Name: mouse naïve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets
Uploaded: 2015-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse NaÃƒÂ¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Reynolds a Rosalind Franklin University of Medicine and Science, e il laboratorio di Chen Dong presso l&#39;Università del Texas MD Anderson Cancer Center per l&#39;ottimizzazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per JMR dal National Institutes of Health (K22AI104941).

Tutte le procedure sperimentali sono eseguite utilizzando protocolli approvati dall&#39;ufficio di salute ambientale e sicurezza presso l&#39;Rosalind Franklin University of Medicine and Science. C57BL / 6 topi (acquistato da NCI) utilizzato per questo protocollo è stato ospitato in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti utilizzando i protocolli approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l&#39;Rosalind Franklin University of Medicine and Science. 1. Preparazione di strumenti, accessori e reagenti <ol><li> Coat 48 pozzetti o 24 pozzetti piastre con anti-CD3 e anti-CD28 (Tabella 1) in PBS sterile, coperchio e avvolgere in parafilm per evitare l&#39;evaporazione e la contaminazione, e poi incubare O / N a 4 ° C il giorno prima T isolamento delle cellule. In alternativa, i pozzetti cappotto 1 ora a 37 ° C. Eseguire condizioni Th0, Th1, Th2, e iTreg rivestendo sia anti-CD3 e anti-CD28 a 1 ug / ml in 0,5-1 ml diVolume tal (piastra 48 pozzetti). Per Th17, di solito cappotto anti-CD3 a 2 mg / ml e anti-CD28 a 1 mg / ml. NOTA: Abbiamo scoperto che una concentrazione di anti-CD3 inferiore è ottimale per la generazione Th1, Th2, e iTreg mentre una maggiore concentrazione anti-CD3 è ottimale per la generazione Th17. Così, anti-CD3 e anti-CD28 concentrazioni dovrebbero essere titolati e ottimizzati per i singoli laboratori (Tabella 2). </li><li> Sterilizzare un insieme di strumenti di dissezione (forbici e pinze) per la soluzione in autoclave o disinfettante. Saranno necessari un tubo o un piccolo bicchiere contenente etanolo al 70% per una rapida sterilizzazione di strumenti tra dissezioni. Infine, sarà necessaria una bottiglia spray contenente 70% di etanolo per sterilizzare la superficie del mouse prima dissezione. </li><li> Preparare una superficie di dissezione avvolgendo un pezzo di polistirolo o sughero in fogli di alluminio. Perni dissezione o aghi vengono utilizzati per fissare l&#39;animale in luogo. </li><li> Preparare piatti o piastre per la raccolta di tiUESTIONI. Se i tessuti pooling, separati 60 millimetri piatti contenenti 3 ml di PBS sterile + 1% FBS (PBS +) per milza e linfonodi tessuti è sufficiente. Se mantenendo tessuti da singoli topi separati, preparare un 1ml 24-pozzetti contenenti di PBS + il numero desiderato di pozzetti. </li><li> Preparare i media RPMI completo per colture cellulari e pre-caldo prima dell&#39;uso (Tabella 1). NOTA: Noi abitualmente utilizziamo RPMI ma altri media come IMDM e DMEM può essere altrettanto efficace o superiore a seconda del laboratorio e l&#39;esperimento. </li><li> Cut 2x2 cm quadrati di nylon ingranano con una dimensione dei pori e autoclave a 120 micron per sterilizzare (Tabella 1). </li><li> Opzionale: se si utilizza il cellulare magnetico ad alta velocità del sistema di smistamento come autoMACS per l&#39;arricchimento di cellule CD4 +, corsa pre-caldo e risciacquo buffer in un bagno d&#39;acqua C 37 o per evitare danni alla macchina. </li><li> NOTA: arricchimento si consiglia di aumentare il rendimento di smistamento e ridurre i tempi di ordinamento. </li><li> Tuttopassaggi di preparazione, fatta eccezione per la dissezione, devono essere eseguite in una cappa coltura tissutale sterili. </li></ol> 2. Isolamento dei linfonodi e della milza di topi <ol><li> Euthanize il numero di animali utilizzando una tecnica istituzionalmente approvato. Utilizzare C57BL / 6 topi di sesso femminile, di età 5-10 settimane, a causa della loro alta percentuale di cellule T naive e grasso corporeo inferiore rispetto ai maschi o ai topi anziani. NOTA: Le cellule derivate da topi maschi si esibiranno in modo simile in vitro e le fasi del protocollo rimangono gli stessi. Topi femmina, 5-10 settimane vecchie, in genere produrrà 3-6 x 10 6 naïve cellule CD4 + T per mouse. Tuttavia, utilizzando diversi ceppi di topi possono influenzare il rendimento e le prestazioni. Per esempio, cellule di topi C57BL / 6 sono migliori per la generazione di cellule Th1 mentre le cellule da topi Balb.c sono migliori per generare cellule Th2. </li><li> Distribuire gli arti dell&#39;animale e perno in posizione, come mostrato in Figura 1. Tagliare la pelle lungoitudinally dall&#39;ano al mento facendo attenzione a non forare tessuti più profondi. </li><li> Diffusione aprire la pelle con una pinza e pin la pelle in atto per permettere un facile accesso ai linfonodi come mostrato in Figura 1. </li><li> Raccogliere linfonodi accessibili dalle posizioni indicate nella figura 1. Afferrando linfonodo con un paio di pinze, mentre la separazione dei tessuti con un altro paio di pinze permette una facile rimozione. Posizionare il tessuto nel piatto di raccolta. </li><li> Raccolto milza dalla posizione mostrata in figura 1. In questo caso, il taglio attenzione nel peritoneo è necessario per ottenere l&#39;accesso alla milza. Posizionare il tessuto in un piatto di raccolta. </li><li> Ripetere la procedura se saranno raccolte più tessuti. Altrimenti procedere con i passi successivi. A questo punto, eseguire tutte passaggi rimanenti in ghiaccio fino fasciame delle cellule T dopo la cernita. </li></ol> 3. Tissue Processing e CD4 + arricchimento<ol><li> Trattare i linfonodi e la milza in piatti diversi per aumentare la resa di preparazioni di cellule linfonodali non richiedono eritrociti lisi, che possono provocare la morte dei leucociti minore. Pertanto, le seguenti operazioni descrivono un metodo per il trattamento della milza e dei linfonodi popolazioni seguiti separatamente unendo prima di etichettatura per l&#39;ordinamento. </li><li> Rimuovere il tessuto (milza o linfonodi aggregati) dal piatto di raccolta e posto in un nuovo piatto 60 millimetri contenente 3 ml di PBS +. Inserire un quadrato di nylon sterile maglia sopra il tessuto con pinze sterilizzate. </li><li> Prendete il lato del pollice di un stantuffo della siringa (3-10 ml) e distruggere il tessuto delicatamente contro la rete. Quasi tutto il tessuto dovrebbe andare in sospensione. In alternativa, posizionare il tessuto tra due vetrini smerigliati autoclavato e rettificato in sospensione. </li><li> Pipettare la sospensione su e giù per un paio di volte per rompere i grumi solubili rimanenti. Inserire un nuovo pezzo quadrato di maglia di nylon sopra l&#39;apertura di unTubo da 15 ml e filtrare la sospensione attraverso per rimuovere i detriti rimanenti. </li><li> Ripetere i passaggi 2-4 per linfonodi supplementare e tessuto splenico. </li><li> Una volta che la sospensione è stata filtrata in un tubo 15ml riempire il resto del tubo con PBS + e invertire alcune volte. Centrifugare le cellule a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Per le cellule spleniche, aspirare il surnatante dopo centrifugazione e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di soluzione ghiacciata 1X ACK per milza per 1 min per lisare gli eritrociti. Aggiungere quindi 10 ml di PBS + sulla parte superiore del ACK, invertire il tubo, e centrifugare 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Per le cellule linfonodali, aspirare il surnatante e risospendere in 2 ml di PBS +. Se lo si desidera questi possono essere combinati con le cellule della milza dopo la loro lisi ACK e lavaggio. </li><li> Aspirare il surnatante dopo centrifugazione dei splenociti e risospendere in altri 10 ml di PBS +. A questo punto la sospensione linfonodo può esseredded sulla parte superiore della sospensione milza se è richiesto il pool di tessuto per l&#39;ordinamento. Centrifugare il tubo di nuovo a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Il pellet cellulare può essere preparato per CD4 arricchimento. Se non viene eseguita questa operazione, passare alle fasi di preparazione di smistamento. </li><li> Per CD4 arricchimento utilizzando il sistema cell sorting magnetico ad alta velocità, risospendere il pellet cellulare CD4 con perline. Tipicamente 15 ml di perline diluito in 85 ml di PBS + è usato per etichettare i tessuti dal 1 mouse. Rampa il volume della miscela sferette, se necessario, risospendere il pellet, e incubare per 15-30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS +, passare la sospensione attraverso nylon in un nuovo tubo 15 ml per rimuovere i detriti e centrifugare di nuovo a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere il precipitato in 100 ml di PBS + per topo e procedere alla selezione positiva sul sistema di smistamento cellulare magnetica ad alta velocità. Se si utilizza un sistema di separazione manuale, fsusseguirsi le istruzioni del produttore per l&#39;arricchimento. In alternativa, risospendere i campioni di tampone FACS: PBS con 1mM EDTA (pH = 8) e 1% BSA, sterile filtrata. </li><li> Rimuovere la frazione positiva e lavare di nuovo con 10 ml di PBS +. La frazione arricchita CD4 + è ora pronto per essere etichettato per l&#39;ordinamento. </li></ol> 4. cellule Ordinamento Naïve CD4 + T <ol><li> Etichettare il pellet di cellule con PBS + anticorpi fluorescenti contenenti diretti contro CD62L, CD44, CD25, e CD4. Se utilizzando gli anticorpi elencati nella Tabella 1, sono forniti diluizioni per ciascuno. Per la colorazione, un volume di 100 ml di cocktail anticorpo viene utilizzato per tessuti da un mouse. </li><li> Risospendere il pellet in cocktail di anticorpi e incubare per 15-30 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS + e centrifugare 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Passare il composto sopra un altro filtro di nylon o filtro cella cap rispostare i detriti avanzi. Pipettare le cellule marcate in un tubo che è compatibile per il cell sorter. Mantenere le cellule in ghiaccio e protetti dalla luce fino al genere. </li><li> Preparare tubi di raccolta pipettando 1-2 ml di mezzi completi RPMI o FBS nel fondo dei tubi compatibili per la raccolta su un cell sorter. </li><li> Ordina l&#39;ingenuo cellule CD4 + T come CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - popolazione (Figura 2). Lavare le cellule raccolte con mezzi completi RPMI e centrifugare come descritto sopra. </li><li> Risospendere il pellet in completo RPMI, contare le cellule naive, e regolare la concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol> 5. Impostare la differenziazione in vitro <ol><li> Aspirare i pozzetti delle piastre rivestite anti-CD3 e anti-CD28 e lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS sterile (senza FBS). Per piastre 48 pozzetti, piastra 0,5 x 10 6 cellule / pozzetto in 0,5 ml di RPMI. Per piastre da 24 pozzetti, cultura 1 x 10 6 cellule / pozzetto in 1,0 ml di RPMI. </li><li> Se testare l&#39;influenza di un elemento quale un farmaco aggiungere la sostanza ai pozzetti appropriati sia prima, durante o dopo il processo di differenziazione seconda dell&#39;esperimento. Avanti, integrare il terreno di coltura con citochine e anticorpi bloccanti conseguenza. Th0: 30 U / ml di hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml di hIL-2, e 5.000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml di hIL-2, 2,000 ng / ml solubile 37.51, e 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml HIL-2, 5.000 ng XMG1.2 / ml, e 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5.000 ng XMG1.2 / ml, e 5.000 ng / ml 11B11. NOTA: Le condizioni sopra esposte sono risultati essere ottimale per massimizzare la produzione di citochine misurata alla fine dell&#39;esperimento differenziazione (sezione Risultati rappresentativi). Tuttavia, ogni condizione deve essere ottimizzato per i singoli laboratori (Tabella 2 </strong&gt;). Inoltre, l&#39;aggiunta di anti-CD28 solubile in aggiunta al anti-CD28 piastra-bound è stato trovato per migliorare la produzione di citochine Th2 nel nostro laboratorio, ma non ha alcun effetto su altri sottogruppi di cellule T: </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C con il 5% di CO 2 per 4-5 d prima analisi dell&#39;espressione genica e della produzione di citochine. In alternativa, rimuovere le cellule dagli stimoli TCR dopo 2 d, rettificato per 1 x 10 6 cellule / ml con mezzi freschi, e la piastra in nuovi pozzi (non rivestito) per migliorare la proliferazione e la resa finale. In questo caso, le citochine polarizzanti fresche e gli anticorpi non sono necessari, ma di 10 U / ml di IL-2 dovrebbero essere aggiunti nuovi media per Th0, Th1, Th2, e culture iTreg. </li></ol> 6. Analisi della Differenziazione <ol><li> Per l&#39;analisi di citochine mediante citometria a flusso, restimolare ogni pozzetto con 10ng / ml PMA e 1.000 ng / ml ionomicina o Tabella / ml anti-CD3 per 4-6 ore in presenza di un inibitore golgi come brefeldina A (1 mg1). Eseguire intracellulare colorazione citochine seconda dell&#39;esperimento (Figura 3). NOTA: Stain citochine o fattori di trascrizione, quali IL-4 (non mostrato) e IFNγ non specifico lineage (Figura 3) per colture Th17, per ciascuna condizione come controlli negativi e come indicatore dell&#39;efficienza differenziazione. Inoltre, macchia Foxp3 per culture Th17 come lo sviluppo reciproco delle Tregs può verificarsi con l&#39;aggiunta di TGFβ. </li><li> Per la quantificazione delle proteine, raccogliere il surnatante da ogni dosaggio bene e specifici citochine ELISA (Figura 3). Se si teme che il fattore in fase di test ha influenzato la proliferazione rispetto a campioni di controllo, le cellule possono essere lavati, contati, normalizzata, e quindi restimolati con 1 mg / ml di anti-CD3 per 24 ore prima di raccogliere surnatanti per test ELISA. Se saggiare IL-4 da Th2 è necessaria condizioni, lavaggio e restimolare rimuovere IL-4 che può essere leftover dalla cultura iniziale differenziazione. </li><li> Per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica mediante real time PCR, le cellule raccolto dopo il periodo di incubazione, lavare, normalizzano, e ri-stimolano per 2-6 h con 1 mg / ml di anti-CD3 prima della raccolta mRNA (Figura 3). </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4(+)+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1.">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li><li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pathogenic+T(H)17+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling.">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Mentre la milza contiene cellule Th naïve, la percentuale di questa popolazione in linfonodi è molto più alta. La mancata corretta identificazione e rimozione dei linfonodi in questo protocollo si tradurrà in una scarsa resa di cellule naïve. Questo può essere particolarmente difficile in topi di età superiore o topi maschi che hanno più tessuto grasso. Come mostrato in Figura 1, fissaggio e spinatura corretta degli arti animali e la pelle consentirà di facilitare la visualizzazione dei linfono...

Il concetto di linee o di sottoinsiemi di CD4 + T helper distinti (gi), le cellule è stato intorno dal momento che la seconda metà del 20 ° secolo 1. Riconoscimento dell&#39;antigene cognate in presenza di segnali di costimolazione risultati in vari cicli di proliferazione cellulare e l&#39;eventuale differenziazione in cellule effettrici Th. Il tipo di cellule Th generati durante questo processo dipende sull&#39;ambiente citochina presente durante l&#39;attivazione 2. Inizialmente, le cellule Th naive sono stati pensati per polarizzarsi in 2 linee distinte seguenti recettore delle cellule T (TCR) attivazione, costimolazione CD28 legatura, e la segnalazione di citochine. 1 le cellule helper tipo (Th1) sono caratterizzati dalla loro produzione effettore della citochina IFNγ nonché la loro esigenza di IL-12 di segnalazione durante il processo di differenziazione 3,4. Alla fine si è scoperto che le cellule Th1 differenziate hanno un profilo genetico che è più tipicamente caratterizzata by l&#39;espressione del fattore di trascrizione famiglia scatola T, Tbx21 (T-bet), che è considerato il principale regolatore del programma genetico Th1 5. Inoltre, IL-12 e IFNγ può promuovere espressione T-bet 6,7. Nella risposta immunitaria, le cellule Th1 sono importanti per la difesa contro i patogeni intracellulari e forti promotori di infiammazione autoimmune. In contrasto, cellule helper di tipo 2 (Th2) richiedono IL-4 per il loro sviluppo e le citochine effettrici, tra IL-4, IL-5 e IL-13, sono importanti per guidare le risposte delle cellule B e sono patogeni allergia 8, 9. Simile a cellule Th1, le cellule Th2 sono stati trovati ad esprimere la propria principale regolatore trascrizionale, chiamato GATA-3 10,11. È interessante notare la presenza di citochine polarizzanti e la generazione di una specifica linea Th sono antagonisti allo sviluppo di altri 2,12, suggerendo che solo un particolare sottoinsieme Th può diventare dominante durante un re immunitariorisposta. Poiché l&#39;identificazione delle linee Th1 e Th2, ulteriore lavoro ha dimostrato ancora più unica sottogruppi di cellule T helper, incluse follicolare helper (TFH), IL-9-produzione (Th9), e IL-22-produzione (Th22) (recentemente rivisto in 13). Ai fini di esperimenti di differenziazione in vitro, questo protocollo si concentrerà solo su due sottoinsiemi gi altri, chiamati cellule T regolatorie (Treg) e-17-producono IL cellule CD4 + T (Th17). Cellule T regolatrici CD25 + possono verificarsi in natura (nTreg) nel timo; cellule Th naïve possono anche essere indotti (iTreg) per diventare normativa in periferia (rivisto in 14,15). Entrambi i tipi di Tregs esprimono un fattore di trascrizione caratteristico, definito scatola forkhead P3 (Foxp3), che è critica per i loro meccanismi di soppressione effettori che includono la produzione solubili anti-infiammatori mediatore, IL-2 consumo, e delle cellule meccanismi contatto-dipendente 14,15. La mancanza di Foxp3 risultati espressione di una grave, multiorgano malattia autoimmune chiamati disregolazione immunitaria, poliendocrinopatia, enteropatia, la sindrome X-linked (IPEX), dimostrando il ruolo critico di questo sottoinsieme Th nel risolvere l&#39;infiammazione e regolazione tolleranza periferica di auto antigeni 16. In vitro, le cellule helper CD4 + T naive up-regolano Foxp3 e diventare impegnati nel programma Treg dopo stimolazione con IL-2 e TGF-β 14,15. Ci possono essere da moderata a notevole plasticità in linee cellulari T CD4 +, soprattutto se si considera solo la produzione di citochine (rivisto in 17,18). Tuttavia, ai fini di protocolli di differenziamento in vitro, discuteremo ogni sottoinsieme come un lignaggio unico. Recentemente, un sottogruppo di cellule Th17 che produce la citochina IL-17 è stato identificato come un lignaggio unico con funzioni pro-infiammatorie che sono particolarmente patogeni durante l&#39;infiammazione autoimmune 19-21. Cellule Th17 esprimono un fattore di trascrizione unico, chiamato retinoidi legati orfano recettore gamma t (RORγt) che coordina il programma genetico Th17 22. TGFβ è importante per la generazione di Th17 lineage attraverso l&#39;induzione di RORγt. Tuttavia, l&#39;effetto di segnalazione TGFβ è creduto per indurre unico impegno Th17 su synergizing con IL-6 (valutata in 12). Ulteriori studi hanno dimostrato che una varietà di altri segnali che possono regolare positivamente impegno Th17, comprese IL-1β, aumento del sodio, e TLR segnalazione 23-26. Altri studi hanno suggerito che i patogeni cellule Th17 in vivo sono quelli che ignorano di fatto la segnalazione TGFβ e invece si basano su una combinazione di IL-1, IL-6 e IL-23 per la loro differenziazione 27. Così, le cellule Th17 possono essere ricavati da una varietà di vie di segnalazione; ai fini del presente protocollo, comunemente usato il (TGFβ e IL-6), percorso per Th17 lineage impegnosarà presentato. I protocolli di differenziazione descritti di seguito per tutti i lignaggi effettrici si basa su anticorpi fisso come stimoli per il TCR e CD28 durante l&#39;intero corso dell&#39;esperimento. Tuttavia, altri hanno dimostrato che l&#39;attivazione TCR con l&#39;antigene cellule presentanti l&#39;28 o cross-linking anti-CD3 e anti-CD28 con anticorpi criceto per 2 giorni 29 sono anche mezzo altamente efficace per indurre la generazione di vari sottoinsiemi Th. Il protocollo presentato qui si basa su metodi precedentemente segnalati per isolare le cellule CD4 + T murine da organi linfoidi secondari 30 e la generazione di cellule Th17 31. Una differenza importante è che questo protocollo si basa sull&#39;utilizzo di un cell sorter isolare le cellule CD4 + T naive dai tessuti linfoidi. Tuttavia, molte aziende offrono ora i kit di separazione rapidi che possono arricchire le cellule T CD4 + naïve, che può essere in grado di bypassare il requisito fo l&#39;ordinamento seconda dell&#39;esperimento. I metodi e reagenti presentati in questo protocollo sono ciò che abitualmente usiamo e troviamo per essere il più efficace. Tuttavia, tenere presente che esistono reagenti e metodi alternativi per molti dei passi presentati di seguito e spetta al laboratorio individuo per determinare che cosa funziona meglio per i loro scopi.

<table><tbody><tr><td>Complete RPMI:</td><td></td><td></td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10 % FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1000X 2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100X Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100X L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>120 micron nylon mesh</td><td>Amazon</td><td>CMN-0120-10YD</td><td>Cut into 2 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; squares and autoclave</td></tr><tr><td>Alternative: 100 micron cell strainers</td><td>Fisher</td><td>08-771-19</td><td>Alternative to cutting nylon mesh</td></tr><tr><td>autoMACS running buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>autoMACS rinsing solution</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>CD4 beads</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytokines:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human (h) IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-6</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>406-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>hTGFb</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2C11 (anti-CD3)</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td></td></tr><tr><td>37.51 (anti-CD28)</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>11B11 (anti-IL-4)</td><td>BioXcell</td><td>BE0045</td><td></td></tr><tr><td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td><td>BioXcell</td><td>BE0055</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L-FITC</td><td>BioLegend</td><td>104406</td><td>Use at 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD25-PE</td><td>BioLegend</td><td>102008</td><td>Use at 1:400</td></tr><tr><td>anti-CD4-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>100434</td><td>Use at 1:1000</td></tr><tr><td>anti-CD44-APC</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td>Use at 1:500</td></tr><tr><td>Phorbol&amp;nbsp; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8139</td><td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0634</td><td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBioscience</td><td>00-4506-51</td><td>Use at 1:1000</td></tr></tbody></table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Il punto di tempo per l&#39;analisi di differenziazione può variare a seconda della condizione Th in prova e la forza di attivazione del recettore delle cellule T. Dopo 2-3 giorni di differenziamento, le cellule possono essere visualizzati al microscopio ottico per determinare l&#39;entità della proliferazione delle cellule T. Wells espositrici vasta proliferazione e aggregazione delle cellule saranno molto probabilmente pronti per l&#39;analisi al giorno 4. Condizioni di differenziazione si basa su l&#39;aggiunta di ...

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.8K Views.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

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Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Ricerca

Biologia

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Immunologia e infezioni

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivazione di cellule T<em&gt; In Vitro</em&gt; Da cellule staminali embrionali di topo

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly secretes GM-CSF without producing interferon (IFN)&#947; or interleukin (IL)-17 and is found to play an essential role in the autoimmune neuroinflammation. A method of isolation of naive CD4+ T cells from a single-cell suspension of splenocytes and THGM cell generation from naive CD4+ T cells would be a useful technique in the study of T cell-mediated immunity and autoimmune diseases. Here we describe a method that differentiates mouse naive CD4+ T cells into THGM cells promoted by IL-7. The outcome of the differentiation was assessed by the analysis of the cytokines expression using different techniques, including intracellular cytokine staining combined with flow cytometry, a quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR), and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Using the THGM differentiation protocol as described here, about 55% of the cells expressed GM-CSF with a minimal expression of IFN&#945; or IL-17. The predominant expression of GM-CSF by THGM cells was further confirmed by the analysis of the expression of GM-CSF, IFN&#945;, and IL-17 at both mRNA and protein levels. Thus, this method can be used to differentiate naive CD4+ T cells to THGM cells in vitro, which will be useful in the study of THGM cell biology.

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

Here, we present a protocol to differentiate murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) cells from naive CD4+ T cells, including isolation of naive CD4+ T cells, differentiation of THGM, and analysis of differentiated THGM cells. This method can be applied to studies of the regulation and function of THGM cells.

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

<meta charset="utf8"></head><body>Differenziazione cellulare Th17 da cellule T CD4+ naive mediante citometria a flusso

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ottenere la differenziazione in vitro ad alta purezza delle cellule Th17 utilizzando la modulazione della concentrazione di citochine

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

Differenziazione in vitro di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene nel topo

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

Mouse Naïve CD4

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Derivazione di cellule T

La differenziazione in vitro di cellule CD4 ⁺ umana FOXP3 ⁺ indotta da T regolatorie (iTregs) da ^cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (T_HGM)

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Differenziazione in vitro di cellule T CD4⁺ naive in cellule Th17 patogene nel topo

Differenziazione in vitro di cellule T CD4⁺ naive in cellule Th17 patogene nel topo