוצה של תאים הנקראים תאי גבול (שנסקרו ב5). מאז נדידת תאים הוא תכונה מרכזית של המורפוגנזה בעלי החיים, ובגלל הרגולציה הגנטית של תהליך זה נשמרת היטב, מנגנונים שנקבעו בזבובים עשויים להיות חשוב בהקשרים אחרים. לפיכך, אנו חוקרים את השליטה המולקולרית של נדידת תאי גבול. ללימודים שלנו, פיתחנו שיטה חדשה כדי לבחון את הקטבים הקדמי של פיתוח ביצים,שבו תאי גבול להתעורר, לבחון כיצד הם מפתחים בפירוט. בתוך השחלה, תאי ביצה בשלבי התפתחות שונים קיימים לאורך שרשרות נקראות ovarioles, שנארזות בנדן דק (איור 1 א). כל תא ביצה ימשיך ליצור ביצה אחת. במהלך אאוגנזה, כמה סוגי תאים שונים חייבים לפתח באופן מתואם. ד תא ביצת melanogaster מורכב מ -16 תאי נבט-קו, כוללים ביצית אחת, מוקף בשכבה אחת אפיתל זקיקי 6. מספר קטן של תאים מיוחדים, הנקרא תאים קוטביים, להתעורר בקטבים הקדמי והאחוריים של האפיתל. תאי הגבול 6-8 מקורן באפיתל הקדמי של תא הביצה, הנגרם על ידי התאים הקוטביים 5,7. באמצע אאוגנזה-(שלב 9), תאי הגבול להתנתק משכניהם ולהעביר בין תאי האחות להגיע לביצית באחורית של תא ביצת 5,7. תנועה זו חייבת להיות מושלמתבעוד תאי הגבול יישארו בקבוצה שסבבה את שני תאים קוטביים שאינו ניע, מה שהופך את זה סוג של נדידת תאים קולקטיבית. הגירה מוצלחת של אשכול תא הגבול מבטיחה התפתחות תקינה של micropyle של קליפת הביצה, אשר הכרחית להפריה. תאי הקוטב הקדמי להורות גורל תא גבול על ידי הפעלת מפל הולך אותות. תאים קוטביים להפריש ציטוקינים, מזווג (UPD), אשר נקשר לקולטן הטרנסממברני, Domeless (DOME), על תאי שכני זקיק בשלב 8 של פיתוח ביצית 8,9. הכריכה של UPD גורם טירוזין קינאז יאנוס (JAK) לphosphorylate מתמר האותות וActivator של תמלול (STAT) 8,10,11. STAT לאחר מכן עובר לגרעין כדי להפעיל שעתוק. תאים איטיים גבול (SLBO) הוא גורם שעתוק שהוא יעד תעתיק ישיר של STAT וגם נדרש לתא גבול הגירה 12. צפיות ברוחב של תאי ביצה מצביעות tפעילות STAT כובע מוסדרת בשיפוע פני האפיתל הקדמי 8,11,13. יש תאי זקיק הקרובים ביותר לתאים הקוטביים הרמות הגבוהות ביותר של STAT הופעל, כך הם הופכים לתאי גבול ולפלוש לרקמות נבט-הקו הסמוכים. כדי להבין כיצד תאי הגבול מפורטים ובלהתנתק מהאפיתל, אנחנו צריכים לבחון כיצד הרקמה מאורגנת. אם אנו רואים את תאי ביצה מנקודת מבט קדמי-על, שהיינו מצפה סימטריה הרדיאלית של פעילות STAT בתאי הזקיק המקיפים את התאים הקוטביים. קצה בתצוגה גם באופן מדויק יותר להראות הבדלים של חלבונים בממברנה וממשקי תאי תאים לפני ובמהלך הניתוק מהשוואת תאים במטוסי מוקד שונים. בגלל תאי ביצה מוארכים ומחובר זה לזה על ידי תאי גבעול, הם להתיישב על גבי שקופיות רוחבית, ולכן קשה לבחון את הארכיטקטורה הקדמית. לפיכך, מידע רב על התאים בקטבים של תא הביצה ישכבר משתמע מנופים לרוחב. למרות שניתן להשיג קצת מידע דרך שחזורים אלגוריתמיים 3-D של חלקים אופטיים, פיזור אור, photobleaching, וגבולות עניים יותר של רזולוציה בציר Z-להפוך את המידע הזה פחות מפורט ואמין, בהעדר טכניקות יקרות כמו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר 14 . סוגים אחרים של הדמיה מבוססת סעיף (למשל, במיקרוסקופ אלקטרונים או חתך microtome) דורשים מניפולציה נרחבת של רקמות, כולל התייבשות, ויגדיל את הסבירות לחפצים. לפיכך, פיתחנו שיטה חדשה לתמונת ד תאי ביצת melanogaster תוך זקוף. שיטה זו כבר הוכיחה שימושית בהבהרה כיצד תאי ניעתי נגזרו (ראה תוצאות נציג ומאנינג et al, הנסקר), והוא צפוי להיות באופן רחב יותר יקר במחקרים של היבטים אחרים של אאוגנזה.

<table><tbody><tr><td>0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Buffer)</td><td></td><td></td><td>Add 3.1 g of NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and 10.9 g of Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (anhydrous) to distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>methanol-free to preserve GFP fluorescence</td></tr><tr><td>30G x 1/2 inch needle&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Regular bevel</td></tr><tr><td>Active Dry Yeast</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>To fatten female flies</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>PAA-cell culture company</td><td>A15-701</td><td>Used in NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection</td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml stock solution&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Added to supplement dissection medium (10%)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass culture tube</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 ml</td></tr><tr><td>Glass Depression Slides</td><td>VWR</td><td>470019-020</td><td>1.2 mm Thick, Double Cavity</td></tr><tr><td>Glycerin Jelly&amp;nbsp;</td><td>Electron Microsocpy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Mounting media</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15760</td><td>70% in PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td><td>(interchangable for Nonidet P-40)&amp;nbsp; Used in NP40 Wash Buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica Fluorescent Stereoscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 Confocal Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA dry objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micro spatula&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td>Stainless steel</td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 mm</td></tr><tr><td>NP40 Wash Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>Added to supplement dissection medium (0.6X)</td></tr><tr><td>Petridish- Polysterine, sterile</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 W x 15 H mm</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 packs of Powder</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Used in 0.1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>Used in 0.1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;br/&gt; 11720018</td><td>With L-glutamine and sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Used in fluorescent antibody staining</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Used in NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image Analysis Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>For processing confocal Z-stacks</td></tr></tbody></table>

upright imaging of drosophila egg chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

שיטת ההדמיה הזקופה אפשרה לנו לראות באופן ישיר את הארגון של תאים באפיתל הזקיקים הקדמי בשלב 8. סמן כללי לגורל תא זקיק, העיניים נעדרות (EYA) חלבון, כמו גם את סמן DNA הגרעיני DAPI, הראה גם ביטוי על פני תחום זה של תאים, והוכיח כי כל התאים ניתן היו לראות עם עוצמות צביעה דומות (אי?...

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

7.6K Views.  University of Maryland Baltimore County. The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Video: Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biology

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death processes that are generally assumed to be intrinsically irreversible. Promoting anastasis could in principle rescue or preserve injured cells that are difficult to replace such as cardiomyocytes or neurons, thereby facilitating tissue recovery. Conversely, suppressing anastasis in cancer cells, undergoing apoptosis after anti-cancer therapies, may ensure cancer cell death and reduce the chances of recurrence. However, these studies have been hampered by the lack of tools for tracking the fate of cells that undergo anastasis in live animals. The challenge is to identify the cells that have reversed the cell death process despite their morphologically normal appearance after recovery. To overcome this difficulty, we have developed Drosophila and mammalian CaspaseTracker biosensor systems that can identify and permanently track the anastatic cells in vitro or in vivo. Here, we present in vivo protocols for the generation and use of the CaspaseTracker dual biosensor system to detect and track anastasis in Drosophila melanogaster after transient exposure to cell death stimuli. While conventional biosensors and protocols can label cells actively undergoing apoptotic cell death, the CaspaseTracker biosensor can permanently label cells that have recovered after caspase activation - a hallmark of late-stage apoptosis, and simultaneously identify active apoptotic processes. This biosensor can also track the recovery of the cells that attempted other forms of cell death that directly or indirectly involved caspase activity. Therefore, this protocol enables us to continuously track the fate of these cells and their progeny, facilitating future studies of the biological functions, molecular mechanisms, physiological and pathological consequences, and therapeutic implications of anastasis. We also discuss the appropriate controls to distinguish cells that undergo anastasis from those that display non-apoptotic caspase activity in vivo.

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis is technically challenging to detect in vivo because the cells that have reversed the cell death process can be morphologically indistinguishable from normal healthy cells. Here we describe protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis in live animals by using our newly developed in vivo CaspaseTracker biosensor system.

גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Medicine

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

הדמיה זקופה של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-הדמיה של

סידן הדמיה ב

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית