Max Planck Kurumu ve HB için Göttingen Enstitüsü Genç Grubu stipend bu işi finanse.

1. Göstergeler, Kültür Medya ve Yemekleri <ol><li> Odak numune tutma kapasitesine sahip olan ve bir otomatik aşama ile donatılmış bir mikroskop kullanarak. Bir ısmarlama kapak ısıtıcı kurmak veya ticari bir çözüm satın alın. Kameranın poz üreticinin talimatlarına kullanarak TTL sinyali ile LED aydınlatma tetikler hangi bir LED-EMCCD kamera sistemi kurun. Not: Ayrıntılar için tartışma bakın. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) pulları: <ol><li> Bir Mikroakiskan tesisinde PDMS pulları Üretiyor ya da ticari bir dökümhane tarafından üretilen PDMS pul var. Ticari bir dökümhane kullanmak için, cihazın (örneğin 15 um) derinliği şirkete AutoCAD dosya göndermek ve belirtin. Dökümhaneden Doğumdan sonra, bir neşter kullanarak 16 pulları içine PDMS çip kesti. </li><li> Hava plazma kullanarak bir bardak slayt her damga Bond. Yapıştırma için, PDMS damga ve hava plazmaya cam slayt hem maruznöbeti 1 dakika (0.5 mbar, en yüksek plazma ayarlarını kullanarak). Yapıştırılması için yüzeyleri plazma tedavisi sırasında yukarı doğru baktığından emin olun. Ardından, cam slayt üzerine PDMS damga yerleştirin. </li></ol></li><li> 3,5 cm alt çanak alın ve dikey freze makinesi ve keskin döner kesiciler kullanarak çanak alt merkezine 18 x 18 mm kare alana kesip. Sürtünme tarafından üretilen ısı nedeniyle erimesi ile ilgili plastik önlemek için kesici ve yavaş besleme düşük dönme hızı kullanın. Aynı anda birkaç yemekler hazırlayın. Not: Alt çanak deney sonrasında birçok kez tekrar kullanılabilir saf etanol O / N ıslatıldıktan sonra temizlenir eğer. </li><li> Agaroz: <ol><li> 100 ml 3 g, yüksek erime noktalı agaroz eritilir S-Bazal (5.85 g NaCI, 1 g K 2 HPO 4, 6 gr KH 2 PO 4 etanol, 1 mi kolesterol (5 mg / ml), H2 O, 1 L, kaynatarak) otoklavlanarak sterilize edin. 2 ml Eppendorf tüpleri ve stor agaroz eritilir hacimde yapmake. Ayrıca, yüksek erime noktalı agaroz ile tam olarak aynı şekilde, düşük erime noktalı agaroz toplu hazırlar. </li><li> 98 ° C - kullanmayın agaroz 95 bir ısıtma bloğu üzerine yüksek erime noktası 3 bölüntülerin yerleştirmek için önce. 35 ° C - 30 ° C&#39;de bir ısıtma bloğu üzerine daha sonra eritilip kadar 98 ° C - 95 ile agaroz bir ısıtma bloğu üzerinde, kullanımı, düşük erime noktasına sahip olan bir kısım yer önce. </li></ol></li></ol> Hayvanların 2. Seçimi <ol><li> Temiz hayvanları elde etmek için seribaşı NGM plakalar üzerinde düşük yoğunlukta solucanlar büyütün. Gıda ve sadece birkaç hayvanların bol plaka üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Görüntüleme L1 larvaları için, taze bir numaralı seribaşı NGM plaka üzerine simit aşamasında embriyoları içeren yaklaşık 30 yumurta transferi. Daha sonra larva aşamalarını veya yetişkin C aktarmak için elegans, taze numaralı seribaşı NGM plaka üzerine yaklaşık 30 solucanlar aktarın. </li></ol> Agaroz microchambers 3. hazırlanması <ol><li> Yemeğin hazırlanması: <ol><li>Altındaki 18 x 18 mm kare bir açıklığı olan bir plastik tabak almak ve ters yukarı bakacak şekilde açılması ile yerleştirin. Deliğin üzerine 20 x 20 mm çift taraflı yapışkan bant parçası koyarak ağzını kapatınız. Yapışkan bant altta olacak şekilde çanak Arkanı dön ve sert bir yüzeye çanak yerleştirin. Ücretsiz neşter kullanılarak açılış kesin. </li><li> P1000 pipet kullanarak, çanak içine S-bazal içinde% 3 yüksek erime noktalı agaroz 2 ml doldurun. Açılış çevreleyen alan üzerine agaroz yerleştirin ve katılaşmaya edelim. Agaroz katı kadar bekleyin. </li><li> Çanak Arkanı dön ve yapışkan garnitür kalır ve maruz kalacağı ve böylece çift taraflı yapışkan bant kaplayan koruyucu filmi soyulabilir. Not: Sonuç olarak, yapışkan bant ince bir halka açma dışında saracaktır. Agaroz sonra numuneyi çevreleyen bir nem deposu olarak hizmet vermektedir. </li></ol></li><li> Microchambers dökümü: <ol><li> Th Açığa60 saniye - 20 hava plazma ile kalıplama e PDMS yüzeyi. Not: Bu plazma tedavisi hava kabarcıkları yakalama engeller ve daha keskin baskılar üretir, PDMS hidrofil yüzey oluşturur. </li><li> 9 cam slaytlar - 5 istifleme eşit yükseklikte iki ayırıcılar oluşturun. Yeri, uzun tarafı, ilk aralama yığını daha sonra tek bir cam slayt, sonra tekrar bir boşluk yığınına paralel olarak. Aralama karşısında dik PDMS damga içeren cam slayt yerleştirin. PDMS damga kalıp yüzeyi ve tek cam slayt arasında yaklaşık 1.5 mm&#39;lik bir boşluk var ki aralama yüksekliğini ayarlayın. </li><li> PDMS sıvı agaroz içine dikey olarak damga slayt hızla PDMS damga yakın tek cam slayt üzerine sıcak sıvı yüksek erime noktası agaroz bir damla koyun ve. Agaroz katılaşmaya edelim. Genellikle yaklaşık 2 dakika sürer opak bir görünüm, alır emin olun. Tek hareket ile dikey damgasını çekin. Not: gl için uygundurue bırakıcı çift taraflı yapışkan bant ile birlikte slaytlar. damganın dikey hareketi agaroz sıkışıp gelen hava kabarcıkları önler. </li></ol></li><li> Ince bir platin tel çekme kullanarak agaroz üzerine OP50 bakteri ile birlikte yumurta veya solucanlar aktarın. Bir kirpik kullanan gıda ile birlikte bir yumurta ya da odasının başına bir solucan dağıtın. Tek agaroz ped üzerine yaklaşık 30 yumurta doldurun. </li><li> Bu yemeğin ağzına güzel uyuyor ki yaklaşık 15 x 15 mm kare içine doldurulan microchambers içeren agaroz levha kesti. Forseps ile kare agaroz levha Pick up ve 20 x 20 mm cam lamel üzerine baş aşağı yerleştirin. Bir kez düştü, tekrar yukarı kaldırın veya bu bakteri ve solucanlar kendi odalarının dışına itti neden olabilir, çünkü etrafta kaydırın yok. </li><li> Yemeğin Meclisi: <ol><li> Plastik tabak açılması üzerine cam lamel yerleştirin. Yavaşça çift taraflı yapışkan bant yapılmış halkası üzerine cam lamel bastırın.Camı kırmak için özen gösterin. </li><li> Baş aşağı çevirin ve çanak yaklaşık 30 ° C&#39;ye kadar soğutulur microchambers içeren agar levha ve sıvı düşük erime noktası agaroz ile agaroz rezervuar arasındaki boşluğu doldurmak için P1000 pipet kullanın. Agaroz katılaşmış kadar bekleyin. </li><li> Bir kapak ile çanak mühür. Ters mikroskoplar için ısıtmalı kapak kullanın. Dik mikroskoplar için normal bir kapak kullanımı ve Parafilm çanak mühür. </li></ol></li><li> Microchambers hazırlanmasını bitirdikten sonra, bir stereo mikroskop altında onları kontrol edin. Doğru dolgu çok önemlidir. Ayrıntılar için tartışma bakın. </li></ol> 4. Kalsiyum Görüntüleme <ol><li> Böyle HBR16 27 ([PNÖH&#39;ün-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)] goeIs5) olarak genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri ifade transgenik suşları kullanın. </li><li> Geniş alan Epifloresans için donatılmış bir bileşik mikroskop kullanın. Için EMCCD kameranın TTL çıkışını bağlayınKamera örneği yanar bir çerçeve kaydeder her zaman böylece LED TTL girişi. Yaklaşık 5 msn bir pozlama süresi kullanın. 50-300 aralığında EM kazanç kullanın. </li><li> Her 15 görüntülü her solucanı 24 saat bir patlama film çalışan belirtin - daha sonra ilk 30 dakika DIC ile 20 saniye boyunca, GCaMP kaydetmek ve sonra mKate2 sinyalinin son görüntüyü çekmek için bir GFP floresan ile 20 sn alınır sentezleme seviyeleri için kontrolü. Her patlama sırasında 2 / sn kare hızı kullanın. </li><li> Görsel veri denetimi için, floresan küçük değişiklikler görünürlüğünü artırmak için yanlış renk haritası kullanın. F floresan ortalama başlangıç ​​değeri olan ile mesafe kadar taşınmış / F olarak arsa floresan veri. Kalsiyum veri analizi ayrıntılı bir açıklaması literatüründe 20 bulunabilir. </li></ol> Çoklu Worms 5. Paralel AMI <ol><li> , Mikroskop üzerine microchambers içeren çanak yerleştirin örnek üzerinde odaklanmak ve autofo meşgulcus. Kamera solucan başına 1.920 kare, verilerin makul bir miktarın neden olacaktır 24 saat, 20 saniye içinde her yarım saatte 40 resim karelerinin bir patlama kazanır, böylece bir yazılım protokolünü ayarlayın. Bu sahne kullanarak her solucanı ziyaret böylece tarama ayarlayın. Tek vadede yaklaşık 30 solucanlar film hedefleyin. </li><li> Daha düşük büyütme kullanılarak, yani uzaklaştırma Image birden solucanlar. Kamera çip ile birkaç microchambers kapsayacak ve aynı anda birden fazla bitişik microchambers film düşük büyütme kullanın. Görüntü elde etme sonunda, bir hayvan kapsayan bir ilgi bölge kırpma yoluyla her odası için verileri ayırın. </li><li> Hızlı hareketlilik verilerini değerlendirmek için, çerçeve çıkarma 28-32 kullanın. </li></ol> C. 6. Görüntüleme Farklı Yaşam Evreleri elegans <ol><li> C. tüm yaşam evrelerinde agaroz microchambers kullanın elegans L1 yetişkin ve dahil dauers için. Dif için uygun odacık boyutlarını kullanınTablo 1 &#39;de gösterilmiştir ferent ömrü aşamaları. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hayat aşaması </td><td> Oda boyutu </td><td> Kamara derinliği </td><td> Normal kayıt süresi </td><td> Büyütme </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 mm </td><td> 10-15 um </td><td> Yumurta - orta L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 mm </td><td> 15 um </td><td> Yumurta - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larva </td><td> 370 x 370 mm </td><td> 25 mikron </td><td> 4 gün </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 mm </td><td> 45 mikron </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 mm </td><td> 45 mikron </td><td> Genç L4 - genç erişkin </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Genç erişkin </td><td> 700 x 700 mm </td><td> 45 mikron </td&gt; <td> 12-24 saat </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Farklı yaşam evrelerinde Tablo 1. Odası boyutları. Gösterildi vardır 8 x 8 mm kamera çipi için optimize çeşitli aşamalarında için yararlıdır odası boyutları ve büyütme.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2012).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10, 877-879 (2013).</li><li>Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+tracking+and+behavioral+measurement.">C. elegans tracking and behavioral measurement.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).</li><li>Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+movement+behavior+of+multiple+worms+on+food.">Tracking movement behavior of multiple worms on food.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in.">High-throughput behavioral analysis in.</a> C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3, e2208 (2008).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).</li><li>Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+hydrogel+microcompartments+for+imaging+sleep-+and+wake-like+behavior+and+nervous+system+development+in+Caenorhabditis+elegans+larvae.">Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).</li><li>Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-microfluidic+methods+for+imaging+live.">Non-microfluidic methods for imaging live.</a> C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , 1-19 (2013).</li><li>Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+microfluidic+system+for+individual+Caenorhabditis+elegans+assay.">Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay.</a> Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).</li><li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies.">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of.</a> C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+mechanosensory+neurons+demonstrates+a+specific+role+for+the+MEC-4+channel+in+the+process+of+gentle+touch+sensation.">In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation.</a> Neuron. 39, 1005-1017 (2003).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage-gated+calcium+channel+subunit+genes+on+calcium+influx+in+cultured+C.+elegans+mechanosensory+neurons.">Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons.</a> Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).</li><li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , 1-13 (2006).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, e198 (2008).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li><li>Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP2+transcription+factor+is+required+for+a+sleep-active+neuron+to+induce+sleep-like+quiescence+in.">An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in.</a> C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Notch+Signaling+Regulates+Adult+Chemosensory+Response+and+Larval+Molting+Quiescence.">C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence.</a> Current Biology. 21, 825-834 (2011).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451, 569-572 (2008).</li><li>Iwanir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+C.+elegans+behavior+during+lethargus:+homeostatic+bout+dynamics,+a+typical+body+posture,+and+regulation+by+a+central+neuron.">The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron.</a> Sleep. 36, 385-395 (2013).</li><li>Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+behavioral+quiescence+in+Caenorhabditis+elegans.">Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. , (2014).</li><li>Nagy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+Caenorhabditis+elegans+larvae+reveals+a+novel+locomotion+switch,+regulated+by+Galphas+signaling.">A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling.</a> eLife. 2, e00782 (2013).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).</li><li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Donanım Bir mikroskop odak noktası genellikle uzun süreli görüntü alımı sırasında sürüklenir. Bileşik Mikroskop, odak tutma sistemleri önemli mikroskop üreticilerden satın alınabilir. Odak kontrolü ile bir bileşik mikroskop çok pahalı durumda, basit bir alternatif Stereomikroskopta kullanmak olacaktır. Bileşik mikroskoplar yüksek sayısal açıklık (NA) ile hedeflerin kullanımına izin ve kolayca otomatik hale getirilebilir. 40X petrol hedefleri uygundur. Suya daldırma lensler nedeniyle uzun süreli görüntüleme sırasında buharlaşma ideal değildir. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) morfolojik ve davranışsal değişiklikleri takip için yardımcı hoş bir kontrast oluşturur, ama basit parlak alan görüntüleme de kullanılabilir. DIC veya parlak bir alan görüntüleme için, mikroskop dia-aydınlatma yoluna bir kırmızı ışık filtresi koyarak kırmızı ışık kullanın. Birkaç microchambers taranması için otomatik sahne gereklidir. En iyi performans acbir sahne doğrusal olmayan hızlanma ve yavaşlama vardır ve tarama sırasında hayvanların rahatsız engellemek için düşük tarama hızı ayarlanabilir olduğu kullanıldığında hieved. Biz solucanın mechanosensitive sistemini aktive değil aslında o yavaş tarama düşündüren davranışsal tepkiler ya da tarama sırasında mechanosensitive nöronların (ALM ve PLM) kalsiyum artışı gözlenen değil (veriler gösterilmemiştir). Ticari LED sistemler kullanılabilir. Birçok şirket, farklı dalga boylarında LED&#39;ler dahil hazır kullanımlı çözümleri sunuyoruz. LED dışarıdan bir TTL sinyali ile LED tetikleme seçeneği olmalıdır. Bir çok duyarlı kamera hayvanlar hareketli kalsiyum görüntüleme için gereklidir. EMCCD kameraları piyasadaki en hassas kameralar. Kamera pozlama sırasında bir TTL çıkışı (aynı zamanda sözde &quot;ateş&quot; çıkışı) olması gerekir. Bir kapak ısıtıcı, bir ters mikroskop kullanılarak, eğer kapak üzerinde yoğunlaşmasını önlemek için gereklidir. Dik bir mikroskop, çanak alınacaktır böylece kapak wialtta olacak ve ll böylece yoğuşma önlenir ve hiçbir kapak ısıtma gereklidir. kapak uzun süreli görüntüleme sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için çanak yakın sıkıca gerekir. PDMS pulları agaroz kalıplama için yapısını içeren PDMS damga yüzeyi uzak PDMS damga destekleyen cam slayt, gelen karşı karşıya. Özel mikroakışkan cips sunan şirketlerle bir liste Wikipedia&#39;da (bulunabilir <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Onların odalarına nematodların Dolum Bu protokolde en kritik adımdır ve aşağıdaki noktalar dikkate alınmalıdır: A) agaroz nemlilik solucanlar aktarmak için ve görüntüleme için çok önemlidir. Agaroz, yani çok nemli ise, bir sıvı cov varBirkaç microchambers bir alanı ering, sıvı bakteri akıp yapacak çünkü kontrollü bir şekilde bakteriyel gıda ve solucanlar dağıtılması mümkün olmayacaktır. Agaroz çok kuru ise, bakteri ve solucanlar artan kuvvet kolayca agaroz zarar verir solucanlar ve bakteri damla kullanılması ihtiyacı var demektir kolayca seçim kurtulmak olmayabilir. Solucanlar bir sürü doldururken agaroz kadar kuru olabilir. En kötü durumda agaroz odaları çökecek sonunda çok kuru olacak. Agaroz çok kuru ise hiçbir solucanlar vardır çip yüzüne küçük bir damla S-Bazal (yaklaşık 2 ul) koyarak rehidre edilebilir. Sonra sıvı içine almak platin tel daldırma ve hatta odaları solucanlar ile doldurulur alana sıvı bazı çekin. B) Gıda miktarı uzun vadede başarılı görüntüleme için kritik önem taşımaktadır. Yeterli yiyecek yoksa, solucanlar dışarı çalıştırabilir. Aşırı gıda bölmesi boşluğu varsabir sıvı gibi değil, bir katı gibi davranmaz ve solucanlar bakterileri iterek odasına kaçmak için izin verecektir. Tüm odasını dolduran bir bakteri süspansiyonu elde etmek hedefliyoruz. solucanlar deney sırasında kendi uzunluğunun büyük bir kısmı boyunca agar ve cam yüzeyi ile fiziksel olarak sürekli temas halindedir ve tarama davranışı sıvıda dayak bir plaka üzerinde hareket benzer ve farklı gibi görünmektedir. Denemeyi berbat edebilir agaroz zararlı C) Mekanik. İnce seçim esastır. Bu keskin köşeleri olmamalıdır. Bir pipet ucuna bağlı bir seçenek kirpik platin çekme kullanmak yerine bölmelerine bakteri veya solucan hareket ettirmek için kullanılabilir. Çoğu durumda, bununla birlikte, fazla kurutulmuş agaroz hasarı nedeni budur. seçim veya kirpik, ideal olarak, sadece zar zor solucanlar ve bakterileri çekip gereken agaroz yüzeyinde agaroz kendisi ve su filmi temas etmelidir. Odaları sızdırmazlık zaman, yine, agaroz nem gereklidir. Orada olmamalıBu mühürleme sırasında bakteri ve solucanlar yıkayacak çünkü agaroz yüzey üzerinde herhangi bir serbest sıvı olabilir. Büyük kabarcıklar yavaşça agar kütüğün bir köşe kaldırarak uzaklaştırılabilir. Genellikle odaların içinde sıkışıp olsun odasının daha küçüktür Küçük kabarcıklar. Bu kabarcıklar bir sorun değildir ve emilim yoluyla kaybolur. Çanak montaj sonra, agaroz çok kuru ya da çok ıslak olmadığını tekrar kontrol edin. odaları güzel mühürlü olmalı ve odacıklar arasında herhangi bir sıvı akışı olmamalıdır. Agaroz çok ıslak ise, odaları düzgün mühür olmaz. Solucanlar kaçabilir ya da yiyecek arınacak. Numune çok nemli ise, basit kapağı açın ve bir iki dakika için agaroz kurumaya bırakın. Agaroz çok kuruysa, odalar çökebilir ve solucanlar kaçacaktır. Uzaklaştırma tarafından ölçeklendirme Floresan görüntüleme için, uzaklaştırma, düşük büyütmede elde edilen ışığın düşük miktarı ile sınırlıdır. Ayrıca, EMCCD kameralar duyarlılık için optimize edilmiş ve genellikle nispeten düşük çözünürlüğe sahiptir. Ancak, görüntüleme dört kat yukarı ölçeklendirme de mümkündür. 140x (20X Amaç ve 0.7X kamera montaj kullanılarak elde) büyütme ve 512 x 512 piksel, 8 x 8 mm kamerayı kullanırken Örneğin, 190 um x 190 um dört odaları tek bir kare üzerine sığabilecek. (Örneğin sCMOS kameralar, 16.6 mm x 14 mm yonga, 2560 x 2560 piksel = 5,5 Megapiksel gibi) büyük bir çip ile yüksek çözünürlüklü kamera DIC ve parlak saha görüntüleme ölçeklendirme optimize. Bir 100x büyütme kullanırken Örneğin, 190 mikron 30 L1 solucanlar kadar x 190 mikron odaları (bakınız Şekil 3) Bu kameranın her kare üzerine sığabilecek. Prensip olarak, uzaklaştırma ve tarama da hayvanların daha büyük sayıda elde etmek için kombine edilebilir. Sadece bir odak düzlemi görüntülü gerektiğini, böylece çoğu nöronlar, odakta oldukça iyi muaftır. Nöronlar piezo sürücüsü kullanarak taramayı AZ, odak dışına taşımak için tespit edilirse her zaman p alınabiliroint. Farklı davranışları Uyum Bu protokol uzun zaman ölçeklerinde karşısında davranış iyi bir fikir verir. Açıktır ki, patlamaların zamanlaması farklı davranış ve yaşam evrelerinde adapte edilmesi gerekmektedir. Tekniğin Sınırlamalar Çeşitli faktörler görüntüleme süresini sınırlamak. En önemli gıda miktarıdır. Gıda tüketilen sonra, larvalar gelişmekte durdurmak. Böylece, küçük odacıklarda (190 x 190 mm) solucanlar L3 aşamasına kadar gelişebilir ve ardından tutuklama. Uzun görüntüleme zamanı gerekli ise, daha büyük bölümler kullanılması gerekir. 3 gün - Uzun süreli görüntüleme maksimum süresi 2.5 aralığındadır. Uzun görüntüleme gerekli ise, solucanlar geri kazanılır ve yeni odalarına yerleştirilmesi gerekir. Erişkin solucanlar görüntüleme yaparken, başka bir sınırlama bu solucanların yavru kaynaklanır. Yetişkin solucanlar hangi larva yumurtadan yumurta yatıyordu. Bu larvalar da odasının içine kalacak, Gıda tüketmek ve görüntü analizi rahatsız edebilir. Yavrular bir sorun varsa, çözüm steril yetişkin kullanmak ya da taze odalarına solucanlar defalarca yerleştirmektir. Solucanlar kurtarmak için, odacık içeren agaroz kütük bir bisturi ile kesilip olup, lamel çekilir ve solucanlar elde edilebilir olan bir NGM plaka üzerine yerleştirilir. Başka bir sınır nispeten küçük alanlara solucanlar kısıtlamadır. Uzun menzilli hareketi analiz edilmesi gerekir, bu bir sorun olabilir. Odalarına hayvanlar mekanik ve optogenetically 21,27,34,35 stimüle edilebilir olsa da, odanın mühürlü doğası zor çözünür veya uçucu uyarıcılar uygulamak için yapacaktır. Bu oksijen veya karbon dioksit gibi Biyolojik olarak önemli gazlar agar serbestçe yayılabilir. çanak büyük hava deposu deneyleri için gerekli zaman içinde sabit odalarına gaz konsantrasyonlarını tutmalı. Ancak, zihin yerel oksijen konsantrasyon içinde tutulmalıdırn odasında daha plaka üzerinde kültürden daha sıvı kültüründe bulunan koşulları benzeyebilir. Mevcut yöntemlere göre önemi Mikroakışkan cihazlar büyük ölçüde C okudu davranışsal ve gelişimsel gelişmiş elegans. Çoğu zaman, mikro-akışkan yapı PDMS 12 yapılmıştır. Burada agaroz yapılan mikroakışkan kültür odaları oluşturmak için bir protokol açıklar. Bu tekniğin mukavemetli, yüksek görüntü kalitesi, fizyolojik ölçümler, uzun vadeli bir görüntüleme ve oldukça yüksek bir verimlilik ile davranış korelasyon birleşimidir. Yüksek görüntü kalitesi yüksek NA hedeflerini kullanarak cam lamel sayesinde görüntüleme elde edilir. Bunun bir sonucu olarak, örneğin kalsiyum görüntüleme ve hücre içi yapıların konfokal görüntüleme gibi floresan görüntüleme gerçekleştirilebilir. Hayvanlar, diğer sistemlerde olduğu gibi hareketsiz olmadığından, fizyolojik ölçümler davranış bir korelasyon verir. Because hayvanlar bol gıda var, onlar uzun vadeli görüntüleme izin gelişmekte devam. Bu sistem hayvanların belirlenen odalarına bir vadede görüntü pek çok solucan kısıtlanır çünkü. Böylece, bu yöntem kolayca 9,27,34-36 kadar ölçeklendirilebilir. Gelecekteki uygulamalar Şimdiye kadar, bu sistem, C uyku davranışı incelemek için ağırlıklı olarak kullanılmaktadır elegans L1 larvaları. Bununla birlikte, tüm aşamalarında uyum mümkün da dauers ve yetişkinlerde davranışlarının geniş bir çalışma için yapacaktır. Davranışları geniş bir dizi çiftleşme gelen yumurtlama kadar bu teknikle ele alınabilir.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>high-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP(E)164-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Vision Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compound microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>now sold as iXon Ultra 897</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-23G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lid heater</td>
			<td>MPI workshop</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Nano Scan Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x-y-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Proscan III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stamp</td>
			<td>Abbott Laboratories&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red light filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET660/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td colspan="2">Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided sticky tape</td>
			<td>Sellotape/Henkel</td>
			<td>double sided 12mm x 33 m</td>
			<td>alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

Davranış sinir sistemi tarafından kontrol edilir. Kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis çeşitli davranışları sırasında nöron aktivitesinin ölçülmesi için elegans şeffaf bir nematod basit bir yöntemdir. Davranışı ile sinir aktivitesi ilişkilendirmek için, hayvan immobilize olmamalı taşımak gerekir. Birçok davranış değişiklikleri, uzun zaman ölçeklerinde sırasında meydana ve davranış birçok saat boyunca kayıt gerektirir. Bu aynı zamanda, kültür gerekli gıda mevcudiyetinde solucanlar yapar. Nasıl solucanlar kültüre ve sinirsel aktivite uzun zaman ölçeklerinde üzerinden görüntülü olabilir? Agaroz Microchamber Görüntüleme (AMI) daha önce kültür geliştirilmiştir ve küçük larvaları gözlemlemek ve şimdi C. yetişkin aşamasına kadar erken L1 tüm yaşam evrelerini incelemek için adapte edilmiştir edildi elegans. AMI C. çeşitli yaşam evrelerinde yapılabilir elegans. Uzun vadeli kalsiyum görüntüleme com kısa dışarıdan tetiklenen pozlama kullanarak hayvanları hareketsiz olmadan elde edilirşarj çiftli cihaz (EMCCD) kamera kaydını çarparak bir elektron ile kombine. Uzaklaştırma veya tarama paralel 40 solucanlar kadar görüntü bu yöntemi kadar ölçeklendirilebilir. Böylece, bir yöntem C. tüm yaşam evrelerinde uzun zaman ölçeklerinde üzerinde görüntü davranış ve sinirsel aktivite açıklanan elegans.

Agaroz microchambers C arasında herhangi bir yaşam aşamasında uygulanabilir elegans. Şekil 1A&#39;da görüldüğü gibi, L1 lethargus sırasında larva gelişimi ve uyku davranışı görülmektedir. Derin 190 x 190 mm, 10 mm olan bölme boyutları Gösterildi. Daha uzun bir zaman ölçekleri gerekliyse, daha büyük odaları kullanılabilir. Daha büyük boyutlu (370 x 370 um, 25 um derinliğinde) olan bir odacığı kullanılarak, Şekil 1B&#39;de görüldüğü gibi C geliştirilmesini sağlar elegans yumurtadan yetişkin kadar. Şekil 1C yetişkin kadar yumurtadan bir odasında yetişen bir solucanın çerçeve çıkarma kullanarak davranışı uzun vadeli değişikliklerin analizini göstermektedir. Sonrasında ve lethargus sırasında seçilen patlamaları için çerçeve çıkarma sonrası ortalama şiddetleri gösterilir vardır. solucanın hareketlilik alt çerçeve çıkarma değerleri sonrası ortalama yoğunluğudur düşük. Gösterilen bir uyandırma durumu ve larva dönemi başına bir lethargus durumundan patlama izleri seçilir.gelişimi sırasında ortalama yoğunluk gözlenen artış hayvanın artan kontrast ve büyüklüğü çoğunlukla kaynaklanmaktadır. Şekil 1D bir Dauer larva, olumsuz çevre koşulları 33 sırasında devreye girer alternatif yaşam aşamasını gösterir. Oda boyutu 370 x 370 mm, 15 mm derin. Dauer larva aşamasından çıkmak neden olur ki, Dauer larva bakteriyel gıda olmadan odasına konuldu unutmayın. Şekil 1E zaten odasına birçok yumurta atmıştır yetişkin bir solucan göstermektedir. Yetişkin için kullanılan Kazan boyutları derin 700 x 700 mm, 45 mm idi. Son olarak, Şekil 1F yetişkin hermafrodit ve yetişkin bir bölme içinde bir erkek çiftleşme göstermektedir. Hareketli solucanlar Kalsiyum görüntüleme. GCaMP kalsiyum sensörleri ile mümkündür 2A, L1 larva 27 komut interneuron AVA B gösterisi kalsiyum görüntüleme Rakamlar. 2C sa kalsiyum faaliyet gösterecek D, RakamlarBir yetişkin hayvan nöron beni türü. Uzun vadeli görüntüleme ölçeklendirme tarayarak ve uzaklaştırma ile mümkündür. 3A, 5 megapiksel kamera ile tek kamera çip 30 solucanlar eşzamanlı görüntüleme görüntü kalitesini gösterir. Şekil 3B aynı anda görüntülü 4 solucanlar kalsiyum görüntü kalitesini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> C. tüm yaşam evrelerine AMI 1. Adaptasyon Şekil 190 x 190 mm ​​odalarına erken L2 aşamasına kadar erken L1 görüntülü elegans. (A) Larva. 370 x 370 mm odasında yetişkin kadar yumurtadan (B) geliştirilmesi. Bir solucanın (C) Hareketlilik çerçeve çıkarma kullanılarak değerlendirildi. Her larva sta için bir seçili patlama film için çerçeve çıkarma sonra görüntünün tüm resimlerin ortalama yoğunluğu Gösterildisonrasında ve lethargus davranış ge. 370 x 370 um odası içinde gıda olmadan (D) bir Dauer larva. 700 x 700 mikron odasına koydu birçok yumurta (E) Yetişkin hermafrodit. (F) bir erkeğin Çiftleşme ve 700 x 700 mikron odasının içine bir hermafrodit. YA genç yetişkin anlamına gelmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> AMI Şekil 2. Kalsiyum görüntüleme. AVA nmr-1 promotör kullanarak L1 larvaların komuta interneuron içinde GCaMP3 ile (A) Kalsiyum görüntüleme. İki yanlış renkli görüntüler gösterilir vardır. Sol resimde, AVA aktivitesi düşüktür ve solucan bir geriye hareketi yapmıyor. Sağ resimde AVA aktivitesidir<html> yüksek ve solucan geriye hareket ediyor. L1 solucanı için zamanla (B) Kalsiyum geçici. (C, D) yetişkin hayvan Kalsiyum transientler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Yakınlaştırıp uzaklaştırarak paralel Şekil 3. Görüntüleme birden solucanlar. (A) Eşzamanlı 190 x 190 mikron odaları kullanarak kare başına 30 L1 solucanlar görüntüleme ve 100X büyütme (10X objektif kullanılarak) ve 16,6 x 14 mm kamera çipi. (B) 370 x 370 mm odaları ve 100X büyütme ve 16,6 x 14 mm kamera çip ilgi bir bölge kullanarak çerçeve başına dört L3 solucanlar Simultane görüntüleme.et = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.4K Görüntüleme.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

Video: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Pozitif bütanon Öğrenme, Kısa vadeli ve uzun vadeli ilişkilendirilebilir Bellek Tahliller

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Nörobilim

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Antipsikotik İlaçların Etki Mekanizmaları incelenmesi için Yöntemleri<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Serbestçe Yüzme Zayıf Elektrik Balık Uzun vadeli Davranış Takip

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

bir<emCaenorhabditis elegans</emBeslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyi

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Sinirsiz Kuşak ve Uzun Süreli Bakım<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...