המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה ריינולדס באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ומדע, ומעבדת חן דונג באוניברסיטת טקסס מרכז סרטן MD Anderson לאופטימיזציה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק לJMR מהמכונים הלאומי לבריאות (K22AI104941).

כל הליכי הניסוי מבוצעים תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי משרד בריאות הסביבה והבטיחות באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ומדע. C57BL / 6 עכברים (שנרכשו מNCI) המשמשים לפרוטוקול זה שוכנו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים, וכל הניסויים בבעלי החיים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ו מדע. 1. הכנה של מכשירים, ציוד, וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מעיל 48 היטב או 24 גם עם אנטי CD3 ואנטי CD28 (טבלה 1) בPBS סטרילי, מכסים ולעטוף בparafilm על מנת למנוע אידוי וזיהום, ולאחר מכן דגירה O / N ב 4 o C היום לפני T תא בידוד. לחלופין, h 1 בארות מעיל ב 37 o C. בצע תנאי Th0, Th1, Th2, וiTreg על ידי ציפוי שני אנטי-CD3 ואנטי-CD28 ב1μg / מיליליטר ב0.5-1 מ&quot;ל לטל נפח (צלחת 48-היטב). לTH17, אנחנו בדרך כלל מעיל אנטי-CD3 ב2 מיקרוגרם / מיליליטר ואנטי-CD28 ב1 מיקרוגרם / מיליליטר. הערה: מצאנו כי ריכוז אנטי-CD3 נמוך הוא אופטימלי עבור דור Th1, Th2, וiTreg תוך ריכוז אנטי-CD3 גבוה יותר הוא אופטימלי עבור דור TH17. לפיכך, יש טיטרציה אנטי-CD3 וריכוזים אנטי CD28 ומותאם למעבדות בודדות (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר סט של כלים לנתיחה (מספריים ומלקחיים) על ידי פתרון החיטוי או חומר חיטוי. צינור או כוס קטנה המכילה 70% אתנול יהיה צורך העיקור מהיר של כלים בין ניתוחים. לבסוף, בקבוק תרסיס המכיל 70% אתנול יהיה צורך לחיטוי את פני השטח של העכבר לפני הנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן משטח לנתיחה על ידי לפפה חתיכה שטוחה של קלקר או לוח שעם ברדיד אלומיניום. סיכות או מחטים לנתח משמשות כדי לתקן את בעלי החיים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מאכלים או צלחות לאיסוף tissues. אם רקמות איגום, 60mm מנות נפרדות המכילות 3ml של סטרילית PBS + 1% FBS (PBS +) לרקמות טחול ובלוטות לימפה הוא מספיק. אם רקמות שמירה מעכברים בודדים להפריד, להכין 1ml צלחת 24-המכיל גם של PBS + במספר הרצוי של בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת RPMI מלא לתרבית תאים וטרום חם לפני השימוש (טבלה 1). הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי RPMI אבל מדיה אחרת כגון IMDM וDMEM עשויה להיות יעילה באותה מידה או מעולה בהתאם למעבדה והניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנטימטר Cut 2x2 ריבועים של רשת ניילון עם גודל נקבובית 120 מיקרומטר וחיטוי לעקר (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: אם משתמש בתא המגנטי במהירות הגבוהה מיון מערכת כגון autoMACS להעשרת תאי CD4 +, ריצה טרום חמה ושטיפת מאגרים באמבט מים C 37 o כדי למנוע נזק למכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: העשרה מומלץ להגדיל את התשואה ולהקטין מיון מיון זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלצעדי הכנה, פרט לנתיחה, צריכים להתבצע בברדס רקמת סטרילית תרבות. </li></ol> 2. בידוד של בלוטות לימפה וטחול מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את המספר הדרוש של בעלי חיים באמצעות טכניקה שאושרה על-מוסדי. השתמש C57BL / 6 נקבות עכברים, גיל 5-10 wks, בשל אחוז הגבוה שלהם של תאי T נאיביים ושומן בגוף נמוך יותר בהשוואה לגברים או לעכברים מבוגרים. הערה: תאים שנלקחו מעכברים ממין זכר יהיו לבצע באופן דומה במבחנה והצעדים הפרוטוקול יישארו זהים. נקבות עכברים, ישנים 5-10 wks, בדרך כלל יניבו 3-6 x 10 6 תאי CD4 + T נאיביים לכל עכבר. עם זאת, זנים השונים של עכברים באמצעות עלולים להשפיע על תשואה וביצועים. לדוגמא, תאים מעכברי C57BL / 6 הם טובים יותר ליצירת תאי Th1 תוך תאים מעכברי Balb.c טובים יותר ליצירת תאי Th2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את הגפיים של בעלי החיים ולהצמיד אותם במקום, כפי שמוצג באיור 1. חותך את העור ארוךitudinally מפי הטבעת לסנטר והקפד לא לנקב רקמות עמוקות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות לפתוח את העור עם מלקחיים ולהצמיד את העור במקום לאפשר גישה קלה לבלוטות הלימפה, כפי שמוצגת באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את בלוטות לימפה נגישות מהמקומות שמוצגים באיור 1. תופסת הבלוטה לימפה עם זוג המלקחיים תוך הפרדת רקמות עם עוד זוג המלקחיים תאפשר להסרת קלה. הנח את הרקמה בצלחת האוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את הטחול מהמיקום שמוצג באיור 1. במקרה זה, יש צורך בחיתוך זהיר להצפק כדי לקבל גישה לטחול. הנח את הרקמה בצלחת אוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך אם יותר רקמות תהיה לקצור. אחרת להמשיך לשלבים הבאים. בשלב זה, לבצע את כל השלבים הנותרים על קרח עד הציפוי של תאי T לאחר המיון. </li></ol> 3. עיבוד רקמות וCD4 + העשרה<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את בלוטות הלימפה וטחול במנות שונות כדי להגדיל את התשואה וההכנות בלוטה לימפה תא אינו דורשות תמוגה כדורית אדומה, אשר עלול לגרום למוות לויקוציטים קטין. לכן, בשלבים הבאים מתארים שיטה לעיבוד אוכלוסיות טחול ובלוטות לימפה בנפרד ואחריו שילוב לפני תיוג למיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הרקמה (טחול או בלוטות לימפה ותקווינה) מצלחת האוסף ומניחים בצלחת 60 מ&quot;מ חדשה המכילה 3 מיליליטר של PBS +. הנח זווית של ניילון סטרילי רשת על הרקמות באמצעות מלקחיים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צד האגודל של בוכנת מזרק (3-10 מיליליטר) ובעדינות לנפץ את הרקמה נגד הרשת. כמעט כל הרקמה צריך ללכת להשעיה. לחלופין, הנח את הרקמה בין שתי שקופיות חלבית autoclaved וחרק להשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבור את הגושים מסיסים שנותרו. מניחים חתיכה מרובעת חדשה של רשת ניילון על הפתיחהצינור חרוטי 15 מ&quot;ל ולסנן את ההשעיה דרך להסיר את הפסולת שנותרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2-4 לבלוטה לימפה נוספת ורקמת טחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שההשעיה סוננה לתוך צינור 15 מ&quot;ל למלא את שארית הצינור עם PBS + ולהפוך כמה פעמים. צנטריפוגה התאים ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי טחול, לשאוב צנטריפוגה הבאה supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של קר כקרח פתרון 1X ACK לטחול דקות 1 לlyse אריתרוציטים. לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS + על גבי ACK, להפוך את הצינור, ו צנטריפוגות 475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי בלוטה לימפה, לשאוב supernatant וגלול ב2ml של PBS +. אם ארצה ניתן לשלב הבאים עם תאי הטחול לאחר תמוגה ACK שלהם ושלב כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה של splenocytes וגלול בעוד 10 מיליליטר של PBS +. בשלב זה ההשעיה בלוטות לימפה יכולה להיותdded על גבי ההשעיה הטחול אם נדרש איגום רקמה למיון. צנטריפוגות הצינור שוב ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא גלולה עכשיו יכול להיות מוכן להעשרת CD4. אם שלב זה לא יבוצע, להמשיך לשלבי הכנת המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשרת CD4 באמצעות מערכת מיון תא המגנטית במהירות הגבוהה, resuspend גלולה הסלולרי עם חרוזים CD4. בדרך כלל 15 μl של חרוזים מדוללים ב -85 μl של PBS + משמש לתייג רקמות מהעכבר 1. כבש את הנפח של תערובת חרוז לפי צורך, resuspend גלולה, ודגירה של 15-30 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS +, להעביר את ההשעיה דרך ניילון לתוך צינור 15 מיליליטר חדש כדי להסיר שאריות, וצנטריפוגות שוב ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב+ של PBS לכל עכבר 100 μl ולהמשיך לבחירה חיובית על מערכת תא מגנטי במהירות הגבוהה מיון. אם אתם משתמשים במערכת הפרדה ידנית, וollow הוראות היצרן להעשרה. לחלופין, resuspend הדגימות במאגר FACS: PBS עם 1 המ&quot;מ EDTA (pH = 8) ו -1% BSA, מסונן סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק החיובי ולשטוף שוב עם 10 מ&quot;ל של PBS +. חלק CD4 + המועשר מוכן להיות מתויג למיון עכשיו. </li></ol> 4. תאי המיון הנאיביים CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית התא גלולה עם PBS + נוגדני ניאון מכילים מכוונים נגד CD62L, CD44, CD25, וCD4. אם באמצעות הנוגדנים המופיעים בטבלה 1, דילולים עבור כל מסופקים. עבור מכתים, 100 μl נפח של הקוקטייל של הנוגדנים משמש לרקמות מעכבר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בקוקטייל של נוגדנים ודגירה של 15-30 דקות ב 4 o C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 10 מ&quot;ל של PBS + ו צנטריפוגות 475 XG במשך 5 דקות ב 4 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התערובת מעל מכסה מסנן ניילון או מסננת תא אחר מחדשלהעביר כל שאריות פסולת. פיפטה התאים שכותרתו לתוך צינור שתואם לסדרן התא. שמור את התאים על קרח ומוגן מפני האור עד הסוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות אוסף ידי pipetting 1-2ml של תקשורת RPMI מלאה או FBS לתוך החלק התחתון של צינורות תואמים לאוסף על סדרן תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין תאי CD4 + T הנאיביים כCD4 + CD25 - CD62L + CD44 - אוכלוסייה (איור 2). שוטף את התאים שנאספו עם תקשורת RPMI מלאה ו צנטריפוגות כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בRPMI המלא, לספור את התאים הנאיביים, ולהתאים את הריכוז עד 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li></ol> 5. הגדרת הבידול במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הבארות של הצלחות המצופים אנטי CD3 ואנטי CD28 ולשטוף היטב עם כל 1ml של PBS סטרילי (לא FBS). לצלחות 48-היטב, צלחת 0.5 x 10 6 תאים / גם ב 0.5 מיליליטר של RPMI. לצלחות 24 גם, תרבות 1 x 10 6 תאים / גם ב1.0 מיליליטר של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בודק את ההשפעה של גורם כגון סמים להוסיף חומר לבארות המתאימות גם לפני, במהלך או אחרי תהליך ההתמיינות בהתאם לניסוי. בשלב הבא, להשלים את תרבות התקשורת עם ציטוקינים ונוגדני חסימה בהתאם. Th0: 30 U / ml Hil-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml Hil-2, ו5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml Hil-2, 2,000 ng / ml המסיס 37.51, וng 5000 / XMG1.2 מיליליטר. iTreg: 15-2 Hil, 5,000 XMG1.2 מיליליטר / ng, ו5,000 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml ng / ml 11B11. TH17: 20 / מיליליטר rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 XMG1.2 מיליליטר / ng, ו5,000 ng ng / ml 11B11. הערה: התנאים שהוצגו לעיל נמצאו אופטימלי למקסם את ייצור ציטוקינים כפי שנמדד בסוף ניסוי הבידול (סעיף נציגי תוצאות). עם זאת, כל מצב צריך להיות מותאם למעבדות (טבלה 2 בודדות </strong&gt;). יתר על כן, התוספת של אנטי CD28 המסיס בנוסף לאנטי-CD28-מחויב הצלחת כבר נמצאה לשפר את ייצור ציטוקינים Th2 במעבדה שלנו, אבל אין לו השפעה על תת תא T אחר: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על C 37 o עם 5% CO 2 4-5 ד לפני הניתוח של ביטוי גנים וייצור ציטוקינים. לחלופין, להסיר את התאים מגירויי TCR לאחר 2 ד, מותאם ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר עם תקשורת טרי, וצלחת בבארות חדשות (לא מצופה) כדי לשפר את ההתפשטות ותשואה סופית. במקרה זה, ציטוקינים קיטוב טריים ונוגדנים אינם נחוצים, אבל 10 U / ml של IL-2 יש להוסיף לאמצעי תקשורת החדש לTh0, Th1, Th2, ותרבויות iTreg. </li></ol> 6. ניתוח של בידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ציטוקינים על ידי cytometry זרימה, restimulate היטב עם כל 10ng / ml PMA ו1,000 ng / ml ionomycin או טבלה / מיליליטר אנטי-CD3 במשך 4-6 שעות בנוכחות מעכב Golgi כגון brefeldin (1 מיקרוגרם1). לבצע מכתים ציטוקינים תאיים תלוי בניסוי (איור 3). הערה: כתם שאינה שושלת ספציפית ציטוקינים או גורמי שעתוק, כגון IL-4 (לא מוצגים) וIFNγ (איור 3) לתרבויות TH17, לכל מצב כפקדים שליליים וכמדד ליעילות בידול. יתר על כן, Foxp3 כתם לתרבויות TH17 כפיתוח ההדדי של Tregs עלול להתרחש בתוספת TGFβ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכימות חלבון, לאסוף supernatants מכל assay היטב ועל ידי ציטוקינים ספציפיים ELISA (איור 3). אם קיים חשש שהגורם נבדק השפיע שגשוג בהשוואה לדגימות בקרה, ניתן לכבס את התאים, נספרו, מנורמל, ולאחר מכן restimulated עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-CD3 במשך 24 שעות לפני איסוף supernatants למבחני ELISA. אם מנסה לאמוד IL-4 מTh2 תנאים, כביסה וrestimulating יש צורך להסיר IL-4 שעשויות להיות leftover מתרבות הבידול הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ביטוי גנים על ידי PCR בזמן אמת, תאי קציר לאחר תקופת הדגירה, לשטוף, לנרמל, ולעורר מחדש במשך 2-6 שעות עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-CD3 לפני mRNA קציר (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+murine+helper+T+cell+clone.+I.+Definition+according+to+profiles+of+lymphokine+activities+and+secreted+proteins.">Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins.</a> J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).</li><li>Dong, C., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+decision:+T-helper+1+and+2+subsets+in+immune+responses.">Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses.</a> Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).</li><li>Hsieh, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+TH1+CD4++T+cells+through+IL-12+produced+by+Listeria-induced+macrophages.">Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages.</a> Science. 260 (5107), 547-549 (1993).</li><li>Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+12+acts+directly+on+CD4++T+cells+to+enhance+priming+for+interferon+gamma+production+and+diminishes+interleukin+4+inhibition+of+such+priming.">Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).</li><li>Szabo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transcription+factor,+T-bet,+directs+Th1+lineage+commitment.">A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment.</a> Cell. 100 (6), 655-669 (2000).</li><li>Afkarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-bet+is+a+STAT1-induced+regulator+of+IL-12R+expression+in+naive+CD4.">T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4.</a> T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+T-bet+is+induced+by+multiple+pathways+and+prevents+an+endogenous+Th2+cell+program+during+Th1+cell+responses.">The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses.</a> Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).</li><li>Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+interleukin+4+(IL-4)-producing+cells+in+vivo+and+in+vitro:+IL-2+and+IL-4+are+required+for+in+vitro+generation+of+IL-4-producing+cells.">Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells.</a> J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).</li><li>Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+directs+the+development+of+Th2-like+helper+effectors.">IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors.</a> J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).</li><li>Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+GATA-3+is+differentially+expressed+in+murine+Th1+and+Th2+cells+and+controls+Th2-specific+expression+of+the+interleukin-5+gene.">Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene.</a> J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).</li><li>Zheng, W., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+is+necessary+and+sufficient+for+Th2+cytokine+gene+expression+in+CD4+T+cells.">The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells.</a> Cell. 89 (4), 587-596 (1997).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li><li>Jiang, S., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+issue+on+CD4(+)+T-cell+subsets.">A complex issue on CD4(+) T-cell subsets.</a> Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).</li><li>Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+Foxp3.">Regulatory T cells and Foxp3.</a> Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).</li><li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance.">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li><li>Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation,+polyendocrinopathy,+enteropathy,+x-linked+syndrome:+a+paradigm+of+immunodeficiency+with+autoimmunity.">Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity.</a> Front Immunol. 3, 211 (2012).</li><li>Shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4+T+cells.">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li><li>Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+CD4++T+cell+lineage+differentiation.">Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation.</a> Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).</li><li>Harrington, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17-producing+CD4++effector+T+cells+develop+via+a+lineage+distinct+from+the+T+helper+type+1+and+2+lineages.">Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).</li><li>Langrish, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation.">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+lineage+of+CD4+T+cells+regulates+tissue+inflammation+by+producing+interleukin+17.">A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).</li><li>Chung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+regulation+of+early+Th17+cell+differentiation+by+interleukin-1+signaling.">Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling.</a> Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).</li><li>Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+signaling+in+T+cells+promotes+autoimmune+inflammation.">Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).</li><li>Reynolds, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4(+)+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1.">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li><li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pathogenic+T(H)17+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling.">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

בעוד הטחול מכיל תאי Th נאיביים, חלקם של אוכלוסייה זו בבלוטות לימפה הוא הרבה יותר גבוה. הכישלון לזהות כראוי ולהסיר בלוטות לימפה בפרוטוקול זה יגרום לתשואה ירודה של תאים נאיביים. זה יכול להיות קשה במיוחד בעכברים מבוגרים או עכברי זכרים שיש לי רקמת שומן יותר. כפי שניתן לראו...

הרעיון של שושלות או תת קבוצות של עוזר CD4 + T מובחנים תאים (ה &#39;) כבר בסביבות מאז שלהי המאה ה -20 1. הכרה של אנטיגן המקור בנוכחות תוצאות אותות costimulatory בכמה סבבים של התרבות תאים וההתמיינות הסופית למפעיל Th תאים. סוג Th תא שנוצר במהלך תהליך זה תלוי בסביבת ציטוקינים נוכחת במהלך ההפעלה 2. בתחילה, תאי Th נאיביים נחשבו ללקטב לתוך 2 שושלות שונות הבאים קולט תא T הפעלה (TCR), קשירת CD28 costimulatory, ואיתות ציטוקינים. תאים מסוג 1 עוזר (Th1) מתאפיינים בייצור שלהם מפעיל של ציטוקינים IFNγ כמו גם הדרישה שלהם לאיתות IL-12 במהלך 3,4 תהליך ההתמיינות. סופו של דבר התברר שיש לי תאי Th1 מובחנים פרופיל גנטי שמאופיין ב מובהק ביותרy הביטוי של גורם שעתוק משפחת תיבת T, Tbx21 (T-הימור), הנחשב לרגולטור הראשי של התכנית הגנטית Th1 5. יתר על כן, IL-12, כמו גם IFNγ יכול לקדם את ביטוי T-הימור 6,7. בתגובה החיסונית, תאי Th1 חשובים להגנה מפני פתוגנים המארח תאיים, כמו גם יזמים חזקים של דלקת אוטואימונית. בניגוד לכך, תאים מסוג 2 עוזר (Th2) דורשים IL-4 לפיתוחם וציטוקינים מפעיל שלהם, כולל IL-4, IL-5, ו- IL-13, הם חשובים לנהיגת תגובות תא B והם פתוגניים באלרגיה 8, 9. בדומה לתאי Th1, תאי Th2 נמצאו להביע רגולטור תעתיק הורים שלהם, כינה Gata-3 10,11. מעניין לציין, כי הנוכחות של ציטוקינים קיטוב והדור של שושלת Th ספציפית הם עוינות להתפתחותם של אחרים 2,12, המצביע על כך רק קבוצת משנה Th מסוימת עשויה להיות דומיננטית במהלך מחדש חיסוניsponse. מאז זיהוי של שושלות Th1 וTh2, עבודה נוספת הוכיחה עוד יותר ייחודי תת קבוצות של תאי T helper, כוללים עוזר זקיקים (TFH), IL-9-ייצור (Th9), וIL-22-ייצור (Th22) (לאחרונה בביקורת ב- 13). לצורך ניסויי בידול במבחנה, פרוטוקול זה יתמקד רק בשני תת Th נוסף, המכונה תאי T רגולטורים (Treg) וIL-ייצור-17 תאי CD4 + T (TH17). CD25 + תאי T רגולטורים יכולים להתרחש באופן טבעי (nTreg) בבלוטת התימוס; תאי Th נאיביים יכולים להיות גם מושרה (iTreg) להפוך לרגולציה בפריפריה (שנסקרה ב14,15). שני הסוגים של Tregs להביע גורם שעתוק אופייני, כינה P3 forkhead התיבה (Foxp3), שהוא קריטי למנגנוני דיכוי מפעיל שלהם הכוללים ייצור אנטי דלקתי מסיס מתווך, IL-2 הצריכה, ותא מנגנוני קשר תלוי 14,15. חוסר Foxp3 תוצאות ביטוי בהפרעה אוטואימונית חמורה, רב-איבר כינו dysregulation חיסוני, polyendocrinopathy, enteropathy, תסמונת X-צמוד (אייפקס), הממחישה את התפקיד הקריטי של קבוצת משנה Th זה בפתרון דלקת והסדרת סובלנות היקפית לעצמי אנטיגנים 16. במבחנה, תאי CD4 + T helper נאיביים להסדיר את-Foxp3 ולהיות מחויבים לתכנית Treg על גירוי עם IL-2 וTGF-β 14,15. ייתכן שיש מתון לפלסטיות רבה בשושלות תאי CD4 + T, במיוחד כאשר בוחנים ייצור ציטוקינים רק (שנסקר ב17,18). עם זאת, למטרות פרוטוקולי בידול במבחנה, נדונונו בכל תת-קבוצה כשושלת ייחודית. לאחרונה, קבוצת משנה של תאי TH17 שמייצר ציטוקינים IL-17 זוהתה כשושלת ייחודית עם פונקציות פרו-דלקתיות הבמיוחד פתוגניים בדלקת אוטואימונית 19-21. תאי TH17 להביע גורם שעתוק ייחודי, t גמא קולט היתום הקשורות retinoid מכונה (RORγt) המרכז את התכנית הגנטית TH17 22. TGFβ חשוב לדור של שושלת TH17 דרך האינדוקציה של RORγt. עם זאת, ההשפעה של איתות TGFβ הוא האמין כדי לגרום רק מחויבות TH17 על synergizing עם IL-6 (הנסקרת ב 12). מחקרים נוספים הראו כי מגוון רחב של אותות אחרים שיכולה באופן חיובי להסדיר את מחויבות TH17, כולל IL-1β, נתרן מוגבר, וTLR איתות 23-26. דיווחים אחרים לא הציעו כי תאי TH17 פתוגניים in vivo הם אלה שלמעשה לעקוף איתות TGFβ ובמקום להסתמך על שילוב של IL-1, IL-6, IL-23 והבידול שלהם 27. כך, תאי TH17 ניתן לגזור ממגוון רחב של מסלולי איתות; מסלול למטרות פרוטוקול זה, משמש בדרך כלל-(TGFβ וIL-6) למחויבות שושלת TH17יוצג. פרוטוקולי הבידול מתוארים להלן לכל שושלות מפעיל מסתמך על נוגדנים קבועים כגירויים לTCR וCD28 במהלך הקורס כולו של הניסוי. עם זאת, אחרים הראו כי הפעלת TCR עם תאי מציגי אנטיגן 28 או אנטי-CD3 ונוגדנים נגד CD28 עם נוגדן אוגר cross-linking במשך 2 ימים 29 גם אמצעי היעיל ביותר לגרימת הדור של תת Th השונים. הפרוטוקול המובא כאן מתבסס על שיטות שדווחו בעבר לבידוד תאי CD4 + T עכבריים מאיברי הלימפה משניים 30 ויצירת תאי TH17 31. אחד הבדלים עיקריים הוא שפרוטוקול זה מסתמך על השימוש בסדרן תא לבודד תאי CD4 + T נאיביים מרקמות הלימפה. עם זאת, חברות רבות מציעות כעת ערכות הפרדה מהירות שיכול להעשיר לתאי CD4 + T הנאיבי, שייתכן שתוכל לעקוף את דרישת fאו מיון בהתאם לניסוי. השיטות וחומרים הכימיים שהוצגו בפרוטוקול זה מה שאנחנו משתמשים באופן שיגרתי ולמצוא להיות היעיל ביותר. עם זאת, יש לזכור כי חומרים כימיים ושיטות אלטרנטיביים קיימות עבור רבים מהצעדים שיוצגו להלן וזה תלוי למעבדה בודדת כדי לקבוע מה יעבוד הכי טוב למטרות שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete RPMI:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 micron nylon mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0120-10YD</td>
			<td>Cut into 2 cm2 squares and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative: 100 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td>Alternative to cutting nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS rinsing solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 beads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human (h) IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-12</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>210-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTGFb</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C11 (anti-CD3)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37.51 (anti-CD28)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11B11 (anti-IL-4)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD62L-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104406</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102008</td>
			<td>Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-PerCP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100434</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103012</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol&#160; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8139</td>
			<td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-0634</td>
			<td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4506-51</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

הנקודה לניתוח הבידול יכול להשתנות בהתאם למצב Th הזמן נבדק, כמו גם את הכוח של הפעלת קולטן תא T. לאחר 2-3 ימים של בידול, ניתן דמיינו תאים על ידי מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את מידת התפשטות תאי T. ולס מציג התפשטות ויצירת גושים נרחבות של תאים יהיה ככל הנראה מוכן לניתוח ביום 4. תנאי ב...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse NaÃƒÂ¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets at JoVE.com

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.7K Views.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

Video: Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

הכנת CD4<sup&gt; +</sup&gt; T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

<meta charset="utf8"></head><body>התמיינות תאי Th17 מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות ציטומטריית זרימה

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: השגת התמיינות במבחנה ברמת טוהר גבוהה של תאי Th17 באמצעות אפנון ריכוז ציטוקינים

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4+ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...