מקס פלאנק החברה ומלגת קבוצת ג&#39;וניור בית הספר למוסמכי גטינגן לHB במימון עבודה זו.

1. מכשירים, תרבות מדיה, ומנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ, כי הוא מסוגל לשמור על המדגם בפוקוס וכי הוא מצויד בשלב אוטומטי. לבנות דוד מכסה מחוייט או לרכוש פתרון מסחרי. הגדרת LED-EMCCD מערכת מצלמה שבחשיפה של המצלמה מתעוררת בי LED תאורה באמצעות אות TTL באמצעות הוראות יצרן. הערה: ראה דיון לפרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Polydimethylsiloxan בולים (PDMS): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק בולי PDMS במתקן מיקרופלואידיקה או יש לי בולי PDMS המיוצרים על ידי יציקה מסחרית. כדי להשתמש ביציקה מסחרית, לשלוח קובץ AutoCAD לחברה ולציין את העומק (15 מיקרומטר, למשל) של המכשיר. לאחר לידה מבית היציקה, לחתוך את שבב PDMS לבולים שלה 16 באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בונד כל חותמת פרט לשקופית זכוכית באמצעות פלזמה אוויר. עבור מליטה, לחשוף גם את חותמת PDMS ואת שקופיות זכוכית לפלזמת אוויר לדקות התקף 1 (באמצעות הגדרות הפלזמה הגבוהות ביותר ברמה של 0.5 mbar). ודא שהמשטחים למליטת הפנים כלפי מעלה במהלך טיפול פלזמה. לאחר מכן, הנח את חותמת PDMS לשקופית הזכוכית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח צלחת תחתית 3.5 סנטימטר ולחתוך את אזור כיכר של 18 x 18 מ&quot;מ מהמרכז התחתון של המנה באמצעות מכונת כרסום אנכית וחותכים סיבוביים חדים. השתמש מהירות סיבוב נמוכה של הלהב והאכלה איטית כדי למנוע מהפלסטיק נמס בשל חום המיוצר על ידי חיכוך. הכן כמה מנות בבת אחת. הערה: צלחת התחתית ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות לאחר הניסוי אם הוא ניקה אחרי השרייה בO אתנול הטהור / ​​N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר agarose נקודה גבוה היתוך 3 גרם ב -100 מיליליטר S-סל (5.85 גרם NaCl, 1 גרם K 2 4 HPO, 6 גרם KH 2 PO 4, כולסטרול מיליליטר 1 (5 מ&quot;ג / מיליליטר אתנול), H 2 O ל 1 L, לעקר ידי מעוקר) על ידי הרתחה. הפוך aliquots של מומס agarose ב 2 מיליליטר צינורות Eppendorf וstorדואר. כמו כן, להכין את קבוצה של agarose נקודת התכה נמוכה באותה הדרך בדיוק כפי שagarose הנקודה גבוה ההיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימוש, מקום 3 aliquots של נקודה גבוהה היתוך agarose על בלוק חימום ב 95 - C ° 98. לפני שימוש, מקום אחד aliquot של נקודת התכה נמוכה agarose על בלוק חימום ב95-98 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס ולאחר מכן על בלוק חימום ב30-35 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. בחירה של בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תולעים בצפיפות נמוכה על צלחות NGM זרע להשיג חיות נקיות. ודא שיש שפע של מזון וכמה בעלי חיים רק על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזחלי L1 הדמיה, להעביר כ -30 ביצים המכילות עובר בשלב הכעך על צלחת NGM זרע טרי. להעברת שלבים מאוחר יותר זחל או ג הבוגר elegans, להעביר כ -30 תולעים על צלחת NGM זרע טרי. </li></ol> 3. הכנת Microchambers Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת המנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">קח צלחת פלסטיק עם פתח מרובע של 18 x 18 מ&quot;מ בתחתית ומניח אותו במהופך עם הפתיחה כלפי מעלה. סגור את הפתיחה על ידי הצבת חתיכת הסרט דביק-צדדי כפול של 20 x 20 מ&quot;מ על הפתיחה. הפעל את המנה סביב כך שהסרט הדביק הוא בתחתית ומניח את הצלחת על משטח קשה. חותך את הפתיחה חופשית באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000, למלא 2 מיליליטר של 3% agarose נקודה גבוה היתוך בS-סל לתוך הצלחת. מניחים את agarose על האזור המקיף את הפתח ולתת לחזק. חכה עד agarose הוא מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסתובב הצלחת ולקלף את סרט מגן המכסה את הקלטת דו צדדי הדביקה, כך שהצד הדביק יישאר על הצלחת ויהיה חשוף. הערה: כתוצאה מכך, טבעת יפה של סרט דביק תקיף מחוץ לפתיחה. Agarose משמש כמאגר לחות שמאוחר יותר יהיה להקיף את המדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יציקה של microchambers: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף המשטח PDMS דואר ליציקה עם פלזמה אוויר למשך 20 - 60 שניות. הערה: טיפול פלזמה זה הופך את פני השטח PDMS הידרופילי, המונע את הלכידה של בועות אוויר ומייצר הדפסים חדים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות שני מפרידי של גובה שווה על ידי לערום 5-9 שקופיות זכוכית. מקום, במקביל לצדם הארוך, ערימת spacer הראשונה, אז שקופית יחידת זכוכית, ואז שוב ערימת spacer. מניחים את שקף הזכוכית המכיל את חותמת PDMS orthogonally פני מפרידי. התאם את הגובה של מפרידי, כך שיש מרחב של כ -1.5 מ&quot;מ בין משטח דפוס של בול PDMS ואת שקופיות זכוכית היחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של agarose נקודה החם הנוזלי גבוה היתוך לשקופית כוס אחת ליד חותמת PDMS ומהירות להחליק PDMS להחתים אנכי לתוך agarose הנוזלי. בואו agarose לחזק. בדוק שהוא מקבל מראה אטום, אשר בדרך כלל לוקח בערך 2 דקות. לשלוף את החותמת אנכית עם מהלך אחד. הערה: זה נוח לGLUE spacer מחליק יחד עם קלטת דו צדדי דביקה. התנועה האנכית של הבול מונעת בועות אוויר מנלכדה בagarose. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הביצים או התולעים יחד עם OP50 חיידקים על גבי agarose באמצעות בחירת חוט פלטינה עדינה. להפיץ ביצה אחת או תולעת אחד לתא יחד עם מזון באמצעות עפעף. מלא כ -30 ביצים על משטח אחד agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את לוח agarose מכיל microchambers מולא בריבוע של 15 x 15 מ&quot;מ על כך שיתאים בצורה יפה בפתיחה של המנה. להרים את לוח agarose המרובע עם מלקחיים ומניחים אותו במהופך על coverslip זכוכית של 20 x 20 מ&quot;מ. ירדו פעם אחת, לא להרים אותו שוב או להחליק אותו מסביב כי זה עלול לגרום לחיידקים והתולעים שדחפו את התאים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצרת של המנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslip הזכוכית על פתיחת צלחת הפלסטיק. לחץ בעדינות את coverslip הזכוכית על הטבעת עשויה מקלטת דו צדדי דביקה.יש להיזהר שלא לשבור את הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הצלחת הפוכה ולהשתמש פיפטה P1000 כדי למלא את הפער בין הלוח אגר המכיל microchambers ומאגר agarose עם agarose נקודת התכה נמוכה נוזל מקורר לכ -30 מעלות צלזיוס. חכה עד agarose יש הקרושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם מכסה. עבור מיקרוסקופים הפוכים להשתמש מכסה מחומם. עבור מיקרוסקופים זקופים להשתמש מכסה רגיל ולאטום את הצלחת עם Parafilm. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שסיימתי את הכנת microchambers, לבדוק אותם תחת סטראו. המילוי הנכון הוא קריטי. ראה דיון לפרטים. </li></ol> הדמיה 4. סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זנים מהונדסים מבטא חיישני סידן מקודדים גנטי כגון HBR16 (goeIs5 [pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: UNC-54-3&#39;UTR, UNC-119 (+)]) 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ מתחם מצויד לepifluorescence רחב בתחום. חבר את פלט TTL של המצלמה EMCCD לקלט TTL של LED, כך שכל פעם שהמצלמה מתעדת מסגרת המדגם יהיה מוארת. השתמש זמן חשיפה של כ -5 אלפיות שניים. השתמש רווח EM בטווח של 50 - 300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין ריצת סרט פרץ לשעה 24 בכל תולעת שצלמה כל 15 - 30 דקות הראשונות במשך 20 שניות עם דסק&quot;ש, אז במשך 20 שניות עם הקרינה GFP להקליט GCaMP, ולאחר מכן לקחת תמונה סופית של אות mKate2 נלקח ל שליטה על רמות ביטוי. השתמש במסגרת שיעור של 2 / sec בכל פרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקת נתונים חזותית, להשתמש במפה בצבעים מלאכותיים כדי לשפר את הנראות של שינויים קטנים בעוצמת הקרינה. נתונים עלילת ניאון כΔF / F, עם F להיות ערך הבסיס הממוצע של הקרינה. ניתן למצוא תיאור מפורט של ניתוח נתונים סידן בספרות 20. </li></ol> 5. AMI המקביל של תולעים מרובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת המכילה את microchambers על מיקרוסקופ, להתמקד במדגם ולעסוק autofocus. הגדר את פרוטוקול תוכנה כך שהמצלמה רוכשת פרץ של 40 מסגרות תמונה ב -20 שניות בכל חצי שעה למשך 24 שעות, שתגרומנה 1,920 מסגרות לתולעת, כמות סבירה של נתונים. להגדיר את הסריקה, כך שהוא מבקר בכל תולעת באמצעות הבמה. מטרה לצלם כ -30 תולעים בריצה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים מרובים תמונה על ידי התקרבות החוצה, כלומר, באמצעות הגדלה נמוכה. השתמש בהגדלה נמוכה כדי לכסות כמה microchambers עם שבב המצלמה ולצלם כמה microchambers הסמוך בו-זמנית. לאחר סיום רכישת תמונה, להפריד את הנתונים עבור כל תא בודד על ידי חיתוך אזור של עניין כיסוי חיה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך במהירות את נתוני ניידות, להשתמש חיסור מסגרת 28-32. </li></ol> 6. שלבי חיים שונים של ההדמיה ג elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש microchambers agarose לכל שלבי החיים של ג elegans מL1 למבוגרים וdauers כולל. השתמש בממדי התא המתאימים לDIFשלבי החיים ferent שמוצגים בטבלה 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שלב חיים </td><td> גודל תא </td><td> עומק הלשכה </td><td> זמן הקלטה טיפוסי </td><td> הגדלה </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 מיקרומטר </td><td> 10 - 15 מיקרומטר </td><td> ביצה - אמצע L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 מיקרומטר </td><td> 15 מיקרומטר </td><td> ביצה - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> זחל dauer </td><td> 370 x 370 מיקרומטר </td><td> 25 מיקרומטר </td><td> 4 ימים </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 מיקרומטר </td><td> 45 מיקרומטר </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 מיקרומטר </td><td> 45 מיקרומטר </td><td> L4 הצעיר - מבוגרים צעירים </td><td> 100X </td></tr><tr><td> מבוגרים צעירים </td><td> 700 x 700 מיקרומטר </td><td> 45 מיקרומטר </td&gt; <td> 12-24 שעות </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> טבלת 1. גדלי הלשכה לשלבי חיים שונים. מוצגים הם ממדי תא והגדלה כי הם שימושיים עבור שלבים שונים מותאמים לשבב מצלמה 8 x 8 מ&quot;מ.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2012).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10, 877-879 (2013).</li><li>Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+tracking+and+behavioral+measurement.">C. elegans tracking and behavioral measurement.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).</li><li>Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+movement+behavior+of+multiple+worms+on+food.">Tracking movement behavior of multiple worms on food.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in.">High-throughput behavioral analysis in.</a> C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3, e2208 (2008).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).</li><li>Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+hydrogel+microcompartments+for+imaging+sleep-+and+wake-like+behavior+and+nervous+system+development+in+Caenorhabditis+elegans+larvae.">Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).</li><li>Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-microfluidic+methods+for+imaging+live.">Non-microfluidic methods for imaging live.</a> C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , 1-19 (2013).</li><li>Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+microfluidic+system+for+individual+Caenorhabditis+elegans+assay.">Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay.</a> Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).</li><li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies.">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of.</a> C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+mechanosensory+neurons+demonstrates+a+specific+role+for+the+MEC-4+channel+in+the+process+of+gentle+touch+sensation.">In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation.</a> Neuron. 39, 1005-1017 (2003).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage-gated+calcium+channel+subunit+genes+on+calcium+influx+in+cultured+C.+elegans+mechanosensory+neurons.">Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons.</a> Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).</li><li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , 1-13 (2006).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, e198 (2008).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li><li>Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP2+transcription+factor+is+required+for+a+sleep-active+neuron+to+induce+sleep-like+quiescence+in.">An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in.</a> C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Notch+Signaling+Regulates+Adult+Chemosensory+Response+and+Larval+Molting+Quiescence.">C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence.</a> Current Biology. 21, 825-834 (2011).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451, 569-572 (2008).</li><li>Iwanir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+C.+elegans+behavior+during+lethargus:+homeostatic+bout+dynamics,+a+typical+body+posture,+and+regulation+by+a+central+neuron.">The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron.</a> Sleep. 36, 385-395 (2013).</li><li>Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+behavioral+quiescence+in+Caenorhabditis+elegans.">Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. , (2014).</li><li>Nagy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+Caenorhabditis+elegans+larvae+reveals+a+novel+locomotion+switch,+regulated+by+Galphas+signaling.">A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling.</a> eLife. 2, e00782 (2013).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).</li><li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

חומרה המיקוד של מיקרוסקופ בדרך כלל ייסחף במהלך רכישת תמונה לטווח ארוך. עבור מיקרוסקופי מתחם, להתמקד-שמירת מערכות ניתן לרכוש מהיצרנים הגדולים מיקרוסקופ. במקרה מיקרוסקופ מתחם עם שליטת דגש הוא יקר מדי, חלופה פשוטה תהיה להשתמש סטראו. מיקרוסקופי מתחם לאפשר את השימוש ביעדים עם צמצם גבוה מספרי (NA) ויכולים להיות אוטומטיים בקלות. מטרות שמן 40X מתאימות גם. עדשות טבילה במים הן לא אידיאליים בגלל האידוי במהלך הדמיה לטווח ארוך. התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) יוצרת ניגוד נחמד שעוזר למעקב שינויים מורפולוגיים והתנהגות, אלא גם הדמיה שדה בהירה פשוטה ניתן להשתמש. לדסק&quot;ש או הדמיה שדה בהירה, להשתמש באור אדום על ידי הצבת מסנן אור אדום לתוך נתיב Dia-הארת מיקרוסקופ. לסריקה של כמה microchambers שלב אוטומטי הוא הכרחי. הביצועים הטובים ביותר הוא AChieved כאשר שלב משמש שיש האצה והאטה קוי וניתן להגדיר את מהירות סריקה נמוכה כדי למנוע הפרעה לבעלי החיים במהלך סריקה. אנחנו לא נצפו תגובות התנהגותיות או עליית סידן בתאי עצב mechanosensitive (ALM וPLM) במהלך סריקה, המצביעות על כך סריקה איטית אכן לא להפעיל את מערכת mechanosensitive של התולעת (מידע לא מוצג). ניתן להשתמש במערכות LED מסחריות. מספר חברות מציעות פתרונות מוכנים לשימוש הכוללים נוריות באורכי גל שונים. הנורית צריכה את האפשרות של חיצוני מפעילה LED עם אות TTL. מצלמה רגישה מאוד נחוצה לסידן הדמיה של העברת בעלי חיים. מצלמות EMCCD הן המצלמות רגישות ביותר בשוק. המצלמה צריכה להיות פלט TTL במהלך החשיפה (פלט &quot;אש&quot; המכונה גם). דוד מיכסה הנדרש כדי למנוע התעבות על המכסה אם באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. במיקרוסקופ זקוף, הצלחת תוצב כך שWi המכסהאהיה בתחתית ובכך עיבוי מנע ולא חימום מכסה נדרש. המכסה צריך חוזקה לסגור את הצלחת על מנת למנוע אידוי של מים במהלך הדמיה לטווח ארוך. בולי PDMS פני השטח של חותמת PDMS המכילה את המבנה ליציקת agarose מתמודד משקופיות הזכוכית, התומכת בחותמת PDMS. ניתן למצוא רשימה עם חברות המציעות שבבי מייקרו-נוזליים מותאם אישית על ויקיפדיה <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">(http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies).</a> מילוי נמטודות לתאיהם זהו השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול ויש לשקול את הנקודות הבאות:) הריריות של agarose היא קריטיות להעברת התולעים והדמיה. אם agarose לח מדי, כלומר, יש Cov נוזליering על שטח של כמה microchambers, זה לא יהיה אפשרי לחלק מזון ותולעי חיידקים באופן מבוקר כי הנוזל יהפוך את החיידקים לזרום משם. אם agarose יבש מדי אז החיידקים ותולעים לא יכולים לקבל את הבחירה בקלות מה שאומר שהכוח מוגבר צריך לשמש לרדת תולעים וחיידקים שגורמים לניזק בקלות לagarose. בעת המילוי בהרבה תולעים agarose עלול להתייבש. במקרה הגרוע ביותר agarose יהיה כל כך יבש בסופו של הדבר שתאי יקרסו. אם agarose יבש מדי ניתן rehydrated זה על ידי הצבת טיפה קטנה (כ 2 μl) של S-סל על הצד של השבב שבו אין תולעים. לאחר מכן טובל את חוט הפלטינה להרים לתוך הנוזל ואפילו למשוך חלק מהנוזל לאזור שבו התאים מלאים בתולעים. B) כמות המזון היא קריטית עבור הדמיה מוצלחת לטווח ארוך. אם אין מספיק אוכל, התולעים יכולים נגמרים שלו. אם יש אוכל מוגזם החלל של החדרלא מתנהג כמו נוזל אלא כמו מוצק ויאפשר תולעים לברוח מהחדר על ידי דחיפת החיידקים. מטרה לקבל השעיה חיידקים שממלאת את כל החדר. התולעים נמצאים בקשר מתמיד פיזי עם המשטח אגר וזכוכית לאורך רוב אורכם במהלך הניסוי והתנהגות הזחילה נראית דומה לתנועה על צלחת ושונה לחבטו בנוזל. ג) מכאני המזיק של agarose יכול להרוס את הניסוי. בחירת קנס היא חיונית. לא צריכים אותו פינות חדות. ריסים רכים שמחוברים לקצה pipet ניתן להשתמש כדי להעביר חיידקים או תולעים לתאים במקום להשתמש איסוף פלטינה. ברוב המקרים, עם זאת, agarose overdried היא הסיבה לנזק. הבחירה או עפעף צריך, באופן אידיאלי, רק בקושי נוגע בagarose עצמו, ואת סרט מים על פני השטח agarose צריך למשוך את התולעים וחיידקים. כאשר איטום התאים, שוב, את הלחות של agarose היא חיונית. לא צריךלהיות כל נוזל חופשי על פני השטח agarose כי זה עלול לשטוף את החיידקים ותולעים באיטום. בועות גדולות ניתן להסיר בעדינות על ידי הרמת פינה של הלוח אגר. בועות קטנות שהם קטנים יותר מאשר התא לעתים קרובות להילכד בתוך התאים. בועות אלה הן לא בעיה ותיעלמנה על ידי קליטה. לאחר הרכבת הצלחת, לבדוק שוב שagarose הוא לא יבש או רטוב מדי. התאים צריכים להיות יפה אטומים ולא צריך להיות שום זרימה של נוזל בין תאים. אם agarose הוא רטוב מדי, התאים לא לאטום כמו שצריך. תולעים יכולים לברוח או האוכל שלהם יהיה נשטף. אם המדגם הוא לח מדי, פשוט לפתוח את המכסה ולתת יבש agarose לדקה או שתיים. אם agarose הוא יבש מדי, התאים עלולים לקרוס והתולעים לברוח. גמלון ידי התרחקות הדמיה הקרינה, להתרחק מוגבל על ידי הכמות הנמוכה של אור המתקבל בהגדלה נמוכה. כמו כן, Eמצלמות MCCD מותאמות לרגישות ולעתים קרובות יש רזולוציה נמוכה יחסית. עם זאת, גמלון הדמיה פי ארבעה הוא גם אפשרי. לדוגמא, ארבעה חדרים של 190 מיקרומטר x 190 מיקרומטר יכולים להתאים למסגרת אחת בעת השימוש 140X הגדלה (מושגת באמצעות 20X אובייקטיבי ומצלמה 0.7X הר) ופיקסל 512 x 512, 8 x 8 מ&quot;מ מצלמה. מצלמה ברזולוציה גבוהה עם שבב גדול (כגון מצלמות sCMOS, 16.6 מ&quot;מ x 14 מ&quot;מ שבב, 2560 x 2,560 פיקסלים = 5.5 מגה פיקסל) מייעלת גמלון של דסק&quot;ש והדמיה שדה בהיר. לדוגמא, עד 30 תולעי L1 ב190 מיקרומטר x 190 מיקרומטר תאים יכולים להתאים לכל מסגרת של המצלמה בעת השימוש בהגדלת 100x (ראה איור 3). בעיקרון, להתרחק וסריקה גם יכולה להיות משולבת כדי להשיג מספרים גדולים עוד יותר של בעלי חיים. רוב הנוירונים להישאר די טוב בפוקוס, כך שרק אחד מישור מוקד צריך להיות צילם. אם נוירונים נמצאים לצאת מהפוקוס, AZ סריקה באמצעות כונן piezo ניתן לקחת בכל פעם עמ &#39;oint. הסתגלות להתנהגויות שונות פרוטוקול זה נותן רעיון טוב של ההתנהגות על פני טווחי זמן ארוך. ברור, העיתוי של ההתפרצויות צריך להיות מותאם להתנהגויות שונות ושלבי חיים. מגבלות של הטכניקה מספר גורמים להגביל את משך הזמן של הדמיה. החשוב ביותר היא כמות המזון. ברגע שהמזון נצרך, זחלים יפסיקו לפתח. לפיכך, בתאים קטנים תולעים (190 x 190 מיקרומטר) לפתח עד שלב L3 ולאחר מכן לעצור. אם נדרש זמן ארוך יותר הדמיה, תאים גדולים יותר צריכים להיות בשימוש. משך הזמן המרבי של הדמיה לטווח הארוך הוא בטווח של 2.5 - 3 ימים. אם נדרש הדמיה יותר, התולעים צריכים להיות התאוששו והניחו לתאי חדשים. כאשר ההדמיה תולעים בוגרות, מגבלה אחרת נגרמת על ידי הצאצאים של התולעים האלה. תולעים בוגרות מטילות ביצים שממנו בוקע זחלים. זחלים אלה גם יישארו בתוך החדר, לצרוך מזון, ועלול להפריע לניתוח התמונה. אם צאצאים היא בעיה, פתרון הוא או להשתמש מבוגרים סטרילי או למקום שוב ושוב את התולעים לתאי טריים. כדי לשחזר תולעים, לוח agarose המכיל את התא הוא לחתוך חינם עם אזמל, הוא משך את coverslip, וממוקם על צלחת NGM שממנו ניתן לשחזר את התולעים. מגבלה נוספת היא ההגבלה של התולעים לאזורים קטנים יחסית. זה עלול להיות בעיה אם תנועה ארוך טווח צריכה להיות מנותחת. בעוד בעלי חיים בתאים יכולים להיות מגורה באופן מכאני וoptogenetically 21,27,34,35, הטבע האטום של החדר יקשה ליישם ממריצים מסיסים או הפכפכים. גזים ביולוגיות חשובים כגון חמצן או פחמן דו חמצני יכולים לפזר בחופשיות באגר. מאגר האוויר הגדול בצלחת צריך לשמור על ריכוז הגז בתאים קבועים על פני הזמן הדרוש לניסויים. עם זאת, יש לזכור כי concentratio החמצן המקומיn בתא עשוי להיות דומה יותר לתנאים שנמצאו בתרבות נוזלית מתרבות על הצלחת. משמעות ביחס לשיטות קיימות מכשירי microfluidic התקדמו התנהגות והתפתחותי מאוד למדו בג elegans. לעתים קרובות, מבני microfluidic עשויים 12 PDMS. כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי תרבות microfluidic עשויים agarose. כוחה של טכניקה זו הוא השילוב של איכות גבוהה הדמיה, מתאם של התנהגות עם מדידות פיסיולוגיות, הדמיה לטווח ארוך, ותפוקה גבוהה באופן סביר. איכות תמונה גבוהה מושגת על ידי הדמיה באמצעות coverslip הזכוכית באמצעות מטרות NA גבוהות. כתוצאה מכך, ניתן לבצע הדמיה הקרינה כגון הדמיה סידן והדמיה confocal של מבני subcellular. בגלל בעלי החיים אינם משותקים כמו במערכות אחרות, זה מאפשר התאמה של התנהגות עם מדידות פיסיולוגיות. בקause יש בעלי החיים מזון בשפע, הם ממשיכים בפיתוח המאפשרים הדמיה לטווח ארוך. מערכת זו יכולה תולעים רבים תמונה בריצה אחת, כי בעלי חיים מוגבלים לתאי המוגדרים שלהם. כך, בשיטה זו ניתן לשנות בקלות 9,27,34-36. יישומים עתידיים עד כה, מערכת זו נעשתה שימוש בעיקר ללמוד שנת התנהגות בג זחלי elegans L1. עם זאת, ההסתגלות לכל השלבים תאפשר ללמוד מגוון רחב של התנהגויות גם בdauers ומבוגרים. מגוון רחב של התנהגויות ניתן ללמוד עם טכניקה זו החל הזדווגות להטלת ביצים.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>high-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP(E)164-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Vision Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compound microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>now sold as iXon Ultra 897</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-23G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lid heater</td>
			<td>MPI workshop</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Nano Scan Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x-y-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Proscan III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stamp</td>
			<td>Abbott Laboratories&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red light filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET660/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td colspan="2">Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided sticky tape</td>
			<td>Sellotape/Henkel</td>
			<td>double sided 12mm x 33 m</td>
			<td>alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

ההתנהגות נשלטת על ידי מערכת העצבים. סידן הדמיה היא שיטה פשוטה בנמטודות השקופה Caenorhabditis elegans כדי למדוד את הפעילות של תאי עצב בהתנהגויות שונות. כדי לקשר בין פעילות עצבית בהתנהגות, בעלי החיים לא צריכים להיות משותקים אבל צריך להיות מסוגל לנוע. שינויים התנהגותיים רבים מתרחשים במהלך קשקשי זמן רבים ודורשים הקלטה על שעות רבות של התנהגות. זה גם עושה את זה הכרחי לתרבות התולעים בנוכחות מזון. איך יכולים להיות מתורבתים תולעים והפעילות העצבית שלהם צילמו על סולמות זמן רבים? Agarose Microchamber ההדמיה (AMI) פותחה בעבר לתרבות ולבחון זחלים קטנים ועכשיו הותאמה ללמוד את כל שלבי החיים המוקדם מL1 עד שלב הבוגר של ג elegans. ניתן לבצע AMI בשלבי חיים שונים של ג elegans. ההדמיה סידן לטווח ארוך מושגת בלי לשתק את בעלי החיים על ידי שימוש בחשיפות קצרה מופעלות חיצוני comתקופות- עם אלקטרון הכפלת הקלטת מכשיר מצלמה (EMCCD) תשלום מצמידים. להתרחק או סריקה יכולה בהיקף של עד בשיטה זו כדי תמונה עד 40 תולעים במקביל. לפיכך, שיטה מתוארת לתמונת התנהגות ופעילות עצבית על סולמות זמן רבים בכל שלבי החיים של ג elegans.

ניתן ליישם microchambers agarose לכל שלב בחיים של ג elegans. כפי שניתן לראות באיור 1 א, ניתן לצפות פיתוח זחל ושנת התנהגות במהלך lethargus L1. מוצגים הם בגדלים תא שהם 190 x 190 מיקרומטר, 10 מיקרומטר עמוקים. אם קשקשי זמן ארוכים יותר נדרשים, ניתן להשתמש בתאים גדולים יותר. כפי שניתן לראות באיור 1, באמצעות תא עם ממדים גדולים יותר (370 x 370 מיקרומטר, 25 מיקרומטר עמוקים) מאפשר פיתוח של ג elegans מביצה עד למבוגרים. תרשים 1C מציג ניתוח של שינויים ארוך טווח בהתנהגות באמצעות חיסור מסגרת של תולעת גדלה בתא מביצה עד למבוגרים. מוצגים הן עוצמות ממוצעים לאחר ניכוי מסגרת לפרצים נבחרו במהלך שרות וlethargus. נמוך העצימות הממוצעים לאחר ערכי חיסור המסגרת היא, נמוך הניידות של התולעת. מוצגים נבחרו עקבות פרץ ממצב בעקבות אחד ומצב lethargus אחד לכל שלב זחל.עלייה שנצפתה בעוצמה ממוצעת במהלך הפיתוח היא בעיקר בשל ניגוד וגודל מוגברים של בעלי החיים. 1D איור מראה זחל dauer, שלב חיים אלטרנטיבי שעוסק בתנאים סביבתיים שליליים 33 ב. גודל תא הוא 370 x 370 מיקרומטר, 15 מיקרומטר עמוקים. שים לב שזחל dauer הושם לתוך התא ללא חיידקים שבמזון, שיגרום יציאה מהשלב זחל dauer. איור 1E תערוכות תולעת בוגרת שכבר הטילה ביצים רבות לתוך התא. ממדי הלשכה משמשים למבוגרים היו 700 x 700 מיקרומטר, 45 מיקרומטר עמוקים. לבסוף, איור 1F תערוכות אנדרוגינוס מבוגר והזדווגות זכר בתוך תא בוגר. סידן הדמיה בתולעים ניע אפשרית עם חיישני סידן GCaMP. איורים 2A, הדמיה סידן תכנית ב &#39;של הפקודה interneuron AVA לזחל L1 27. איורים 2C, D להראות פעילות סידן לsaשלי סוג של נוירון בבעלי חיים מבוגרים. דרוג את הדמיה לטווח ארוכה הוא אפשרי על ידי סריקה ועל ידי התקרבות החוצה. איור 3 א מציג את איכות התמונה של הדמיה בו זמנית של 30 תולעים על שבב מצלמה אחת עם מצלמה 5 מגה פיקסל. איור 3 מציג את איכות התמונה של 4 תולעי סידן צילם בו זמנית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1. התאמת AMI לכל שלבי החיים של ג elegans. זחל () צילם מתחילת L1 עד השלב מוקדם בL2 190 x 190 מיקרומטר תאים. פיתוח (ב &#39;) מביצה עד מבוגרים בחדר 370 x 370 מיקרומטר. (ג) ניידות של תולעת הוערכה באמצעות חיסור מסגרת. מוצגת היא עוצמת הממוצעת של כל התמונות של התמונה לאחר חיסור מסגרת לסרט פרץ נבחר אחד לכל STA זחלGE לבעקבות והתנהגות lethargus. (ד) זחל dauer בהיעדר מזון בתא מיקרומטר 370 x 370. אנדרוגינוס (ה) למבוגרים עם ביצים רבות הניחו לx 700 700 מיקרומטר קאמרי. (F) הזדווגות של זכר ואנדרוגינוס בתוך חדר 700 x 700 מיקרומטר. YA פירוש מבוגרים צעירים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> הדמיה איור 2. סידן עם עמי. () סידן הדמיה עם GCaMP3 בinterneuron פקודת AVA של זחלי L1 באמצעות האמרגן NMR-1. מוצגים הן שתי תמונות בצבעים מלאכותיים. בתמונה משמאל, הפעילות של AVA היא נמוכה והתולעת לא עושה תנועה לאחור. בתמונה מהימין הפעילות של AVA היא<html> גבוהה והתולעת, הוא נע לאחור. ארעיים סידן (ב &#39;) על פני זמן לתולעת L1. (C, D) ארעיים סידן בבעלי חיים מבוגרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> תולעי איור 3. הדמיה מרובה במקביל על ידי התקרבות החוצה. () הדמיה סימולטני של 30 תולעי L1 לכל מסגרת באמצעות 190 x 190 מיקרומטר תאים והגדלה 100x (באמצעות מטרת 10X) ושבב מצלמה 16.6 x 14 מ&quot;מ. הדמיה סימולטני של ארבעה תולעי L3 לכל מסגרת באמצעות 370 x 370 מיקרומטר תאים וההגדלה 100x ואזור של עניין של שבב מצלמה 16.6 x 14 מ&quot;מ (B).et = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose לסידן הדמיה לטווח ארוך של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.4K Views.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

Video: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

סי אלגנס למידה חיובית Butanone, לטווח קצר, לטווח ארוך מבחני זיכרון אסוציאטיבי

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Readout מולקולרי של הסתגלות חוש ריח לטווח הארוך ב<em&gt; ג elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

לטווח ארוך התנהגות מעקב של Freely בריכה בחולשת דגים חשמליים

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא<em&gt; הידרה</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...