Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório de Reynolds em Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência, e o laboratório Chen Dong da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, para a otimização do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por uma doação para JMR do National Institutes of Health (K22AI104941).

Todos os procedimentos experimentais são realizados usando protocolos aprovados pelo escritório de Saúde e Segurança Ambiental da Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência. Murganhos C57BL / 6 (adquirido a partir de NCI) utilizado para este protocolo foram alojados sob condições isentas de patogénios específicos, e todas as experiências com animais foram realizadas usando protocolos aprovados pelo Comité de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) no Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Science. 1. Preparação de Instrumentos, suprimentos e Reagentes <ol><li> O revestimento de 48 poços ou de 24 poços, placas com anti-CD3 e anti-CD28 (Tabela 1) em PBS estéril, a tampa eo envoltório em parafilme para evitar a evaporação e contaminação, e então incubar O / N a 4 ° C no dia anterior t o isolamento das células. Alternativamente, poços casaco 1 h a 37 o C. Realizar condições Th0, Th1, Th2, e iTreg por revestimento, tanto com anti-CD3 e anti-CD28 em 1 ug / ml em 0,5-1 ml devolume de tal (de 48 poços). Para Th17, que tipicamente revestimento anti-CD3 a 2 ug / ml e anti-CD28 a 1 ug / ml. NOTA: Verificou-se que uma baixa concentração de anti-CD3 é óptima para a produção de Th1, Th2, e iTreg enquanto uma concentração mais elevada de anti-CD3 é óptima para a produção de Th17. Assim, anti-CD3 e anti-CD28 concentrações devem ser tituladas e optimizado para laboratórios individuais (Tabela 2). </li><li> Esterilizar um conjunto de ferramentas de dissecação (tesouras e fórceps) por solução de autoclave ou desinfetante. Um tubo ou pequeno copo contendo 70% de etanol serão necessários para a esterilização rápida de ferramentas entre dissecções. Finalmente, uma garrafa de pulverização contendo 70% de etanol será necessário para esterilizar a superfície do rato antes da dissecação. </li><li> Prepare uma superfície de dissecção envolvendo uma peça plana de isopor ou cortiça em papel alumínio. Alfinetes ou agulhas de dissecação são usados ​​para fixar o animal no lugar. </li><li> Prepare pratos ou placas para a recolha de tissues. Se tecidos de pooling, 60 milímetros pratos separados contendo 3 ml de PBS estéril + 1% FBS (PBS +) para os tecidos do baço e nódulos linfáticos é suficiente. Se mantendo tecidos de ratinhos individuais separados, preparar uma 1ml placa de 24 poços contendo de PBS + no número desejado de poços. </li><li> Prepare meio RPMI completo para cultura de células e pré-quente antes do uso (Tabela 1). NOTA: Nós usam rotineiramente RPMI mas outras mídias, como IMDM e DMEM podem ser igualmente eficazes ou superiores, dependendo do laboratório e da experiência. </li><li> Cut 2x2 cm quadrados de malha de nylon com um tamanho de poro e autoclave para esterilizar 120 mm (Tabela 1). </li><li> Opcional: se estiver usando a célula magnética de alta velocidade sistema de triagem, como autoMACS para o enriquecimento de células CD4 +, a corrida pré-quente e lavagem buffers em um 37 o banho de água C ​​para evitar danos à máquina. </li><li> NOTA: O enriquecimento é recomendado para aumentar o rendimento de triagem e diminuir o tempo de classificação. </li><li> Tudoetapas de preparação, excepto para dissecção, deve ser realizada num capuz de cultura de tecido estéril. </li></ol> 2. Isolamento de linfonodos e baço de ratinhos <ol><li> Eutanásia o número necessário de animais utilizando uma técnica institucional-aprovado. Use camundongos C57BL / 6 do sexo feminino, com idade de 5-10 semanas, devido à sua alta porcentagem de células T naive e gordura corporal mais baixo em comparação com os homens ou para ratos mais velhos. NOTA: As células derivadas de ratinhos macho irá executar de forma semelhante in vitro, e as etapas do protocolo permanecer o mesmo. Camundongos fêmeas, 5-10 semanas de idade, normalmente vai render 3-6 x 10 6 células T CD4 + naive por mouse. No entanto, usando diferentes cepas de camundongos pode afetar o rendimento e performance. Por exemplo, as células de ratinhos C57BL / 6 são melhores para a geração de células Th1, enquanto as células de ratinhos Balb.c são melhores para a geração de células Th2. </li><li> Espalhar dos membros do animal e fixá-los no lugar, como mostrado na Figura 1. Cortar a pele longoitudinally do ânus para o queixo, tendo o cuidado para não perfurar tecidos mais profundos. </li><li> Espalhe abrir a pele com pinças e prender a pele, em lugar de permitir um acesso fácil para os gânglios linfáticos, como mostrado na Figura 1. </li><li> Colher os gânglios linfáticos acessíveis a partir dos locais mostrados na Figura 1. Agarrando o nó de linfa com um par de pinças, enquanto que separa o tecido com um outro par de pinças irá permitir a remoção fácil. Colocar o tecido no prato de recolha. </li><li> Colheita do baço a partir do local mostrado na Figura 1. Neste caso, o corte cuidadoso no peritoneu é necessário para ter acesso ao baço. Colocar o tecido em um prato de recolha. </li><li> Repita o procedimento se mais tecidos serão colhidos. Caso contrário, prossiga para as próximas etapas. Neste ponto, realizar todas as etapas restantes no gelo até o revestimento das células T, após separação. </li></ol> 3. Tissue Processamento e CD4 + Enriquecimento<ol><li> Processar os nódulos linfáticos e no baço em pratos diferentes para aumentar o rendimento como preparações de células de linfonodos não necessitam de lise de eritrócitos, o que pode resultar em morte de leucócitos menor. Portanto, as etapas a seguir descrevem um método para processar as populações de baço e nódulos linfáticos seguidos separadamente pela combinação prévia com a rotulagem de classificação. </li><li> Remover o tecido (baço ou nódulos linfáticos reunidas) do prato de recolha e em lugar de um novo prato de 60 milímetros, contendo 3 ml de PBS +. Colocar um quadrado de nylon estéril malha sobre o tecido usando uma pinça esterilizada. </li><li> Pegue o lado do polegar de um êmbolo da seringa (3-10 ml) e gentilmente esmagar o tecido contra a malha. Quase todo o tecido deve entrar em suspensão. Alternativamente, coloque o tecido entre duas lâminas de geadas autoclavada e moído em suspensão. </li><li> Pipeta a suspensão para cima e para baixo algumas vezes para quebrar os aglomerados solúveis restantes. Coloque um novo pedaço quadrado de malha de nylon sobre a abertura de umTubo de 15 ml e filtrar a suspensão através de remover os escombros restantes. </li><li> Repita os passos 2-4 para linfonodo adicional e do tecido do baço. </li><li> Assim que a suspensão foi filtrada para um tubo de 15 ml encher o restante do tubo com PBS + e inverter algumas vezes. Centrifuga-se as células a 475 xg durante 5 minutos a 4 o C. </li><li> Para as células de baço, aspirar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de solução gelada 1X ACK por baço durante 1 min para lisar os eritrócitos. Em seguida, adicionar 10 ml de PBS + no topo do ACK, inverter o tubo, e centrifuga-se 475 xg durante 5 minutos a 4 o C. </li><li> Para as células de nódulos linfáticos, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de PBS +. Se desejado estes podem ser combinados com as células de baço após a sua lise ACK e o passo de lavagem. </li><li> Aspirar o sobrenadante após centrifugação dos esplenócitos e ressuspender em mais 10 ml de PBS +. Neste ponto a suspensão nodo linfático pode ser umdded no topo da suspensão de tecido do baço que o agrupamento é necessária para a classificação. Centrifuga-se o tubo de novo a 475 xg durante 5 minutos a 4 o C. </li><li> O sedimento celular pode agora ser preparado para o enriquecimento de células CD4. Se essa etapa não será executada, prossiga para as etapas de preparação de classificação. </li><li> Para o enriquecimento de CD4 utilizando o sistema de separação de células magnético de alta-velocidade, ressuspender o sedimento celular com pérolas de CD4. Normalmente 15 ul de contas diluídos em 85 mL de PBS + é usado para rotular os tecidos a partir de 1 mouse. Rampa até o volume de mistura de pérolas, conforme necessário, colocar o agregado, e incubar por 15-30 min a 4 o C. </li><li> Lavam-se as células com 10 ml de PBS +, passar a suspensão através de nylon para um novo tubo de 15 ml para remover os detritos, e centrifuga-se novamente a 475 xg durante 5 minutos a 4 o C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS + por ratinho e prossiga para a selecção positiva sobre o sistema de triagem celular magnético de alta-velocidade. Se estiver usando um sistema de separação manual, fRealize as instruções do fabricante para o enriquecimento. Alternativamente, ressuspender as amostras em tampão de SCAF: PBS com EDTA 1 mM (pH = 8) e BSA a 1%, esterilizado por filtração. </li><li> Remover a fracção positiva e lavar novamente com 10 ml de PBS +. A fração enriquecida CD4 + está agora pronto para ser rotulados para a classificação. </li></ol> 4. células Seleção Naïve T CD4 + <ol><li> Rotular o aglomerado de células com PBS + anticorpos fluorescentes que contenham contra CD62L, CD44, CD25, e CD4. Se utilizar os anticorpos listados na Tabela 1, para cada diluições são fornecidos. Para a coloração, num volume de 100 ul do cocktail de anticorpo é utilizado por tecidos de um rato. </li><li> Ressuspender o sedimento em cocktail de anticorpos e incubar durante 15-30 minutos a 4 ° C no escuro. </li><li> Lavam-se as células com 10 ml de PBS + 475 xg e centrifugar durante 5 minutos a 4 o C. </li><li> Passe a mistura sobre uma outra tampa do filtro de nylon ou filtro de células para redeslocar quaisquer detritos sobra. Pipetar as células marcadas dentro de um tubo que é compatível para o classificador de células. Mantenha as células no gelo e ao abrigo da luz até que o tipo. </li><li> Prepare tubos de coleta por pipetagem 1-2 mL de meio completo RPMI ou FBS para o fundo de tubos compatíveis para a coleta em um classificador de células. </li><li> Ordenar as células CD4 + T naive como CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - população (Figura 2). Lavam-se as células recolhidas com meio RPMI completo e centrifugação como descrito acima. </li><li> Ressuspender o sedimento em RPMI completo, contagem das células ingênuo, e ajustar a concentração de 1 x 10 6 células / ml. </li></ol> 5. Configuração da Diferenciação in vitro <ol><li> Aspirar os poços das placas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28 e lavar cada cavidade com 1 mL de PBS estéril (sem FBS). Para placas de 48 poços, 0,5 x placa 10 6 células / poço em 0,5 ml de RPMI. Para placas de 24 poços, de cultura de 1 x 10 6 células / poço em 1,0 ml de RPMI. </li><li> Se a testar a influência de um factor, tal como uma droga adicionar a substância aos poços apropriados, quer antes, durante ou após o processo de diferenciação de acordo com a experiência. Em seguida, completar o meio de cultura com citocinas e anticorpos bloqueadores de acordo. Th0: 30 U / ml de hIL-2. Th1: 15 ng / ml de rmIL-12, de 30 U / ml de hIL-2, e 5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml de rmIL-4, 30 U / ml de hIL-2, 2000 ng / mL 37,51 solúvel, e 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml de hIL-2, 5,000 ng XMG1.2 / ml, e 5,000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml de rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 ng XMG1.2 / ml, e 5,000 ng / ml 11B11. NOTA: As condições apresentadas acima foram encontrados para ser óptima para maximizar a produção de citoquinas tal como medido no final da experiência diferenciação (secção de resultados representativos). No entanto, cada estado deve ser otimizado para laboratórios específicos (Tabela 2 </strong&gt;). Além disso, a adição de anti-CD28 solúvel, para além do anti-CD28 ligado à placa foi encontrada para melhorar a produção de citoquinas do tipo Th2 em nosso laboratório, mas não tem nenhum efeito sobre outras subpopulações de células T: </li><li> Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 4-5 dias antes da análise da expressão do gene e a produção de citoquinas. Alternativamente, as células de remover os estímulos de TCR após 2 d, ajustada a 1 x 10 6 células / ml com meio fresco, e em novos poços de placa (não revestido) para aumentar a proliferação e rendimento final. Neste caso, citocinas polarizadoras frescos e anticorpos não são necessários, mas a 10 U / ml de IL-2 deve ser adicionado a novos meios para Th0, Th1, Th2, e culturas iTreg. </li></ol> 6. Análise de Diferenciação <ol><li> Para a análise por citometria de fluxo de citoquina, reestimular cada poço com 10 ng / ml de PMA e 1000 ng / ml de ionomicina ou 1 ug Tabela / ml de anti-CD3 durante 4-6 horas na presença de um inibidor de Golgi, tais como brefeldina A (1). Realização da coloração de citocinas intracelulares dependendo da experiência (Figura 3). NOTA: Mancha citocinas ou factores de transcrição, tais como IL-4 (não mostrado) e de IFN-y não específicos da linhagem (figura 3) para culturas Th17, para cada condição como controlos negativos e como um indicador da eficiência da diferenciação. Além disso, Foxp3 mancha para culturas Th17 como o desenvolvimento recíproco de Tregs pode ocorrer com a adição de TGF-p. </li><li> Para a quantificação de proteínas, recolher os sobrenadantes de cada poço de ensaio e por citocina específica-ELISA (Figura 3). Se houver preocupação de que o factor a ser testado tem influenciado proliferação em comparação com amostras de controlo, as células podem ser lavadas, contadas, normalizados, e em seguida, novamente estimuladas com 1 ug / ml de anti-CD3 durante 24 horas antes de se recolher os sobrenadantes para os ensaios de ELISA. Se o ensaio de IL-4 de Th2 é necessário condições, lavagem e restimulating para remover a IL-4 que pode ser leftover diferenciação a partir da cultura inicial. </li><li> Para a análise da expressão de genes por PCR em tempo real, as células de colheita após o período de incubação, lavagem, normalizar, e re-estimular durante 2-6 h com 1 ug / ml de anti-CD3 de ARNm antes da colheita (Figura 3). </li></ol>

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J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Enquanto o baço contém células Th simples, a proporção da população nos nódulos linfáticos é muito maior. Falha em identificar corretamente e remover os linfonodos neste protocolo irá resultar em um fraco rendimento de células naïve. Isto pode ser especialmente difícil nos ratos mais velhos ou ratinhos macho que têm mais tecido gordo. Como mostrado na Figura 1, a fixação adequada e de membros de pinagem animais e pele irá permitir a fácil visualização dos nódulos linfáticos exteri...

O conceito de linhagens distintas ou subconjuntos de CD4 + T helper (Th) tem sido em torno desde a última parte do século 20 1. O reconhecimento de antigénio correspondente na presença de sinais co-estimuladores resultados em diversas fases da proliferação celular e da eventual diferenciação em células Th efectoras. O tipo de célula Th gerada durante este processo é dependente do ambiente citoquina presente durante a activação 2. Inicialmente, as células Th simples foram pensados ​​para polarizar em duas linhagens distintas seguintes receptor de células T (TCR) de activação, ligação co-estimulador CD28, e sinalização de citocina. Tipo 1 células auxiliares (Th1) são caracterizadas pela sua produção efectora da citoquina IFN-y, bem como a sua exigência de sinalização de IL-12 durante o processo de diferenciação 3,4. Finalmente, foi descoberto que as células Th1 diferenciadas têm um perfil genético que é distintamente mais caracterizada by a expressão do factor de transcrição da família T box, Tbx21 (T-bet), o qual é considerado o principal regulador do programa genético Th1 5. Além disso, a IL-12, bem como de IFN-y pode promover a expressão de T-bet 6,7. Na resposta imune, as células Th1 são importantes para a defesa do hospedeiro contra agentes patogénicos intracelulares, bem como promotores fortes de inflamação auto-imune. Em contraste, as células auxiliares do tipo 2 (Th2) IL-4 requerem para o seu desenvolvimento e suas citocinas efectoras, incluindo IL-4, IL-5 e IL-13, são importantes para dirigir as respostas das células B e são patogénicas em alergia 8, 9. Semelhante a células Th1, Th2 foram encontrados para expressar seu próprio regulador mestre da transcrição, denominada GATA-3 10,11. Interessantemente, a presença de citocinas polarizadoras e a geração de uma linhagem Th são antagonistas específicos para o desenvolvimento de outros 2,12, sugerindo que apenas um subconjunto Th particular pode tornar-se dominante durante uma re imunerespos-. Desde a identificação das linhagens Th1 e Th2, a continuação dos trabalhos demonstrou ainda mais exclusivos subconjuntos de células T auxiliares, incluindo folicular auxiliar (TFH), IL-9, produzindo-(Th9), e IL-22 produtoras (Th22) (recentemente revisto em 13). Para efeitos de experiências in vitro de diferenciação, este protocolo vai se concentrar apenas em dois subconjuntos Th adicionais, chamadas de células T reguladoras (Tregs) e IL-17 produzindo células-T CD4 + (Th17). CD25 + células T reguladoras pode ocorrer naturalmente (nTreg) no timo; células Th simples pode também ser induzida (iTreg) para se tornar reguladora na periferia (revisto em 14,15). Ambos os tipos de Tregs expressar um factor de transcrição característica, denominado forkhead caixa P3 (Foxp3), o qual é crítico para as suas mecanismos efectores que incluem supressão de produção solúvel anti-inflamatória mediador, IL-2 consumo, e os mecanismos de células dependentes de contacto 14,15. A falta de Foxp3 resultados de expressão em um multi-órgãos distúrbio grave, auto-imune denominado alteração no sistema imunológico, poliendocrinopatia, enteropatia, síndrome do X-linked (IPEX), demonstrando o papel fundamental deste subconjunto Th na resolução de inflamação e regulação tolerância periférica à auto antígenos 16. In vitro, as células T helper CD4 + naive-regulam Foxp3 e tornar-se comprometida com o programa Treg após estimulação com IL-2 e TGF-β 14,15. Não pode ser moderada a plasticidade considerável em linhagens de células CD4 + T, especialmente quando se considera apenas a produção de citocinas (revisto em 17,18). No entanto, para efeitos de protocolos de diferenciação in vitro, vamos discutir cada subconjunto como uma linhagem única. Recentemente, um subconjunto de células Th17, que produz a citocina IL-17 foi identificada como uma linhagem original com funções pró-inflamatórias que são particularmente patogénico durante a inflamação autoimune 19-21. Células Th17 expressar um fator de transcrição original, denominado dependente do retinóide gamma receptor órfão t (RORγt), que coordena o programa genético Th17 22. TGFp é importante para a geração de Th17 linhagem através da indução de RORγt. No entanto, se acredita que o efeito de sinalização de TGF-p para induzir apenas Th17 compromisso sobre sinergia com IL-6 (revisto em 12). Outros estudos têm mostrado que uma variedade de outros sinais que podem regular positivamente Th17 compromisso, incluindo IL-1β, o aumento de sódio, e de sinalização de TLR 23-26. Outros relatos sugeriram que as células Th17 patogénicos in vivo são os que realmente desviam a sinalização TGF-p e em vez disso dependem de uma combinação de IL-1, IL-6, e IL-23 para a diferenciação 27. Assim, as células Th17 pode ser derivado de uma variedade de vias de sinalização; para efeitos do presente protocolo, o comumente usado (TGF e IL-6) via para Th17 compromisso linhagemirá ser apresentada. Os protocolos de diferenciação descritos abaixo para todas as linhagens efectoras depende de anticorpo fixa como estímulos para o TCR e CD28 ao longo de todo o decurso da experiência. No entanto, outros autores demonstraram que a activação de TCR com células apresentadoras de antigénio ou 28 anti-CD3 e anti-CD28 com anticorpo de hamster de ligação cruzada durante 2 dias 29 também são meios altamente eficazes de induzir a produção de vários subconjuntos Th. O protocolo aqui apresentado baseia-se em métodos reportados anteriormente para isolar as células CD4 + T murino de órgãos linfóides secundários 30 e geração de células Th17 31. Uma diferença importante é que este protocolo baseia-se na utilização de um separador de células para isolar as células T CD4 + naive a partir de tecidos linfóides. No entanto, muitas empresas já oferecem kits de separação rápidas que podem enriquecer as células T CD4 + naïve, que pode ser capaz de contornar a exigência de fou classificação, dependendo da experiência. Os métodos e reagentes apresentados neste protocolo são o que nós rotineiramente usar e encontrar para ser o mais eficaz. No entanto, tenha em mente que existem reagentes alternativos e metodologias para muitos dos passos apresentados a seguir e cabe ao laboratório indivíduo para determinar o que funcionará melhor para seus propósitos.

<table><tbody><tr><td>Complete RPMI:</td><td></td><td></td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10 % FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1000X 2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100X Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100X L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>120 micron nylon mesh</td><td>Amazon</td><td>CMN-0120-10YD</td><td>Cut into 2 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; squares and autoclave</td></tr><tr><td>Alternative: 100 micron cell strainers</td><td>Fisher</td><td>08-771-19</td><td>Alternative to cutting nylon mesh</td></tr><tr><td>autoMACS running buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>autoMACS rinsing solution</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td>Warm in a 37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C water bath before use</td></tr><tr><td>CD4 beads</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytokines:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human (h) IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-6</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>406-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>hTGFb</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2C11 (anti-CD3)</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td></td></tr><tr><td>37.51 (anti-CD28)</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>11B11 (anti-IL-4)</td><td>BioXcell</td><td>BE0045</td><td></td></tr><tr><td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td><td>BioXcell</td><td>BE0055</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L-FITC</td><td>BioLegend</td><td>104406</td><td>Use at 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD25-PE</td><td>BioLegend</td><td>102008</td><td>Use at 1:400</td></tr><tr><td>anti-CD4-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>100434</td><td>Use at 1:1000</td></tr><tr><td>anti-CD44-APC</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td>Use at 1:500</td></tr><tr><td>Phorbol&amp;nbsp; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8139</td><td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0634</td><td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBioscience</td><td>00-4506-51</td><td>Use at 1:1000</td></tr></tbody></table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

O ponto de tempo para a análise de diferenciação pode variar dependendo da condição a ser testado Th, bem como a força de activação do receptor de células T. Depois de 2-3 dias de diferenciação, as células podem ser visualizados por microscopia óptica para determinar a extensão da proliferação de células T. Wells expositoras extensa proliferação e aglomeração de células provavelmente estará pronto para análise no dia 4. condições de diferenciação contando com a adição de IL-2, tais como Th1...

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.7K visualizações.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

Vídeo: Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Imunologia e Infecção

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivação de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De Mouse Células-Tronco Embrionárias

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly secretes GM-CSF without producing interferon (IFN)&#947; or interleukin (IL)-17 and is found to play an essential role in the autoimmune neuroinflammation. A method of isolation of naive CD4+ T cells from a single-cell suspension of splenocytes and THGM cell generation from naive CD4+ T cells would be a useful technique in the study of T cell-mediated immunity and autoimmune diseases. Here we describe a method that differentiates mouse naive CD4+ T cells into THGM cells promoted by IL-7. The outcome of the differentiation was assessed by the analysis of the cytokines expression using different techniques, including intracellular cytokine staining combined with flow cytometry, a quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR), and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Using the THGM differentiation protocol as described here, about 55% of the cells expressed GM-CSF with a minimal expression of IFN&#945; or IL-17. The predominant expression of GM-CSF by THGM cells was further confirmed by the analysis of the expression of GM-CSF, IFN&#945;, and IL-17 at both mRNA and protein levels. Thus, this method can be used to differentiate naive CD4+ T cells to THGM cells in vitro, which will be useful in the study of THGM cell biology.

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

Here, we present a protocol to differentiate murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) cells from naive CD4+ T cells, including isolation of naive CD4+ T cells, differentiation of THGM, and analysis of differentiated THGM cells. This method can be applied to studies of the regulation and function of THGM cells.

In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

<meta charset="utf8"></head><body>Diferenciação de células Th17 de células T CD4 + virgens usando citometria de fluxo

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Alcançando diferenciação in vitro de alta pureza de células Th17 usando modulação de concentração de citocinas

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

Diferenciação in vitro de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

Rato Naïve CD4

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Derivação de células T

Na diferenciação in vitro de células T CD4 ⁺ humano FOXP3 ⁺ Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 ⁺ usando um protocolo de TGF-β contendo

In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (T_HGM)

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Diferenciação in vitro de células T CD4⁺ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos

Diferenciação in vitro de células T CD4⁺ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos