המחברים הם אסיר תודה באופן מיוחד דבורה האריס דניאל מק &#39;קיי. תמיכה עבור עבודה זה סופק על ידי המחלקה לביולוגיה במכללה לאמנויות ומדעים של CWRU, ועל ידי מספר מענק HHMI 52005866 לתמיכה של חינוך לתואר ראשון במדעים ביולוגיים.

1. הדמיה מתודולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים גליצרין ג&#39;לי בתוך אמבט 55 ° C מעלות מים 20-30 דקות עד שהוא הופך לנוזל הומוגני. מערבולת, אבל לא לנער את הבקבוק, כדי למנוע היווצרות של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ג&#39;לי נמס, למרוח שכבה דקה של גליצרול באמצעות Kimwipe בשקופית זכוכית נקי (אופציונלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1-1.5 מ&quot;ל של גליצרין מומסת ריבה באמצעות P1000 לחתוך קצה הפיפטה על פני השטח של השקופית כדי ליצור שכבה ראשונה דקה. פיפטה בזהירות כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו ג&#39;לי לחזק 5 דקות על משטח אופקי, ואז למקם את השקופית ב -20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהמשיך יישור העובר. לחלופין, לכסות את השקופית עם בניילון נצמד ומניחים אותו על 4 ° C עד 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה טיפה קטנה של עוברי הצבעונית גליצרול 70% / PBS או אחרים מבוססי גליצרול antifade התקשורת הרכבה (למשל Slowfade או Vectashield) בצד של תשתית ג&#39;לי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין טרום יישור העוברים בנפרד על ידי העברת אותם מירידה לפני השטח ג&#39;לי. העברת אותם באמצעות מחט המזרק מלוכסנות, באמצעות צד מלוכסנות כמו כפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בערך המקום עוברים לאורך 2-3 עמודים. אם העובר נתקע המחט, מערבבים אותו טיפה המכילה את העוברים אחרים כדי לשחרר אותו. אל תבזבזו זמן בזהירות יישור אותם בשלב זה. תשאיר קצת מקום בין עמודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את העוברים על ידי הזזה אותם במאוזן על המדיום ג&#39;לי בעזרת המחט של המזרק. בעוד הזזה, לכוון את הראשים והזנבות באותו כיוון. לגרום להם מקבילות זו לזו לאורך הטור. הסרה של עודפי גליצרול PBS שמאל כמו שביל עם חתיכת Kimiwipe מעוות. הערה: גליצרול עודף יגרום עוברים להיות עטוף בצורה רופפת בתוך ג&#39;ל, והתוצאה היא הפרדה של שתי שכבות ג&#39;לי, ולכן קשה לגזור הר. לעומת זאת, הסרת גליצרול יותר מדי יהיה יבש לשטח עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קצה צהוב לחתוך להפיץ שכבה דקה של ריבה על עוברי (50-150 μL, תלוי כמה היו מיושרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להחליק במקפיא -20 מעלות צלזיוס 10-20 דקות או לאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא ג&#39;לי הוא קשיח לחלוטין לפני חיתוך. אחרת, בלוק של עוברים יהיה קשה מאוד הבלו. התוצאות הטובות ביותר עבור חיתוך מתקבלים ביום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בהיקף לנתח, להשתמש סכין גילוח לחתוך לחלוטין דרך ג&#39;לי בשני הצדדים של העוברים בציר. החזק את הסכין בזווית של 90 מעלות כדי לבצע חתכים ישר. הקיצוצים צריכים להיעשות קרוב מאוד הקטבים הקדמי ואת האחורי של עוברים, כדי למנוע ג&#39;לי עודף שעלול להכשיל הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100-200 μL של קר PBT (4 ° C, PBS 0.1% Tween 20) לצד הפחתות בזהירות מגרדים את ג&#39;לי בין העוברים באמצעות מרית. הערה: חומר ניקוי ב PBT עוזר להסיר את ג&#39;לי משקופית מבלי לפגוע בעוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט, להעביר את גוש ג&#39;לי עם עוברי מוטבע לשקופית נקי לחיתוך נוסף. חותכים קוביות קטנות עם עוברי 5-7. השתמש PBT להעביר בקלות סביב הבלוק ג&#39;לי. לחלופין, במקום לחסום על משטח זכוכית יבשה לתת לזה לצרף זכוכית, אשר יוצרת יציבות יותר דווקא זמירה ג&#39;לי, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליפ זקוף העוברים מוטבע ריבה בעזרת סכין גילוח ומחט. להדמיה תחת מיקרוסקופ, להמשיך עם אחד משני הצעדים הבאים, בהתאם לסוג של מיקרוסקופ לעמוד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ הפוך: במקום סיים בלוקים העובר על coverslip רב, עם עוברים בתנוחה זקופה. ודא שהצד של העובר עם סכום של לפחות ג&#39;לי יהיה במגע קרוב עם יעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ זקופה: לעשות שתי ערימות עם ארבעה # 1 coverslips מודבק עם דבק מגע כדי לשמש &quot;תומך&quot; והמקום לחסום העובר בתוך גליצרול בין &quot;תומך&quot;. גשר ערימות באמצעות coverslip ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח confocal, לבדוק את מרחק העבודה של מטרות לשמש כדי לברר אם אתה יכול תמונה לאורך כל הדרך העובר או באופן חלקי בלבד. לדוגמה, ד עוברים melanogaster יש ~ 0.55 מ&quot;מ באורך ניתן הדמיה לחלוטין באמצעות תוכנית Zeiss 20x-Apo או 40X LD ניאו פלואוריד אובייקטיבי. האתר הבא יש מידע על יעדים Zeiss זמין נותן לך את האפשרות לחפש יעדים על פי מרחקי עבודה: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. נציג תוצאות מכיוון העוברים נותרים שלמים, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לקחת מידות מדויקות של גודל העובר ואת המרחקים בין דפוסי ביטוי גנים. באיור 1, אנו מראים שלב blastoderm עוברים מוכתמות DAPI כתם גרעיני (כחול), אנטי הגב חלבון (אדום), mRNA SOG (צהוב) ו-mRNA SNA (ירוק). מורפולוגי procesSES, כגון invagination של והמזודרם (איור 2 א &#39;, ב&#39;) הגירה של תאים mesodermal (איור 3 ו 4) יכול גם להיות דמיינו באמצעות שיטה זו. Z-עמדות שונות לאורך ציר DV ניתן להשיג על ידי שינוי מישור המוקד, כפי שמוצג איורים 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. זקופה פרוסה אופטי של העובר תקין בשלב blastoderm. מכתים כפולה עבור ה-mRNA וחלבון. MRNAs יעד של בדיקות באתרו (SOG ו SNA) וחלבון מוכתם על ידי נוגדן ראשוני (אנטי הגבי) מסומנים בתרשים. DAPI שימש התווית גרעינים. ראוי לציין, כי הביטוי של SOG ו SNA ממוקמים apically בציטופלסמה, תוך הבעת הגבי הוא גרעיני. אותות חזקים מהתעתיק SOG המתהווה הממוקמים גרעינים ניתן לראות בהגדלה זו. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הדמיה של העובר זקופה gastrulating ללא פגע. בדיקות ה-mRNA השתמשו בצבעים שלהם מצוינים באיור. א) שים לב כי בשלב זה, שלושה גנים מוכתם פלואוריד זהה (SNA, SOG ו DPP, בירוק), באים לידי ביטוי בתחומים מופרדים מרחבית. והמזודרם invaginating מבטא SNA, שכבת neuroblast מבטא ind ו האאקטודרם מבטא DPP, ואילו הביטוי SOG עדיין קיים באזורים הגחון של מערכת העצבים. ב) מטוס confocal עמוקה יותר של העובר אותו, נציין את בסיס והמזודרם invaginating בתוקף מבטא SNA, אבל האזור apical שלה מבטאת רמות נמוכות יותר. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הדמיה של העובר זקופה שלם עם הלהקה המורחבת נבט SOG RNA (צהוב). חילזון, ind ו mRNAs DPP (ירוק), חלבון הגבי (אדום). גרעינים הוכתמו DAPI (כחול). א) משטח הפוקוס ליד ראש העובר. ב) אחר המטוס מוקד באזור הגזע של העובר אותו. הערה גוש של תאים mesodermal לפני הגירה לרוחב (להשוות איור 4) שוכב קרוב לקו האמצע הגחון משני צידי העובר נבט-band המורחבת. Neuroblasts Delaminating מסומנים בירוק (ind ו SNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הדמיה זקופה של העובר ללא פגע במהלך הארכה הלהקה נבט SOG RNA (צהוב). חילזון, ind ו mRNAs DPP (ירוק), חלבון הגבי (אדום). א) שים לב neuroblasts delaminating מן האפיתל (חץ), מוכתם הן ind ו SNA בשלב זה (ירוק). הערה גם את הביטוי מוגבל של SOG אל קו האמצע הגחון (צהוב). הביטוי של DPP בשלב זה ניתן לראות בצדדים רוחבי של העובר (כוכבית). ב) סעיף אופטי בעובר אותו מוצג לקראת סוף אורך העובר, המתאימה לאזור אמצע האחורי. התאים קו האמצע הגחון מוכתמות עבור SOG.

<ol>
	<li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos.">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li><li>Gr&#946;hans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila.">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li><li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-on+imaging:+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos.">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li><li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol.">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li><li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila.">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

לקיחת תמונות חתך של עוברים תסיסנית יכול להיות מאתגר, כיוון שהיא דורשת דיסקציה זהירה של יד 2 פרוסות או שימוש בתקשורת מוטבע לעיבוד microtome, שהיא בדרך כלל מזיקה עבור stainings ניאון. לחלופין, Z-ערימות שנעשו מיקרוסקופ Confocal ניתן להשתמש כדי להפוך את שיקום 3D של חתך תמונות. עם זאת, זמן רב כדי להפוך כמה פרוסות דק Confocal לשיקום photobleaching 3D מדויק הופכת בעייתית. דאגה נוספת כאשר עוברים הדמיה כי הם רכובים longitudinally הוא פיזור אור המתרחשת כאשר מגיעים חלקים עמוקים יותר של העובר, אשר גם מסבך לקיחת מידות מדויקות של אותות ניאון לצורך כימות של רמות החלבון או ביטוי mRNA 1. אפילו עם מיקרוסקופ שני הפוטונים confocal, פיזור אור עדיין דאגה בגלל האטימות של החומר חלמון באמצע של העובר, מה שהופך את הבחירה של התקשורת הרכבה לשקיפות אופטימלי של המדגם להיות מוגבל. כדי לעקוף את הבעיות הללו, טכניקה חדשה בשם &quot;סיום על&quot; הדמיה של עוברים מיצוב אנכית פותחה לאחרונה על התמונה הן לחיות דגימות קבוע 4. במאמר זה, פיתחנו פרוטוקול חדש עבור עוברי רכוב אנכית המאפשרת הכנה ויזואליזציה פשוטה של עוברי או רקמות קבוע בכל גודל וצורה, כי הם מוכתמים מספר בדיקות באתרו 3. השיטה שלנו מורכבת של שימוש גובר בתקשורת עם עקביות ג&#39;לטיני המשמש לשים בארגז עוברים מיושר בתוכו. בלוקים Cut זה כלי התקשורת הרכבה ובו עוברים מוטבע ניתן למקם זקוף לפני הדמיה בכל סוג של מיקרוסקופ Confocal. על ידי הטבעה את העוברים לתוך ג&#39;לי ומיקום אותם במאונך, אנו מסוגלים לקחת אופקי חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal, שבו תאים לאורך הציר הגבי-הגחון של העובר מוצגים בו זמנית. זהו שיפור משמעותי לצורך כימות מאז בעיות של פיזור אור photobleaching של צבעי ניאון המתרחשת שחזור Z-מחסנית קונבנציונאלי של עוברים רכוב longitudinally מסולקות עכשיו. לפיכך, כימות הביטוי או חלבון רמות הגן לאורך הציר הגבי-הגחון מדויק, שכן התאים הממוקם הגבי-הגחון עמדות מול הם צילמו באותו זמן ובאותו העמדה-Z אותו confocal. בנוסף, בשיטה המתוארת מאפשרת לנו לקבל תמונה מלאה 2-D על פני ציר הגבי-הגחון מעובר 3-D ללא שימוש מורכב שיטות חישוביות ופרש לדמיין תאים בנקודות שונות לאורך ציר DV 6. כמה שלבים קריטיים לכלול הסרת עודפי גליצרול לאחר יישור עוברים, כדי למנוע פיצול בין שתי שכבות של ג&#39;לי. עם זאת, אם המדגם הוא מיובש מדי, התמונה המתקבלת יהיה מעוות יש מורפולוגיה שגויה. בנוסף, אם המדיום ג&#39;לי סביב העובר נחתך בזווית ולא ישר, וכתוצאה מכך התמונה עשויה להופיע בסיבוב פחות ביצי יותר בכושר, בשל מיקום שגוי של עוברים בזווית שאינה 90 מעלות. לבסוף, אם ג&#39;לי אינו הדוק מספיק כדי לחתוך העובר על קצות קדמית / אחורית, לא ניתן לקבל תמונה נכונה בגלל מרחק העבודה של מטרה ישמש בעיקר כדי להתמקד לתוך ג&#39;לי ולא את העובר. צעד חשוב נוסף אשר עשוי להיות נחוץ כאשר העובר מאוחר הדמיה gastrulating היא בזהירות למיין את שלבי עניין תחת היקף לפני ליישר אותם. בדרך כלל, עוברים הם מבוימים על פי מאפיינים מורפולוגיים, כי ניתן לזהות בקלות כאשר בעמדה האורך. בין השינויים אלטרנטיבה שיכולה להתבצע בשיטה זו היא לכלול מגיב אנטי לדעוך (למשל p-Phenylenediamine או PPD) לתוך השכבה השנייה של ג&#39;לי כדי לסייע בהגנה מפני photobleaching של צבעי ניאון.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycerin Jelly mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences Company</td>
<td>17998-10</td>
<td>Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997.</td>
</tr>
<tr>
<td>Zeiss LSM 700 Confocal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-544-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72204-02</td>
<td>Size 1 &frac12; (specific for the objectives used in this work).</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slips (for making supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherfinest</td>
<td>12-544-10</td>
<td>Use four coverslips glued with superglue. </td>
</tr>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td>
<td>M420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Steel back single edge industrial blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>21-401-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hypodermic needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482610</td>
<td>26 Gauge</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Labnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

upright imaging of drosophila embryos

מספר ידוע הדרגתיים המוךפו&quot;גנטי שהולך ותנועות הסלולר להתרחש לאורך הציר הגבי / הגחון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; העובר. עם זאת, טכניקות הנוכחי נעשה שימוש כדי להציג תהליכים כאלה מוגבלים במקצת. פרוטוקול הבאה מתארת ​​שיטה חדשה הרכבה קבוע שכותרתו<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים לצפייה העטרה עם הדמיה confocal. שיטה זו כוללת הטבעה העוברים בין שתי שכבות של התקשורת גליצרין ג&#39;לי הרכבה, הדמיה רצועות ג&#39;לי בעמדה זקופה. הצעד הראשון עבור הרבדה העוברים היא להפוך את תשתית דקה של ריבת גליצרין בשקופית. לאחר מכן, עוברים מיושרים בקפידה על משטח זה מכוסה בשכבה השנייה של ג&#39;לי. אחרי השכבה השנייה היא הקרושה, רצועות ג&#39;לי נחתכים והתהפך זקוף הדמיה. חלופות מתוארים עבור לדמיין את העוברים בהתאם לסוג של מיקרוסקופ עומד לשמש. מאז כל התאים לאורך הציר הגבי-הגחון הם צילמו בתוך מטוס-Z יחיד confocal, השיטה שלנו מאפשרת מדידה מדויקת והשוואה של אותות ניאון ללא photobleaching או פיזור אור משותפת 3D שחזורים של עוברים רכוב longitudinally.

Watch this Scientific Journal Video about Upright Imaging of Drosophila Embryos at JoVE.com

Upright Imaging of Drosophila Embryos

כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה מוכתם<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים בתנוחה זקופה המאפשרת הדמיה של חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Research

JoVE Journal

Biology

Upright Imaging of Drosophila Embryos

9.2K Views.  Case Western Reserve University. כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה מוכתם תסיסנית עוברים בתנוחה זקופה המאפשרת הדמיה של חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal.

Video: Upright Imaging of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...