著者は、このプロトコルの最適化のためにテキサス大学MDアンダーソンがんセンターの大学の医学と科学のロザリンド·フランクリン大学のレイノルズラボのすべてのメンバー、および陳ドンラボに感謝したいと思います。この作品は、国立衛生研究所（K22AI104941）からJMRの助成金によってサポートされていました。

全ての実験手順は医学と科学のロザリンド·フランクリン大学環境健康と安全のオフィスによって承認されたプロトコルを使用して実行されます。このプロトコルに使用される（NCIから購入）C57BL / 6マウスは、特定病原体を含まない条件下で飼育し、そしてすべての動物実験は医学ロザリンドフランクリン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルを使用して実施した。科学。 楽器、用品、および試薬の調製<ol><li>滅菌PBS、カバー抗CD3および抗CD28（ 表1）コート48ウェルまたは24ウェルプレート及び蒸発および汚染を防ぐためにパラフィルムで包んで、その後T前日C oを 4でO / Nインキュベート細胞の単離。 37 O Cで別の方法として、コートウェル1時間30秒〜1 ml中の1μ​​g/ mlの抗CD3および抗CD28の両方をコーティングすることによりTh0の、のTh1、Th2の、およびiTreg条件を実行するタル·ボリューム（48ウェルプレート）。 Th17のために、私たちは一般的にコートの抗CD3を1μg/ mlのmlおよび抗CD28を2μg/時。 注：我々は、高い抗CD3濃度はTh17の生成のために最適であるが低い抗CD3濃度がTh1、Th2の、およびiTregの生成のために最適であることを見出した。従って、抗CD3および抗CD28の濃度を滴定し、個々の研究室（ 表2）のために最適化されるべきである。 </li><li>オートクレーブまたは消毒液による解剖ツール（はさみや鉗子）のセットを滅菌する。 70％エタノールを含むチューブまたは小ビーカー解剖の間にツールの迅速な殺菌のために必要とされる。最後に、70％エタノールを含むスプレーボトルは、切開の前、マウスの表面を殺菌するために必要とされる。 </li><li>アルミホイルで発泡スチロールやコルク板の平らな部分をラップすることにより解剖表面を準備します。解剖ピンや針が所定の位置に動物を固定するために使用されている。 </li><li> TIの収集のための料理またはプレートを準備しますssues。組織をプールした場合、脾臓およびリンパ節組織のための滅菌PBS + 1％FBS（P​​BS +）の3ミリリットルを含む別の60ミリメートル皿で十分である。個々のマウスからの維持の組織を分離した場合、井戸の所望の数にPBS +の1ミリリットルを含む24ウェルプレートを準備します。 </li><li>使用前に細胞培養および前加温するための完全RPMI培地を調製した（ 表1）。 注：私たちは日常的にRPMIを使用しますが、そのようなIMDMとDMEMなどの他のメディアラボと実験に応じて等しく有効または優れていることがあります。 </li><li>ナイロンの四角は滅菌するために120ミクロンの孔サイズ、オートクレーブ噛み合うカット2×2センチメートル（ 表1）。 </li><li>オプション：そのようなCD4 +細胞の濃縮、前加温ランニングマシンの損傷を防止するために37°Cの水浴中でバッファを洗浄するためをautoMACSなどの高速磁気細胞ソーティングシステムを使用する場合。 </li><li>注：濃縮はソートの収量を増加させ、時間をソート減少することをお勧めします。 </li><li>すべて調製工程は、切開を除き、無菌の組織培養フード内で行われるべきである。 </li></ol>マウスからのリンパ節および脾臓の2の分離<ol><li>制度的に承認された技術を用いて動物の必要数を安楽死させる。使用彼らのナイーブT細胞の割合が高いと、男性または古いマウスと比較して低い体脂肪に起因するC57BL / 6雌マウス、年齢5-10週間は、。 注：雄マウス由来の細胞は、in vitroにおいても同様に実行し、プロトコルステップは同じまま。 5~10週齢の雌マウスは、典型的には、マウスあたり3-6×10 6のナイーブCD4 + T細胞が得られる。しかし、マウスの異なる株を使用して、収率および性能に影響を及ぼし得る。 Balb.cマウス由来の細胞はTh2細胞を生成するために優れている一方、例えば、C57BL / 6マウス由来の細胞は、Th1細胞を生成するための優れている。 </li><li>動物の手足を広げ、 図1に示すように、場所でそれらをピン。長い皮膚をカットitudinally肛門からあごのより深い組織を穿刺しないように注意しながら。 </li><li>スプレッドは、鉗子で皮膚を開いて、 図1に示すように、リンパ節への容易なアクセスを可能にするために適所に皮膚をピン。 </li><li> 図1に示す位置からアクセス可能なリンパ節を採取する。ピンセットでリンパ節をつかむ鉗子の別のペアを用いて組織を分離することは容易な除去を可能にしている。コレクション皿に組織を置きます。 </li><li> 図1に示す位置から脾臓を採取する。この場合には、腹膜への慎重な切断は、脾臓へのアクセスを得るために必要とされる。コレクション皿に組織を置きます。 </li><li>複数の組織を採取する場合の手順を繰り返します。そうしないと次のステップに進みます。この時点で、ソートした後、T細胞のメッキまで氷上で残りのすべての手順を実行します。 </li></ol> 3.組織の処理およびCD4 +エンリッチメント<ol><li>マイナー白血球死をもたらす可能性赤血球溶解を必要としないリンパ節細胞調製物などの歩留まりを向上させる別の皿におけるリンパ節および脾臓を処理する。したがって、次の手順は別々にソートするためのラベル付けする前に組み合わせることで、その後脾臓及びリンパ節集団を処理するための方法について説明します。 </li><li> PBS +の3ミリリットルを含む新しい60ミリメートル皿に収集皿場所からの組織（脾臓またはプールされたリンパ節）を取り外します。滅菌ピンセットを用いて、組織上の滅菌ナイロンメッシュの正方形を置きます。 </li><li>シリンジプランジャ（3〜10ミリリットル）の親指側を取り、軽くメッシュに対する組織を粉砕。ほとんどすべての組織の懸濁液に行く必要があります。あるいは、2つのオートクレーブすりガラスのスライド間の組織を配置し、懸濁液にすっ。 </li><li>残りの水溶性の塊を分割するまで、数回ダウンサスをピペット。の開口部にナイロンメッシュの新しい正方形の作品を配置15ミリリットルコニカルチューブ、残りの破片を除去するためを通じてサスペンションをフィルタリングする。 </li><li>繰り返して、追加リンパ節および脾臓組織のために手順2〜4を。 </li><li>サスペンションは、15ミリリットルチューブに濾過された後、PBS +でチューブの残りの部分を埋め、数回転倒。 4℃。で5分間、475×gで細胞を遠心</li><li>脾細胞は、遠心分離後の上清を吸引し、赤血球を溶解するために1分間あたりの脾臓を氷冷1X ACK溶液1ml中に細胞ペレットを再懸濁する。その後、ACKの上にPBS +の10ミリリットルを追加するチューブを反転し、遠心分離機475×gで4 Oで5分間</li><li>リンパ節細胞の場合は、PBS +の2ミリリットルで上清と再懸濁を吸引。所望であれば、これらは、それらのACK溶解および洗浄工程の後に脾細胞と組み合わせることができる。 </li><li> PBS +の別の10ミリリットルで脾細胞の遠心分離および再懸濁した後、上清を吸引除去する。この時点で、リンパ節懸濁液とすることができる組織プーリングがソートに必要な場合脾臓サスペンションの上にdded。 4 Oで5分間475×gで再びチューブを遠心</li><li>細胞ペレットは、現在CD4濃縮のために調製することができる。このステップは実行されません場合は、仕分け準備ステップに進みます。 </li><li>高速磁気セルソーティングシステムを使用して、CD4の濃縮のために、CD4ビーズと細胞のペレットを再懸濁。通常、PBS +の85μlの希釈されたビーズの15μlを1マウスからの組織を標識するために使用されます。必要に応じて、ビーズ混合物の容量を増やすペレットを再懸濁し、そして4℃。で15-30分間インキュベート</li><li> 、PBS + 10mlで細胞を洗浄4℃。で5分間475×gで再び破片、および遠心分離機を除去し、新しい15mlチューブにナイロンを通して懸濁液を渡す</li><li>マウス当たりのPBS +100μlにペレットを再懸濁し、高速磁気細胞ソーティングシステム上の正の選択に進みます。手動の分離システムを使用する場合、fは濃縮のための製造元の指示にollow。滅菌濾過し、1mMのEDTA（pH値= 8）および1％BSAを含むPBS：あるいは、FACS緩衝液中で試料を再懸濁する。 </li><li>陽性画分を除去し、PBS + 10mlので再び洗う。豊富なCD4 +画分は今、ソートのために標識される準備ができている。 </li></ol> 4.ソートナイーブCD4 + T細胞<ol><li> PBSをCD62L、CD44、CD25、およびCD4に対して向けられた蛍光抗体を含有する+と細胞ペレットにラベルを付けます。 表1に記載された抗体を使用する場合、それぞれのための希釈液が提供される。染色のために、抗体カクテル100μlの体積は、1匹のマウスからの組織ごとに使用される。 </li><li>抗体カクテルでペレットを再懸濁し、暗所で4 O℃で 15〜30分間インキュベートする。 </li><li> PBS +の10ミリリットルと4 Oで5分間遠心分離機475 XGで細胞を洗浄</li><li>再別のナイロンフィルターまたはセルストレーナーキャップの上に物を渡す残っ破片を移動します。セルソーターのために互換性のあるチューブに標識された細胞をピペットで。氷の上で細胞を維持し、ソートされるまで、光から保護。 </li><li>セルソーター上の収集のための互換性のあるチューブの底に完全RPMI培地またはFBSの1〜2ミリリットルをピペットにより採血管を準備します。 </li><li> CD62L + CD44 - - CD4 + CD25としてソートナイーブCD4 + T細胞集団（ 図2）。完全RPMI培地で回収した細胞を洗浄し、上記のように遠心する。 </li><li> 、完全RPMIでペレットを再懸濁ナイーブ細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの濃度に調整。 </li></ol> 5. インビトロ分化を設定する<ol><li>抗CD3および抗CD28でコーティングしたプレートのウェルを吸引し、滅菌PBS（FBSなし）の1ミリリットルで、各ウェルを洗浄する。 48ウェルプレートについては、RPの0.5×10 6細胞/ウェルを0.5mlプレートMI。 24ウェルプレート、培養1×10 6細胞をRPMI /ウェルで1.0ミリリットルである。 </li><li>薬物などの要因の影響をテストする時にどちらかの前に、適切なウェルに物質を追加したり、実験に応じて分化処理後の場合。次に、それに応じてサイトカインおよび遮断抗体との培養培地を補足する。 Th0を：30 U / mlののhIL-2。のTh1：15 / mlののrmIL-12、30 U / mlでのhIL-2、及び5000 / mlの11B11.Th2：10ng / mlののrmIL-4、30 U / mlでのhIL-2を、2000 ngの可溶性37.51ミリリットル/および5000 / mlのXMG1.2。 iTreg：15 / mlのhTGFβ、30 U / mlののhIL-2、5000 / mlのXMG1.2、および5000 / mlの11B11。 Th17分化：20ng / mlののrmIL-6,3 / mlのhTGFβ、5000 / mlのXMG1.2、及び5000 / mlの11B11。 注記：上記の条件は、分化実験（ 代表的な結果セクション ）の最後に測定されたサイトカイン産生を最大にするために最適であることが見出された。しかし、各条件を表2（各施設のために最適化されるべきである</stroNG&gt;）。さらに、プレート結合抗CD28に加えて、可溶性抗CD28の添加は、我々の研究室でのTh2サイ​​トカイン産生を増強することがあるが、他のT細胞サブセットに影響を及ぼされなかった。 </li><li>前の遺伝子発現およびサイトカイン産生の分析dは4~5、5％CO 2で37°Cのでプレートをインキュベートする。あるいは、増殖および最終収率を向上させるために、新鮮な培地で1×10 6細胞/ mlに調整し、2日後にTCR刺激から細胞を除去し、新しいウェル（非被覆）でプレート。この場合には、新鮮な偏サイトカインおよび抗体が必要とされないが、IL-2を10 U / mlのTh0を、TH1、TH2、およびiTreg培養に新しい培地に添加されるべきである。 </li></ol>分化の6.分析<ol><li>フローサイトメトリーによるサイトカイン分析のために、10ng / mlのPMAと各ウェルを再刺激1,000 / mlのイオノマイシン、またはそのような（ 表ブレフェルジンとしてゴルジ阻害剤の存在下で4-6時間、で1μg/ mlの抗CD31）。実験（ 図3）に応じて、細胞内サイトカイン染色を行います。 注：染色は、非系統特異的サイトカインまたはそのような（図示しない）IL-4およびIFNγなどの転写因子、陰性対照としての分化効率の指標として各条件Th17細胞培養のための（ 図3）。さらに、Tregの逆数の開発などのTh17培養のため汚れのFoxp3は、TGFβの添加で発生する可能性があります。 </li><li>タンパク質定量のために、サイトカイン特異的ELISA（ 図3）により各ウェルアッセイからの上清を収集します。試験される因子は、対照試料と比較して細胞増殖に影響を与えていることが懸念される場合は、細胞は、洗浄し、計数し、正規化され、その後、ELISAアッセイのために上清を収集する前に24時間、抗CD3を1μg/ mlの再刺激することができる。 Th2の条件からのIL-4をアッセイする場合には、洗浄および再刺激がlとすることができることから、IL-4を除去する必要がある初期分化培養からeftover。 </li><li>リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析のために、収穫細胞は、インキュベーション期間の後、洗浄正規化し、抗CD3の1μg/ mlの収穫のmRNAの前（ 図3）で2-6時間、再刺激する。 </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

著者は、競合する経済的利益を宣言していない。

脾臓はナイーブThの細胞を含んでいるが、リンパ節におけるこの集団の割合がはるかに高い。適切にこのプロトコルでリンパ節を識別して削除に失敗すると、ナイーブ細胞の貧弱な収量になります。これは、より多くの脂肪組織を有する老齢マウスまたは雄マウスでは特に困難である。 図1に示すように、動物の四肢や皮膚の適切な固定及びピニングがアクセス可能な外部のリン?...

CD4 + Tヘルパー（Th）細胞の明確な系統またはサブセットの概念は、20 世紀1の後半から出回っている。細胞増殖と細胞のThエフェクターへの最終的な分化のいくつかのラウンドで共刺激シグナルの結果の存在下で同族抗原の認識。このプロセスの間に生成されたTh細胞のタイプは、活性化2中に存在するサイトカイン環境に依存する。最初に、ナイーブTh細胞は、T細胞受容体（TCR）活性化、共刺激CD28のライゲーション、およびサイトカインシグナル伝達以下、2つの異なる系統に分極すると考えられていた。 1型ヘルパー細胞（Th1が）IFNγサイトカインのそのエフェクター生産ならびに分化プロセス3,4の間にIL-12シグナル伝達に対するそれらの要件によって特徴付けられる。最終的には、分化したTh1細胞は、ほとんど区別bとを特徴とする遺伝的プロファイルを有することが発見されたYのTh1遺伝的プログラム5のマスターレギュレーターと考えられているTボックスファミリー転写因子の発現、Tbx21（T-BET）、。さらに、IL-12と同様にIFNγは、T-bet発現6,7を促進することができます。免疫応答を、Th1細胞は、細胞内病原体、ならびに自己免疫性炎症の強力なプロモーターに対する宿主防御のために重要である。対照的に、2型ヘルパー細胞（Th2の）は、それらの開発のためのIL-4およびIL-4、IL-5を含むそれらのエフェクターサイトカイン、およびIL-13を必要とし、B細胞応答を駆動するために重要であり、アレルギー8において病原性であり、 9。 Th1細胞と同様に、Th2細胞は、自分のマスター転写調節因子を発現することが見出された、GATA-3 10,11と称される。興味深いことに、偏サイトカインの存在と特定のTh系統の世代は、特定のThサブセットが、免疫再中に優勢になることを示唆している、他人2,12の発展に拮抗的であるsponse。 Th1とTh2の系統の同定以来、最近（、さらなる作業は濾胞ヘルパー（TFH）、IL-9産生（TH9）を含むヘルパーT細胞のさらに多くのユニークなサブセットを、実証した、およびIL-22を産生する（TH22） 13で）検討。 in vitroでの分化実験のために、このプロトコルは2つだけ追加のThサブセットに焦点を当て、調節性T細胞（Treg細胞）およびIL-17産生CD4 + T細胞（Th17細胞）と呼ばれる。 CD25 +制御性T細胞は胸腺で自然に（nTreg）が発生することがあります。ナイーブTh細胞はまた、（14,15に総説）周辺の規制になるために（iTreg）を誘導することができる。 Tregの両方のタイプの特性転写因子を発現し、可溶性抗炎症性メディエーター産生、IL-2の消費、および細胞接触依存性の機構14,15を含み、それらのエフェクター抑制メカニズムにとって重要であるフォークヘッドボックスP3（Foxp3の）は、と呼ばれる。 Foxpの欠如深刻な、多臓器自己免疫疾患の3式の結果は、炎症を解決し、自己抗原16に末梢寛容の調節におけるこのThのサブセットの重要な役割を実証し、免疫調節異常、内分泌腺、腸、X連鎖症候群（IPEX）と呼ばれる。アップレギュレートするのFoxp3およびIL-2による刺激のTregプログラムにコミットなり14,15 TGF-βin vitroでのナイーブCD4 + Tヘルパー細胞。 （17,18に総説）はサイトカイン産生を検討する場合は特に、CD4 + T細胞系統のかなりの可塑性の中等度があってもよい。しかし、in vitroでの分化プロトコルの目的のために、我々は、ユニークな系統として各サブセットを議論する。 最近、IL-17のサイトカインを産生するTh17細胞のサブセットは、自己免疫炎症19-21の間、特に病原性の炎症促進性機能を有するユニークな系統として同定された。 Th17細胞は、固有の転写因子を発現し、Th17の遺伝的プログラム22を調整レチノイド関連オーファン受容体γトン（のRORγt）と呼ばれる。 TGFβは、RORγtの誘導を介してのTh17系統の世代のために重要である。しかしながら、TGFβシグナル伝達の効果のみ（12日）、IL-6と相乗際のTh17コミットメントを誘導すると考えられている。さらなる研究は、他の正IL-1βを含む、Th17細胞のコミットメントを調節することができる信号が増加ナトリウム、およびTLR種々の23-26をシグナリングすることを示した。他の報告では、 インビボで病原性Th17細胞が実際TGFβシグナル伝達をバイパスするものであり、その代わりに、それらの分化27 IL-1、IL-6、およびIL-23の組み合わせに依存することを示唆している。したがって、Th17細胞は、シグナル伝達経路の様々な由来してもよい。 Th17の系譜コミットメントのためにこのプロトコルの目的のために、一般的に使用される（TGFβおよびIL-6）経路表示されます。 すべてのエフェクター系統のために以下に記載される分化プロトコルは、実験の全過程を通じて、TCRおよびCD28のための刺激として固定した抗体に依存しています。しかし、他の2日間29抗原提示細胞28またはハムスター抗体と架橋抗CD3および抗CD28抗体によるTCR活性化は、様々なThのサブセットの生成を誘導する非常に有効な手段であること。実証されているここに提示されたプロトコルは、Th17細胞31を二次リンパ器官30から、マウスCD4 + T細胞を単離および生成するための以前に報告された方法を上に構築する。一つの大きな違いは、このプロトコルは、リンパ組織からのナイーブCD4 + T細胞を分離するセルソーターの使用に依存することである。しかし、多くの企業が要件fのをバイパスすることができる可能性が、ナイーブCD4 + T細胞を濃縮することができ迅速な分離キットを提供または実験に応じてソート。このプロトコルで提示方法および試薬は、私たちが日常的に最も効果的に使用すると何を見つけるです。しかし、別の試薬および方法論は、以下に提示手順の多くのために存在し、それが彼らの目的のために最適に動作されるか決定するために、個々の研究室次第であることに留意してください。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete RPMI:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 micron nylon mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0120-10YD</td>
			<td>Cut into 2 cm2 squares and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative: 100 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td>Alternative to cutting nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS rinsing solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 beads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human (h) IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-12</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>210-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTGFb</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C11 (anti-CD3)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37.51 (anti-CD28)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11B11 (anti-IL-4)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD62L-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104406</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102008</td>
			<td>Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-PerCP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100434</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103012</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol&#160; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8139</td>
			<td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-0634</td>
			<td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4506-51</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

分化の分析のための時点は、試験されるThの条件ならびにT細胞受容体活性化の強さに応じて変えることができる。分化の2~3日後、細胞はT細胞増殖の程度を決定するために、光学顕微鏡によって可視化することができる。細胞の大規模な増殖および凝集を示すウェルは、最も可能性が高いと考え、培養中の4日後にメディアを排出し、外因性IL-2、そのようなTh1とTh2などのほかに頼って4日目分化...

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.7K ビュー.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

ビデオ: Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

免疫・感染学

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle toxicity testing in immortalized cell lines or primary cells have shown discrepancies, highlighting the need to extend the use of primary cells for in vitro assays. This protocol describes the isolation of mouse liver macrophages, named Kupffer cells, and their use to study nanoparticle toxicity. Kupffer cells are the most abundant macrophage population in the body and constitute part of the reticulo-endothelial system (RES), responsible for the capture of circulating nanoparticles. The Kupffer cell isolation method reported here is based on a 2-step perfusion method followed by purification on density gradient. The method, based on collagenase digestion and density centrifugation, is adapted from the original protocol developed by Smedsr&#248;d et al. designed for rat liver cell isolation and provides high yield (up to 14 x 106 cells per mouse) and high purity (&#62;95%) of Kupffer cells. This isolation method does not require sophisticated or expensive equipment and therefore represents an ideal compromise between complexity and cell yield. The use of heavier mice (35-45 g) improves the yield of the isolation method but also facilitates remarkably the procedure of portal vein cannulation. The toxicity of functionalized carbon nanotubes f-CNTs was measured in this model by the modified LDH assay. This method assesses cell viability by measuring the lack of structural integrity of Kupffer cell membrane after incubation with f-CNTs. Toxicity induced by f-CNTs can be measured consistently using this assay, highlighting that isolated Kupffer cells are useful for nanoparticle toxicity testing. The overall understanding of nanotoxicology could benefit from such models, making the nanoparticle selection for clinical translation more efficient.

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

単離と<em&gt;エクスビボ</emVδ1の&gt;文化<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt;γδT細胞、胸腺外αβT細胞前駆

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.