This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.

הערה: aspirates מח עצם אנושי מפסגת הכסל נאסף ממתורמים באישור ועדת האתיקה של לוצרן. aspirates מח עצם לכלבים מפסגת הכסל נאסף עם consent.Human של בעל כלב (כ. 20 מיליליטר) וכלבים (כ. 10 מיליליטר) aspirates מח עצם היו אנטי-קרוש על ידי תוספת של 15 מיליליטר של 3.8% נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה בחדר הניתוח. הדגימות הועברו לסביבת המעבדה לעיבוד באותו היום כמו נסוג. 1. הכנת האוריקינאז (לפני 1 st שימוש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש האוריקינאז באמצעות תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) על פי הוראות היצרן: הוסף 10 מיליליטר PBS לבקבוק המחיצה-כניסה באמצעות מזרק 10 מיליליטר. להמס את החומר היבש על ידי מתערבל להשיג 50,000 יחידות הזרקה (U) לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 aliquots μl (25,000 U כל אחת) ליםצינורות terile. חנות aliquots -20 ° C ולהשתמש בו בעת צורך במשך לפחות 6 חודשים. </li></ol> 2. שלבי הכנה של (לפני כל מח עצם טיפול) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של האוריקינאז אחד (25,000 U) ללשאוב מח עצם קורש (כרכים לשאוב עד 25 מיליליטר טופלו בהצלחה באמצעות aliquot יחיד של 25,000 U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים מים באמבטיה או רועד חממה עד 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. אנזימתי Digest של קריש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל העבודה בממשלת זרימה למינרית בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום חיידקים של דגימות מח העצם במהלך עיבוד. כאשר עובדים עם חומר אנושי שעלולים להיות מדבק, השימוש בכפפות מגן, כמו גם טיפול זהיר מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת 100 מיקרומטר תא על גבי שפופרת 50 מיליליטר סטרילי. יוצקים בזהירות את לשאוב מח עצם דרך מסננת התא, הטיה המסננת או מסתובב חומר הקריש. השתמש טיפ pipet סטרילי לזרימה טובה יותר באמצעות רשת המסנן. הערה: הימנע מכל דילול של הקריש, למשל, על ידי שטיפת הקריש עם PBS. האוריקינאז פועל באופן עקיף ודורש מרכיבי הסרום (כלומר., פלסמינוגן) מהביופסיה לתקציר יעיל. תוך המשך התהליך עם חומר הקריש, התסנין יכול להיות כל הזמן בRT עד לשימוש נוסף בשלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את חומר קריש מח עצם לתוך צלחת תרבית תאים ריקה באמצעות מלקחיים סטרילית. חותך את הפסולת לחתיכות קטנות של כ 2 מ&quot;מ 3 באמצעות אזמל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החתיכות הקטנות של הקריש לתוך צינור תגובה 50 מיליליטר באמצעות המלקחיים סטרילית. ודא שיש לו את הקריש הטחון מראה רטוב. אם זה נראה יבש, להשתמש בחלק מהתסנין מהצעד 3.1 כדי ללחלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate הקריש על ידי pipetting למעלה ולמטה במשך 5 פעמים באמצעות pipet microtiter 5 מיליליטר. להוסיף aliquot 1 של האוריקינאז למדגם. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס או באמבט מים או בחממה רועדת (בעדינות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate ידי pipetting מעלה ומטה במשך 5 פעמים באמצעות pipet 5 מיליליטר. לבצע שלב זה בקבינט בטיחות ביולוגי. דגירה של 30 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, triturate שוב 5 פעמים באמצעות pipet 5 מיליליטר. לעבור על מסננת תא 100 מיקרומטר טרי לברכה עם התסנין משלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא בטמפרטורת הסביבה של 10 דקות ב 500 x גרם. בטל supernatant. להשעות מחדש את התא גלולה בתקשורת כמפורט להלן או בהתאם לנוהל הסטנדרטי של המעבדה שלך לתרבות הרחבת MSC. </li></ol> 4. מתזמן תרבות תאי הרחבה וצלחות CFU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים (בהיקף של אריתרוציטים ותאי mononuclear) ב 50 מיליליטר של מדיום בסיסי: Alpha-ממ בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / ml פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין ו -2.5 מ&quot;ג / מיליליטר amphotericin B . ספירת התאים 01:10 מדוללים בפתרון Trypan הכחול באמצעות chambe נויבאוארr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת התאים בצלוחיות תרבית תאים בצפיפות של 5 x 10 7 תאים / 2 סנטימטר ודגירה בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס. אם זמין, להשתמש חוסר חמצן תנאים (5% חמצן). לשליטה assay CFU, צלחת 10 9 תאים בצלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 ימים של תרבות, תאי גזע mesenchymal מחוברים לצלחת תרבית תאים בזמן שתאים אחרים יישארו בהשעיה. לשנות את התקשורת עם מדיום בסיסי בתוספת 5 ng / ml גורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (bFGF). לשליטה assay CFU, טיפול בצלחת תרבית התאים באופן דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך תרבית תאים עבור הסכום כולל של 2 שבועות, החלפת מדיה שלוש פעמים בשבוע. אם תאים יעלו על 80% confluency, לפצל על ידי trypsinization. לשליטה assay CFU, להחליף את התקשורת באופן דומה, אך לא לפצל את התאים לקורס של השבועות. </li></ol> 5. Giemsa כתם לAssay CFU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיליליטר של Giemsa-פתרון לכל צלחת: דילאוטה פתרון המניות (7.6 גר &#39;/ ליטר Giemsa בגליצרול: מתנול) 1:10 ב מים סטריליים (תמיד להכין דילול עבודה טרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מצלחת תרבית תאים ולשטוף את התאים עם PBS. להיות מאוד precautious בעת החלת נוזל לצלחת פטרי ולהימנע משטיפה מהתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים במתנול הטהור במשך 5 דקות בRT. מחק את מתנול. הוסף את Giemsa-הפתרון ודגירה של 60 דקות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם PBS. אוויר יבש ראש הצלחת ראשון על מגבת נייר. ספירת המושבות באופן ידני. זו מושגת הטובה ביותר באמצעות עט סימון על גביו של הצלחת. </li></ol> 6. בידול MSC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול MSCs כלבים הערה: MSCs כלבים הובדל לchondrogenic, osteogenic ושושלות adipogenic על ידי גירוי עם המדיה המתאימה לארבעה שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל בידול Adipogenic, MSCs התרבות בmonolayer ב 4 x 10 5 ceLLS / 2 סנטימטר לסירוגין שני תנאי תרבות שונים כדלקמן; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בתקשורת תחזוקת adipogenesis מכילה DMEM + Glutamax, FBS 3%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B ו -170 מ&quot;מ אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בתקשורת גרימת adipogenesis עם מדיום תחזוקה בתוספת FBS 3%, 5% בסרום ארנבת, dexamethasone 1 מיקרומטר, 500 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methylxanthine, 33 מיקרומטר ביוטין, 5 מיקרומטר rosiglitazone ו -17 מיקרומטר pantothenate 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתענג טיפות שומנים על ידי צביעה עם השמן האדום-O. בקצרה, לתקן תאים עם פורמלדהיד 10%, לשטוף עם PBS ואת הכתם עם O האדום נפט 0.35% בisopropanol. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות בידול osteogenic MSCs בmonolayer בשעה 7 x 10 3 תאים / 2 סנטימטר ולעורר בפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקדם DMEM (GIBCO) + Glutamax, FBS 5%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B, 501; חומצה אסקורבית L-M 2-פוספט, 10 SS-glycerophosphate מ&quot;מ ו -100 ננומטר dexamethasone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את פיקדונות מינרליזציה על ידי כתם פון Kossa (5% אגנו 3). בקצרה, לתקן את התאים עם פורמלדהיד 10%, לשטוף עם PBS ואת כתם עם 5% אגנו 3 במים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול Chondrogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוביות Cut (3 מ&quot;מ לכל צד) מהתקן רפואי ספוג בצורה, היוו מאני lyophilized סוג קולגן, ומשמשות כחומר פיגום לתמוך תאים 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSCs זרע בחלק העליון של הקוביות בריכוז של 4 x 10 6 תאים / מיליליטר (~ 70,000 תאים / קובייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התוספת של תקשורת, לאפשר לתאים לדבוק בקוביות למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על מבני MSC-קולגן בתקשורת chondrogenic בהיקף של DMEM / F12 + Glutamax, FBS 2.5%, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B, 40 ng / ml dexamethasone, 50 מיקרוגרם / מיליליטר אסקורבית החומצה 2-פוספט,50 מיקרוגרם L-פרולין / מיליליטר, 1x אינסולין-transferrin-סלניום X, ו- 10 ng / ml הפיכת גורם-β1 צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכתמי כחולי alcian לדמיין הצטברות של proteoglycans בסעיפי מבנים. בקצרה, להכתים את החלקים O / N עם 0.4% הכחולים alcian מומסים בH 0.01% 2 SO 4 ו0.5m hydrochloride guanidine. בשלב הבא, לשטוף את החלקים נשטפו למשך 30 דקות ב -40% DMSO ו0.05M MgCl 2. תאים היו counterstained עם אדום מהיר גרעיני. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li><li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease.">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li><li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo.">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).</li><li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells.">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).</li><li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mesenchymal+stem+cells:+characterization,+differentiation,+and+application+in+cell+and+gene+therapy.">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li><li>Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videos+in+clinical+medicine.+Bone+marrow+aspiration+and+biopsy.">Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy.</a> N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).</li><li>Cuthbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-platform+quality+control+assay+to+quantify+multipotential+stromal+cells+in+bone+marrow+aspirates+prior+to+bulk+manufacture+or+direct+therapeutic+use.">Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use.</a> Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).</li><li>Veyrat-Masson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+content+of+fresh+bone+marrow:+a+proposed+quality+control+method+for+cell+therapy.">Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy.</a> Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).</li><li>Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+and+subsequent+infusion+of+human+bone+marrow-derived+stromal+progenitor+cells+(mesenchymal+progenitor+cells):+implications+for+therapeutic+use.">Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use.</a> Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).</li><li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+expansion+score+for+tissue-engineering+applications+with+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li><li>Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+mesenchymal+stromal+cell+therapy+and+risk+of+malignancies.">Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies.</a> Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).</li><li>Bonab, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+mesenchymal+stem+cell+in+vitro.">Aging of mesenchymal stem cell in vitro.</a> BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).</li><li>Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes+from+clotted+blood.">Isolation of lymphocytes from clotted blood.</a> J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).</li><li>De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+immunophenotyping+of+leukemia+cells+in+clotted+blood+and+bone+marrow.">Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow.</a> J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).</li><li>St Antoine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+thrombolytic+drugs+on+clotted+blood+and+bone+marrow+specimens+to+generate+usable+cells+for+cytogenetic+analyses.">Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).</li><li>Kisiel, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+proliferation+of+canine+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow,+adipose+tissue,+muscle,+and+periosteum.">Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum.</a> Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).</li><li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+different+commercial+scaffolds+on+the+in+vitro+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+to+nucleus+pulposus-like+cells.">Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells.</a> Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).</li><li>Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+insights+into+the+secretome.">Stem cells: insights into the secretome.</a> Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).</li><li>Benvenuti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosiglitazone+stimulates+adipogenesis+and+decreases+osteoblastogenesis+in+human+mesenchymal+stem+cells.">Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells.</a> J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).</li><li>Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+purified,+culture-expanded+human+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.</a> J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).</li><li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+banking+for+research--bench+to+bedside+and+back--myth,+reality+or+fast+fading+reality+at+the+dawn+of+a+personalised+healthcare+era.">Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era.</a> Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).</li><li>Smith, H. W., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+signalling+by+uPAR.">Regulation of cell signalling by uPAR.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

באופן שגרתי אנו דוגמים מח עצם בזמן שהמטופל עובר ניתוח (במקרה שלנו בעיקר ניתוח בעמוד השדרה), עם היתרון שיש לו רק קצת עבודה נוספת שבוצעה על ידי אנשים בחדר הניתוח. למרות שהדגימות מעורבבות עם נתרן ציטרט מייד לאחר נסיגה, דגימות רבות היו קרשו באופן חלקי, כאשר הם הגיעו למעבדה ...

תאי גזע mesenchymal (MSCs) לשחק תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית והנדסת רקמות. הם יכולים להגר, להתמיין לסוגי תאים שונים 1 ונקלט, אשר הופך אותם למועמדים אידיאליים עבור טיפולי אוטולוגי 2,3. בזמן האחרון, ניסויים קליניים באמצעות MSCs לתיקון עצם וסחוס, שתל לעומת מחלה מארח או מחלת לב הושקו 4. ניתן לקצור MSCs אלה מרקמת חוט או שומן הטבור אבל תוצאות המבטיחות ביותר התקבלו מתאי גזע שמקורם במח עצם 5. רכס הכסל מאפשר לאסוף כמות ניכרת של מח עצם ולכן משמש כאתר עיקרי של שאיפה 6. עם זאת, איכות לשאוב יורדת עם עלייה בנפח של מח עצם נסוג. בעוד 5 מיליליטר הראשון של לשאוב מח עצם מכיל תאי גזע באיכות גבוהה, נסיגה של נפחים גדולים יותר מובילה לדילול של לשאוב עם f דם ההיקפיROM עצם כלי הדם מאוד 7. בגלל megakaryocytes וטסיות הדם הנוכחיים, aspirates מח עצם נוטה קרישה, תרופות נגד קרישת דם, אלא אם כן נמצאים בשימוש. אבל אפילו עם תרופות נגד קרישת דם, קרישים עלולים להתרחש. במח עצם, תאי גזע מייצגים רק חלק קטן מבריכת התא הכוללת 8 וצריכים להיות מורחב בתרבות עבור רוב הנדסת רקמות או יישומים טיפוליים 4. האיכות של תרבות כזו תלויה במידה רבה בברכת התא הראשונית, כלומר., גיוון ומוצא גבוה מספר 9. מספרים נמוכים של תאי גזע מנסיגות יכולים להיות מוסברים בחלקו על ידי השתנות תורם. מצד השני, MSCs מדגימות באיכות נמוכות דורש זמן רב יותר בתרבות ובpassaging הוארך להגיע למספר הרצוי של תאים. בכל מקרה, passaging המורחב הוא מקור להזדקנות תא ויכול להוביל לאובדן של בידול פוטנציאל 10. לכן, מותאם פרוטוקולים שיכולים למקסם y תאIELD ולמנוע מהשפעות מזיקות צריכה להיות מפותחות 11,12. כשהתחלנו לעבוד עם MSCs כלבים, שהיינו נדהמתי לראות שעל שלושה בארבע דגימות מח עצם כלבי קרישים, ואילו דגימות קורשים למרבה המזל אדם (אחד מכל עשר) היו שכיחות פחות. מצד השני זה לא היה מפתיע, שנצפינו תשואות נמוכות בהרבה של תאי גזע מדגימות שנקרשו. כדי לפתור את הבעיה החוזרת של דגימות קורשים, שפיתחנו הפרוטוקול באמצעות האוריקינאז תרופת thrombolytic במקום דגימה מחדש. טיפולים הטרומבוליטיות יכולים לנטרל מצבי מסכני חיים כגון חסימה של כלי דם גורמים התקף לב, שבץ או תסחיפים בגלל קרישה לא רצויה. הם עובדים על ידי פירוק של קרישים דרך מחשוף האנזימטית של הפיברין על ידי מפעילי פלסמין ופלסמינוגן האנזימטית. למרות השימוש הרחב לטיפול בחולים, רק מעט מאוד פרסומים קיימים שפעילות thrombolytic מנוצלתעבור יישומי מעבדה כדי להציל דגימות קורשות, בעיקר מתמקד לימפוציטים. בשינה 1987, Niku et al. תיארתי את השימוש בstreptokinase להמסת קרישי דם וכתוצאה מכך לימפוציטים תפקודיים 13 וארבע שנים מאוחר יותר, De Vis et al. הרחיב את השימוש בstreptokinase לבודד תאי סרטן דם מהדם ומח עצם עבור יישומי הזרימה cytometric 14. פרסום האחרון יותר מצביע על השימוש בAlteplase לאבחון הסרטן 15. תוך שימוש באותה הגישה האנזימטית, הפרוטוקול שלנו מתמקד בבידוד של מח עצם צורת multipotent MSCs לספק כלי לחוקרים בתחום תאי גזע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="674">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Basal Medium Components</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">PenStrep 100X</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Human FGF-basic</td>
			<td style="width:227px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine</td>
			<td style="width:227px;">Amimed</td>
			<td style="width:119px;">1-23S50-I</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:328px;">FBS Heat Inactivated</td>
			<td style="width:227px;">Amimed</td>
			<td style="width:119px;">2-01F36-I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1907</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Adipogenic Medium Components</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td>
			<td style="width:227px;">Amimed</td>
			<td style="width:119px;">1-26F09-I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Insulin&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I5500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Rabbit serum&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16120099</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Biotin&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B4639</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Rosiglitazone&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2408</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Pantothenate&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5155</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oil Red-O&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Osteogenic Medium Components</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">&#223;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:328px;">Silver nitrate (AgNO3)</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chondrogenic Medium Components</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Biopad - sponge shaped medical device&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Euroresearch</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">L-proline&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5607</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Insulin-Transferrin-Selenium X</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51500056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Human transforming growth factor-&#946;1&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-21</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Alcian Blue 8GX</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3157</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Nuclear fast red</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Generic</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tri-Sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A3901</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">PBS</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">964.9100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Urokinase</td>
			<td style="width:227px;">Medac</td>
			<td style="width:119px;">1976826</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:227px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Giemsa stain</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A0885</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A0877</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sulfuric acid (H2SO4)</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A0655</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1584</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A3618</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidine hydrochloride</td>
			<td style="width:227px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1499</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Consumables</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">50 mL reaction tube</td>
			<td style="width:227px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">SCT-50ML-25-S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:227px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4606108V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Sterican needle (22G)</td>
			<td style="width:227px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4657624</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">1.7 mL Microtubes</td>
			<td style="width:227px;">Brunschwig</td>
			<td style="width:119px;">MCT-175-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">100 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">6.05935</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">sterile forceps</td>
			<td style="width:227px;">Bastos Viegas, SA</td>
			<td style="width:119px;">489-001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">sterile scalpel</td>
			<td style="width:227px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">5518059</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Primaria cell cuture dish</td>
			<td style="width:227px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353803</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">C-Chip Neubauer Improved</td>
			<td style="width:227px;">Bioswisstech</td>
			<td style="width:119px;">505050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">cell culture flask - Flask T300</td>
			<td style="width:227px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">90301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;"></td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Equipment</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Microbiological biosafety cabinet class II</td>
			<td style="width:227px;">Skan</td>
			<td style="width:119px;">82011500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">water bath</td>
			<td style="width:227px;">Memmert</td>
			<td style="width:119px;">1305.0377</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Stripettes Serological Pipette 5ml</td>
			<td style="width:227px;">Corning</td>
			<td>4487-200ea</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">microscope</td>
			<td style="width:227px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">CKX41</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">humidified incubator Heracells 240</td>
			<td style="width:227px;">Thermo scientific</td>
			<td>51026331</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Heraeus Multifuge 1S-R</td>
			<td style="width:227px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004331</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enzymatic method to rescue mesenchymal stem cells from clotted bone marrow samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

העובדות כי 74% מהדגימות מח עצם כלבים (n = 54) הכילו קרישים כאשר הם הגיעו למעבדה (איור 1 א) זה יחד עם ירידה בתשואות MSC מדגימות אלה, גרמו לנו להאמין שמספר לא מבוטל של MSCs היה לכוד בתוך קרישים . ואכן, DAPI כתם פשוט של חומר קריש מחולק מאשר את הנוכחות של תאי בעלי גרעין בצפיפות ...

Watch this Scientific Journal Video about An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples at JoVE.com

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

an-enzymatic-method-to-rescue-mesenchymal-stem-cells-from-clotted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K Views.  Swiss Paraplegic Research. Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Video: An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

מרת אפיגנטיים כאמצעי בטוח ופשוט להשיג תאי מפרישי אינסולין פיברובלסטים עור בוגרים

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs with mitochondrial deficient Rho0 cells restored mitotic activity under normal culture conditions. Atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer&#39;s disease, and cancer are age-related diseases that have been reported to be associated with multiple mechanical and functional defects in the cytosol and organelles of a variety of cell types. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a unique cell population from the bone marrow that possess self-renewal capabilities while maintaining their multipotency. The supplementation of senescence cells with young cytoplasm from autologous BMSCs via the fusion of PMVs provides a promising approach to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes. This protocol describes how to prepare PMVs from BMSCs via extrusion through a polycarbonate membrane with 3 &#181;m pores, determine the existence of mitochondria and examine the maintenance of membrane potential within PMVs using a confocal microscope, concentrate PMVs by centrifugation, and carry out the in vivo injection of PMVs into the gastrocnemius muscle of mice.

Age-related diseases are associated with multiple defects in components of the cytoplasm. Here, we present a protocol to prepare plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells. This technique could potentially be used as a means of cytoplasm replacement therapy to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes.

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה Mesenchymal לב מדגימות Bioptic Endomyocardial של שריר הלב Arrhythmogenic חולים

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...