התאים HC11 ו- EpH4 הם קווי תא אפיתל השד העכבר אשר יכול להבדיל בתרבות. במקביל, תאים אלה יכולים להשתנות על ידי מספר אונקוגנים. תאים אלה הם אידיאליים לחקר יחסי הגומלין בין בידול לבין טרנספורמציה ניאופלסטית.
טכניקות אלה ניתן להשתמש במחקרים התמרת אותות כדי לגלות מטרות לטיפול בסרטן. לדוגמה, GTPase Rac קטן ומולקולות אחרות עלול לעורר טרנספורמציה של תאי אפיתל השד כאשר לידי ביטוי לרמות גבוהות, אבל באופן מפתיע ברמות נמוכות, הם עלולים לגרום בידול. מתמרים אותות אחרים עשויים להתנהג באופן דומה.
העקרונות עשויים לחול על סוגים אחרים של התמברות, כמו גם כאשר ההתכנסות התא ממלא תפקיד חשוב, למשל ההידול של adipocytes או myotubes. מישהו המבצע טכניקה זו בפעם הראשונה צריך לזכור כי ציפוי של תאי HC11 חשוב. הסיבה לכך היא ש איש קשר בין תא לתא חשוב להתביור.
נקודה נוספת שיש להיזהר ממנה היא כי מיצוי נאות של תאי EpH4 מהמטריצה הוא קריטי לכמות חלבונים מכיוון שכל שאריות ישפיעו על קביעת החלבון. הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שקשה לתאר פרטים מסוימים של הפרוטוקול על הנייר. התחל על ידי הכנת בקבוק של 50 מיליליטר של תא HC11 בינוני על פי הוראות כתב היד.
כדי צלחת התאים, שאפו את המדיום מחמישה שישה סנטימטרים 50% מנות פטרי confluent ולשטוף את התאים עם כ 1.8 מיליליטר של טריפסין באמצעות פיפטה פסטר סטרילי תשעה אינץ 'כותנה מחוברת פסטר. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטרים של טריפסין לכל צלחת ומערבבים את הצלחת כדי לנתק את התאים המחוברים. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם מטרה 4X כדי לוודא שהם התחילו לסלק.
לאחר מכן שאפו כ-1.5 מיליליטר של מדיום HC11 עם פיפט פסטר סטרילי בגודל 9 אינץ' והתיזו אותו אנכית על התאים תוך כדי סיבוב המנה כדי להימנע מהתזה. מעבירים את כל התאים לבקבוק עם מדיום HC11 ומערבבים להתפזר באופן שווה בבקבוק. ואז aliquot ההשעיה התא לתוך 20 שלוש ס"מ פטרי מנות על ידי pipetting שני מיליליטר של תאים לכל מנה.
רוק מנות פטרי כדי להפיץ את התאים דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לילה. ביום שלמחר, כאשר התאים הם 90 עד 100%confluent, שאפו את המדיום והחליפו אותו במדיום ב- FBS אך ללא EGF. לאחר גידול התאים במדיום ללא EGF במשך 24 שעות, מוסיפים את מדיום ההידול ל -10 מנות ומגדלים את התאים עד 10 ימים ושומרים על 10 הכלים האחרים כפקדים.
שנה את המדיום כל יומיים עד שלושה עם תאי שליטה ומטופלים על-ידי HIP. כדי לפקח על ההידול, התבונן בתאים עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטי אם התאים מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק.
בנוסף, לכמת את מידת ההתברות על ידי חילוץ חלבונים מן HIP שטופלו ולשלוט בתאים פעם ביום וביצוע ניתוח כתם מערבי. אסוף והצב את מדיום הצמיחה EpH4, מטריצת EHS, ושני צינורות חרוטיים 50 מיליליטר על קרח. Prechill צלחות תרבות הרקמה עם טיפים פיפטה במינוס 20 מעלות צלזיוס ולהכין EpH4 צמיחה בינוני בתוספת 10 או 20% מטריצה בשני צינורות חרוט 50 מיליליטר ולשמור אותם על קרח עד מוכן לשימוש.
לאחר אחזור צלחות תרבות הרקמה prechilled במינוס 20 מעלות צלזיוס, מעיל 10 בארות של צלחת 24 באר עם 150 microliters של מטריצה לא מבודדת על ידי הפצת המטריצה עם פיפסה. הימנע מיצירת בועות בעת הפצת המטריצה. לאחר מכן הקישו בעדינות על דפנות הצלחת והדגירה את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר למטריצה להתגבש.
בינתיים, להתכונן ההידול על ידי טריפסיה של תאי EpH4, כמו גם שתואר בעבר והבטחת מתלים תא יחיד לאחר שימוש חוזר של תאים טריפסיניים. לאחר מכן, לספור את התאים בהשעיה עם המוציטומטר. מעבירים חמש פעמים 10 לארבעת התאים ל באר לצינור צנטריפוגה חרוט סטרילי 1.5 מיליליטר ולסובב אותם ב 250 פעמים g במשך חמש דקות.
בזהירות שאף את המדיום העל-טבעי והצב את הצינור על הקרח. השתמשו בקצה פיפיטה של מיליליטר אחד כדי לנצל מחדש את התאים ב-350 מיקרוליטרים של מדיום הצמיחה EpH4 בתוספת מטריצה של 20%, תוך שמירה על הצינורות על הקרח כדי למנוע בועות. לאחר שהשכבה התחתונה התגבשה, הוסיפו את 350 המיקרוליטרים של מתלי התאים לכל היטב מצופה והצבו אותה בממגר פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר לשכבת המטריצה של 20% להתגבש.
שימו לב לתאים עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לוודא שתאים בודדים גלויים. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום EpH4 עם 10% מטריצה למעלה והדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס. התחל אינדוקציה ההידול יום אחד לאחר ציפוי התאים במטריצה.
הסר בזהירות 150 מיקרוליטרים של מדיום מטריצה 10%matrix העליון ולהוסיף 200 microliters של אמצעי EpH4 המכיל HIP ו 10% מטריצה עבור פקדים להוסיף מדיום מטריצה 10% ללא HIP. החלף את המדיום כל יומיים עד 10 ימים ניטור היווצרות mammosphere עם מיקרוסקופ ניגוד פאזה. כדי לכמת את ההידול, בזהירות pipette את 10%מטריצה HIP בינוני מן הבארים ולשטוף את שכבת מטריצה 20% עם 350 microliters של קרח קר PBS.
לאחר מכן הוסיפו 70 עד 100 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח עם EDTA מילימולר אחד ישירות לתוך בארות וניתקים בעדינות את השכבה התחתונה של מטריצה של 100% עם קצה פיפטה. מנערים את הצלחת בעדינות בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בזהירות להעביר את ההשעיה spheroid לצינור חרוט ולשטוף את הבארים עם 500 microliters של PBS EDTA כדי לשחזר את כל כדוריות שנותרו.
רוק הצינור על קרח במשך 30 דקות נוספות לוודא כי המטריצה מתמוססת לחלוטין. אם ניתן לראות גושי מטריצה גלויים, הוסיפו עוד PBS EDTA או רעד זמן רב יותר. צנטריפוגה הפתרון ב 350 פעמים g כדי גלולה כדוריים.
לאחר מכן שאפו את העל-טבעי, תנו את הכדורים, וגלו את התאים עבור בטא-קסטין, ציקלין D1 ו-p120RasGAP על-ידי כתמים מערביים. יש תלות בולטת של התברואה על כוחו של אות Rac בתאי HC11. בעוד CRAC1 אנדוגני נדרש עבור בידול ורמות נמוכות של RacV12 מופעל מוטציה לגרום לעלייה בקיבולת בידול, רמות גבוהות RacV12 לעורר בלוק של בידול ולגרום neoplasia.
כאשר תכונות ההבחנה של תאי EpH4 נחקרו בתרבות מטריצה תלת-מימדית, נמצא כי ייצור בטא-קסטין הגיע לשיא של 8 עד 10 ימים וביטוי מחזור D1 היה מקסימלי בארבעה עד שישה ימים לאחר גירוי HIP. כדי לקבוע את המיקום של תאים בודדים, הם היו מוכתמים ב- DAPI ומדמים אותם במיקרוסקופיה קונפוקאלית. מוות תאי פנימי היווצרות של לומן חלול נצפתה mammospheres בעוד תוספת של HGF הביא להיווצרות של מבנים צינוריים.
מישהו מבצע טכניקה זו בפעם הראשונה צריך לזכור כי ציפוי של תאי HC11 חשוב. גם מיצוי נאות של תאי EpH4 מהמטריצה הוא קריטי עבור כימות חלבון כי כל שאריות ישפיעו על קביעת החלבון. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור מתמרים אות אחרים שעלולים להתנהג באופן דומה.
אם יש מוטציות הנהג בסרטן, אז העיכוב המלא שלהם לא יהיה צורך מאז רמות נמוכות שנותרו למעשה לגרום התביור.
