막스 플랑크 사회와 HB에 괴팅겐 대학원 주니어 그룹의 봉급은이 작업을 지원.

1. 악기, 문화 미디어 및 요리 <ol><li> 초점 샘플을 유지 할 수 있고 그가 자동 단계가 장착되어 현미경을 사용합니다. 주문 제작 뚜껑 히터를 구축하거나 상용 솔루션을 구입할 수 있습니다. 카메라의 노출은 제조업체의 지침을 사용하여 TTL 신호를 통해 LED 조명을 트리거하는 LED-EMCCD 카메라 시스템을 설정합니다. 참고 : 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 : <ol><li> 미세 유체 시설에서 PDMS 스탬프를 제작 또는 상업적 주조에 의해 생성 된 PDMS 스탬프를 가지고있다. 상업적 주조를 사용하려면 장치 (예를 들면 15 μm의) 깊이를 회사의 AutoCAD 파일을 전송하고 지정. 파운드리에서 제공 한 후, 메스를 사용하여 16 우표로 PDMS 칩을 잘라. </li><li> 공기 플라즈마를 이용하여 유리 슬라이드에 개별 스탬프 접합. 접착 용, PDMS 스탬프 및 공기 플라즈마에 유리 슬라이드를 모두 노출시합 1 분 (0.5 mbar에서 높은 플라즈마 설정을 사용하여). 접착을위한 표면이 플라즈마 처리시 위쪽으로 향하도록해야합니다. 그런 다음, 유리 슬라이드에 PDMS 스탬프를 놓습니다. </li></ol></li><li> 3.5 cm 바닥 접시를 타고 수직 밀링 머신과 날카로운 회전 커터를 사용하여 요리의 바닥의 중심에서 18 X 18mm의 사각형 영역을 잘라. 마찰에 의해 생성 된 열에 의해 녹아 플라스틱 않도록 커터 느린 공급의 낮은 회전 속도를 사용한다. 한 번에 여러 요리를 준비합니다. 참고 : 아래 접시 실험 후 여러 번 재사용 할 수는 순수한 에탄올 O / N에 몸을 담근 후 세척됩니다. </li><li> 아가로 오스 : <ol><li> 100ml에 3g 고 융점 아가 디졸브 S-기저 (5.85 g 염화나트륨 1 g을 K 2 HPO 4, 6 g을 KH 2 PO 4 에탄올 1 ml의 콜레스테롤 (5 ㎎ / ㎖), H 2 O 1 L은 비등에 의해) 고압 증기 멸균에 의해 소독. 2 mL의 에펜 도르프 튜브에 아가 로스 STOR 용해의 분취 만들기전자. 또한, 고 융점 아가 정확하게 같은 저 융점 아가로 오스의 배치를 준비한다. </li><li> 98 °의 C - (95)에서 아가 로스 사용 가열 블록 상에 고 융점의 분취 량을 3 배치에 앞서. 35 ° C -이 30 가열 블록에 다음 용융 될 때까지 98 ° C - (95)에서 아가 로스 가열 블록에 사용 저 융점 분취 한 배치에 앞서. </li></ol></li></ol> 동물의 2. 선택 <ol><li> 깨끗한 동물을 얻기 위해 시드 NGM 판에 낮은 밀도로 벌레를 성장. 음식과 단 몇 동물의 많음이 접시에가 있는지 확인합니다. </li><li> 영상 L1 유충를 들어, 신선한 시드의 NGM 접시에 프레첼 단계에서 배아를 포함 약 30 알을 전송합니다. 나중에 유생 또는 성인 C.를 전송 엘레는 신선한 시드 NGM 판에 30 벌레를 전송합니다. </li></ol> 아가로 오스 Microchambers 3. 준비 <ol><li> 요리의 준비 : <ol><li>하단에 18 X 18mm의 정사각형 구멍에 플라스틱 접시를 타고 거꾸로 위를 향 입구에 배치합니다. 오프닝에 20 × 20mm의 양면 접착 테이프의 조각을 배치하여 구멍을 닫습니다. 접착 테이프가 바닥에되도록 요리를 돌아서 및 하드 표면에 접시를 놓습니다. 무료 메스를 사용하여 구멍을 잘라. </li><li> P1000 피펫을 사용하여, 접시에 S-바살 3 % 고 융점 아가 로스 2 ㎖를 채운다. 개방을 둘러싸고있는 영역으로 아가로 오스를 놓고 공고히 할 수 있습니다. 아가로 오스는 고체 때까지 기다립니다. </li><li> 요리 돌아서 접착면이 접시에 남아 노출 될 수 있도록 양면 접착 테이프를 덮고있는 보호 필름을 벗겨. 주 : 결과적으로, 접착 테이프의 미세 링 개구의 외측을 둘러싸는 것. 아가 이후 샘플을 둘러싸는 수분 저류로서 기능한다. </li></ol></li><li> microchambers의 주조 : <ol><li> 일을 노출60 초 - 20 공기 플라즈마로 성형 전자 PDMS 표면. 주 :이 플라즈마 처리는 기포의 포착을 방지하여 선명한 인쇄를 생성하는 PDMS 친수성 ​​표면 렌더링한다. </li><li> 9 유리 슬라이드 - (5)를 적층함으로써 동일한 높이의 두 개의 스페이서를 구축합니다. 장소, 긴 변, 제 1 스페이서 스택 후 단일 유리 슬라이드, 다시 스페이서 스택 평행. 스페이서를 통해 직교 PDMS 스탬프가 들어있는 유리 슬라이드를 놓습니다. PDMS 스탬프의 성형면과 단일 유리 슬라이드 사이에 약 1.5 mm의 공간이되도록 스페이서의 높이를 조정한다. </li><li> PDMS가 액체 아가로 수직 슬라이딩 스탬프 신속 PDMS 스탬프 가까운 단일 유리 슬라이드 상에 뜨거운 액체 고 융점 아가로 오스의 드롭을 배치하고. 아가로 오스가 응고 보자. 그것은 일반적으로 약 2 분 소요 불투명 한 외관을 얻을 수 있는지 확인합니다. 하나의 이동과 수직으로 스탬프를 당깁니다. 참고 : GL 편리UE 스페이서는 양면 접착 테이프와 함께 슬라이드. 우표의 수직 운동은 아가로 오스에 갇혀 얻기에서 공기 방울을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 미세한 백금 와이어 픽업을 사용하여 아가로 오스에 OP50 박테리아와 함께 계란 나 웜을 전송합니다. 속눈썹을 사용하여 음식과 함께 한 계란 또는 챔버 당 하나의 벌레를 배포합니다. 하나 아가로 오스 패드에 약 30 알을 입력합니다. </li><li> 이 접시의 구멍에 잘 맞도록 약 15 X 15mm의 정사각형으로 채워진 microchambers을 포함하는 아가로 오스 슬래브를 잘라. 집게로 광장 아가 슬래브를 들고 20 × 20 ​​mm의 유리 커버 슬립에 뒤집어 놓습니다. 한 번 떨어졌다 다시 들어 올려 또는이 세균과 벌레가 자신의 방 밖으로 밀려 발생할 수 있기 때문에 주위를 밀어하지 않습니다. </li><li> 요리의 조립 : <ol><li> 플라스틱 접시의 개방에 유리 커버 슬립을 놓습니다. 부드럽게 양면 접착 테이프로 만든 반지에 유리 커버 슬립을 누르십시오.유리를 깰 않도록주의하십시오. </li><li> 거꾸로 접시를 뒤집어 30 ° C로 냉각 microchambers 함유 액체 한천 슬래브 저 융점 아가로 오스와 저장조 사이의 갭을 ​​채우기 위해 P1000 피펫을 사용한다. 아가로 오스가 응고 될 때까지 기다립니다. </li><li> 뚜껑 접시를 밀봉합니다. 거꾸로 현미경 가열 뚜껑을 사용합니다. 직립 현미경 정상 뚜껑을 사용하고 파라 필름으로 접시를 밀봉. </li></ol></li><li> microchambers의 준비를 마친 후, 실체 현미경 하에서 여부를 확인합니다. 올바른 충전은 매우 중요하다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오. </li></ol> 4. 칼슘 이미징 <ol><li> 이러한 HBR16 27 ([pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 : UNC-54-3&#39;UTR, UNC-119 (+)] goeIs5)와 같은 유전자 인코딩 된 칼슘 센서를 발현하는 형질 전환 균주를 사용합니다. </li><li> 넓은 필드 표면 형광를 갖추고 복합 현미경을 사용합니다. 에 EMCCD 카메라의 TTL 출력을 연결합니다카메라 샘플 조명 될 프레임을 기록 할 때마다하도록 LED의 TTL 입력. 약 5 밀리의 노출 시간을 사용합니다. 50-300의 범위에서 EM 게인을 사용합니다. </li><li> 매 15 이미지화되는 각 웜에 24 시간 동안 버스트 영화 실행을 지정 - 먼저 30 분 (DIC) 20 초, GCaMP를 기록하고 mKate2 신호의 최종 이미지를 취할 GFP의 형광 20 초에 촬영 발현 수준의 제어. 각 버스트 동안 2 / 초의 프레임 속도를 사용한다. </li><li> 비주얼 데이터 검사 용, 형광 강도의 작은 변화의 시인성을 향상시키기 위해 거짓 컬러 맵을 사용한다. F는 형광의 평균 기본 가치와 ΔF / F와 같은 플롯 형광 데이터,. 칼슘 데이터 분석의 상세한 설명은 문헌 (20)에서 찾을 수있다. </li></ol> 여러 웜 5. 병렬 AMI <ol><li> 현미경에 microchambers을 포함하는 접시를 놓고 샘플에 집중하고 autofo 참여기분이야. 카메라 웜 당 1,920 프레임 데이터의 적절한 양을 초래할 것이다 : 24 시간, 20 초에서 30 분마다 시간을 40 이미지 프레임의 버스트를 획득하도록 소프트웨어 프로토콜을 설정한다. 이 단계를 사용하여 각 벌레를 방문 할 수 있도록 검색을 설정합니다. 하나 실행에 약 30 벌레를 촬영하는 것을 목표로하고 있습니다. </li><li> 낮은 배율을 사용하여, 즉, 축소하여 이미지 여러 웜. 카메라 칩으로 여러 microchambers을 커버하고 동시에 여러 인접 microchambers을 필름에 낮은 배율을 사용합니다. 화상 취득의 종료 후, 동물을 다루는 하나의 관심 영역을 잘라내어 개별 챔버에 대한 데이터를 분리한다. </li><li> 빠르게 이동 데이터를 평가하기 위해, 프레임 빼기 28-32을 사용합니다. </li></ol> C의 6 이미징 다른 생활 단계 엘레 <ol><li> C의 모든 삶의 단계에 대한 아가로 오스 microchambers를 사용하여 엘레 (L1)에서 성인을 포함 dauers에. DIF에 해당하는 실 치수를 사용하여표 1에 나타낸다 ferent 수명 단계. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 생활의 단계 </td><td> 챔버 크기 </td><td> 챔버 깊이 </td><td> 일반 녹화 시간 </td><td> 확대 </td></tr><tr><td> (L1) </td><td> 190 X 190 μm의 </td><td> 10-15 μm의 </td><td> 달걀 - 중간 (L2) </td><td> 400X </td></tr><tr><td> (L2) </td><td> 370 X 370 μm의 </td><td> 15 μm의 </td><td> 달걀 - (L3) </td><td> 200X </td></tr><tr><td> 영속 유충 </td><td> 370 X 370 μm의 </td><td> 25 μm의 </td><td> 사일 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> (L3) </td><td> 700 X 700 μm의 </td><td> 45 μm의 </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> (L4) </td><td> 700 X 700 μm의 </td><td> 45 μm의 </td><td> 젊은 L4 - 젊은 성인 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> 젊은 성인 </td><td> 700 X 700 μm의 </td><td> 45 μm의 </td&gt; <td> 12-24 시간 </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> 서로 다른 삶의 단계 표 1. 회의소 크기. 표시됨은 8 × 8mm 카메라 칩에 최적화 된 다양한 단계에 유용 챔버 크기와 배율.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2012).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10, 877-879 (2013).</li><li>Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+tracking+and+behavioral+measurement.">C. elegans tracking and behavioral measurement.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).</li><li>Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+movement+behavior+of+multiple+worms+on+food.">Tracking movement behavior of multiple worms on food.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in.">High-throughput behavioral analysis in.</a> C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3, e2208 (2008).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).</li><li>Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+hydrogel+microcompartments+for+imaging+sleep-+and+wake-like+behavior+and+nervous+system+development+in+Caenorhabditis+elegans+larvae.">Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).</li><li>Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-microfluidic+methods+for+imaging+live.">Non-microfluidic methods for imaging live.</a> C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , 1-19 (2013).</li><li>Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+microfluidic+system+for+individual+Caenorhabditis+elegans+assay.">Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay.</a> Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).</li><li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies.">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of.</a> C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+mechanosensory+neurons+demonstrates+a+specific+role+for+the+MEC-4+channel+in+the+process+of+gentle+touch+sensation.">In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation.</a> Neuron. 39, 1005-1017 (2003).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage-gated+calcium+channel+subunit+genes+on+calcium+influx+in+cultured+C.+elegans+mechanosensory+neurons.">Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons.</a> Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).</li><li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , 1-13 (2006).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, e198 (2008).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li><li>Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP2+transcription+factor+is+required+for+a+sleep-active+neuron+to+induce+sleep-like+quiescence+in.">An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in.</a> C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Notch+Signaling+Regulates+Adult+Chemosensory+Response+and+Larval+Molting+Quiescence.">C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence.</a> Current Biology. 21, 825-834 (2011).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451, 569-572 (2008).</li><li>Iwanir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+C.+elegans+behavior+during+lethargus:+homeostatic+bout+dynamics,+a+typical+body+posture,+and+regulation+by+a+central+neuron.">The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron.</a> Sleep. 36, 385-395 (2013).</li><li>Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+behavioral+quiescence+in+Caenorhabditis+elegans.">Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. , (2014).</li><li>Nagy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+Caenorhabditis+elegans+larvae+reveals+a+novel+locomotion+switch,+regulated+by+Galphas+signaling.">A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling.</a> eLife. 2, e00782 (2013).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).</li><li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

하드웨어 현미경의 초점은 전형적으로 장기간의 화상 획득 동안에 드리프트 할 것이다. 복합 현미경, 초점을 지키는 시스템하는 주요 현미경 제조 업체에서 구입하실 수 있습니다. 포커스 제어와 화합물 현미경 너무 비싼 인 경우에, 간단한 대안은 실체 현미경을 사용하는 것이다. 화합물 현미경은 높은 개구 수 (NA)가 목표의 사용을 허용하고 용이하게 자동화 될 수있다. 40X 오일 목표는 적합하다. 침수 렌즈 때문에 장기 이미징 동안 증발의 이상적인 수 없습니다. 미분 간섭 대비 (DIC)는 형태 학적 및 행동 변화를 수행하는 데 도움이 좋은 대비를 생성하지만 간단한 시야 촬상 또한 사용될 수있다. DIC 또는 시야 이미징, 현미경의 직경 - 조명 경로로 붉은 빛이 필터를 배치하여 붉은 빛을 사용합니다. 여러 microchambers 스캐닝하기위한 자동화 단계가 필요하다. 최고의 성능을 교류입니다스테이지 비선형 가속과 감속을 가지며, 주사시 동물을 방해하지 않도록 낮은 주사 속도로 설정 될 수 사용될 때 hieved. 우리는 웜의 mechanosensitive 시스템을 활성화하지 않습니다 실제로 그 느린 스캔을 제안 행동 반응 또는 스캔하는 동안 mechanosensitive 뉴런 (ALM 및 PLM)에서의 칼슘 증가를 관찰하지 않은 (데이터가 표시되지 않음). 상용 LED 시스템을 사용할 수있다. 몇몇 회사는 서로 다른 파장의 LED를 포함 즉시 사용 가능한 솔루션을 제공합니다. LED 외부 TTL 신호와 LED 트리거링 옵션을 가져야한다. 고감도 카메라 동물 이동 칼슘 이미징 필요하다. EMCCD 카메라는 시장에서 가장 민감한 카메라이다. 카메라는 노출시 TTL 출력 (또한 &quot;화재&quot;출력)를 가질 필요가있다. 뚜껑 히터 거꾸로 현미경을 사용하는 경우에는 뚜껑에 응축을 방지 할 필요가있다. 직립 현미경에서 접시가 배치 될 수 있도록 뚜껑 WI하단에하고 것이다 따라서 결로를 방지하고 더 뚜껑 가열이 필요하지 않습니다. 뚜껑 장기 촬상 중에 물의 증발을 방지하기 위해 접시를 닫고 단단히한다. PDMS 스탬프 아가 로스를 성형하기위한 구조를 포함 PDMS 스탬프의 표면 거리 PDMS 스탬프를 지원 유리 슬라이드에서 직면된다. 사용자 정의 마이크로 유체 칩을 제공하는 회사와 목록은 위키 백과에 (찾을 수 있습니다 <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> )을. 자신의 방에 선충을 작성 이것은 프로토콜의 가장 중요한 단계이며, 다음 사항이 고려되어야한다 : A), 아가 로스의 보습이 벌레를 전송 및 이미징에 매우 중요하다. 아가로 오스, 즉, 너무 습하면, 액체 COV가여러 microchambers의 면적 거릴, 그것은 액체 박테리아 멀리 흐르게하므로 제어 된 방식으로 박테리아와 웜 식품을 분배하는 것이 가능하지 않을 것이다. 아가로 오스가 너무 건조하면 다음과 세균과 벌레가 증가 힘이 쉽게 아가로 오스의 손상을 일으키는 벌레와 박테리아를 삭제하는 데 사용 될 필요가 있음을 의미 쉽게 선택을하지 못할 수도 있습니다. 웜을 많이 채울 때 아가로 오스는 건조 할 수있다. 최악의 경우 아가로 오스는 챔버가 붕괴 될 그래서 결국 건조 될 것이다. 아가로 오스가 너무 건조한 경우에는 웜이없는 칩의 측면 상에 작은 방울 S-기저 (약 2 μL)를 배치하여 재수 화 될 수있다. 그런 다음 액체로 선택 백금 와이어를 찍어 심지어 챔버가 벌레로 가득 영역에 액체의 일부를 빼냅니다. B) 음식의 양을 성공적으로 장기 촬상 중요하다. 충분한 음식이없는 경우, 웜은 부족할 수있다. 과도한 음식은 챔버의 캐비티가 있다면액체처럼 오히려 고체처럼 행동하지 않으며 벌레가 박테리아를 밀어 챔버에서 탈출 할 수 있습니다. 전체 챔버를 채우는 세균 현탁액을 획득하는 것을 목표로하고 있습니다. 벌레는 실험 기간 동안 그들의 길이의 대부분을 따라 한천과 유리 표면에 일정한 물리적으로 접촉하고 크롤링 동작은 액체에서 탈곡하는 접시에 운동과 유사과 유사하지 않은 것으로 보인다. 실험을 망칠 수 아가로 오스의 손상 C) 기계. 좋은 선택이 필수적이다. 그것은 날카로운 모서리가 없어야합니다. 피펫 팁에 부착 소프트 속눈썹은 백금 픽업을 사용하는 대신 챔버 내로 박테리아 나 웜을 이동하는데 사용될 수있다. 그러나 대부분의 경우, overdried 아가 손상에 대한 이유이다. 픽업 또는 속눈썹이 이상적 간신히 웜 및 박테리아 해내한다 아가로 오스 상에 자체 및 수막을 터치한다. 챔버를 밀봉 할 때, 다시, 아가 로스의 수분이 필수적이다. 이하지 말아야이 밀봉 동안 세균과 벌레를 씻어 수 있기 때문에 아가로 오스 표면에 어떤 무료 액체를합니다. 큰 기포가 부드럽게 한천 슬래브의 모서리를 해제함으로써 제거 될 수있다. 자주 챔버 안에 갇혀받을 실보다 작은 작은 거품. 이러한 거품은 문제가되지 않습니다 및 흡수에 의해 사라집니다. 접시를 조립 한 후, 아가로 오스가 너무 건조하거나 젖은 것을 다시 확인합니다. 챔버는 잘 밀봉해야하며, 챔버 사이에 액체의 흐름이 안됩니다. 아가 너무 젖은 경우 챔버가 제대로 밀봉되지. 웜 탈출하거나 그들의 음식은 멀리 세척한다. 샘플이 너무 습하면, 간단한 뚜껑을 열고 2 분의 아가로 오스 건조를 할 수 있습니다. 아가로 오스가 너무 건조하면 챔버는 붕괴 할 수 있으며, 웜 탈출합니다. 축소에 의해 확장 형광 이미징의 경우, 축소하는 낮은 배율에서 얻어진 빛의 적은 양에 의해 제한된다. 또한, 전자MCCD 카메라는 감도에 최적화 종종 상대적으로 낮은 해상도를 가지고있다. 그러나 영상 4 배 규모를 확대하는 것은 물론 가능하다. 140X (20X 목적 및 0.7X 카메라 마운트를 사용하여 달성) 배율 및 512 X 512 화소, 8 × 8 mm 카메라를 사용할 때 예를 들어, 190 μm의 X 190 μm의 네 챔버는 하나의 프레임에 맞게 할 수있다. (예 : sCMOS 카메라, 16.6 mm X 14mm 칩, 2560 X 2560 픽셀 = 5.5 메가 픽셀)을 큰 칩과 고해상도 카메라는 DIC와 밝은 필드 이미징의 최대 확장 최적화합니다. 100X 배율을 사용하는 경우 예를 들어, 190 μm의 30 L1 벌레까지 X 190 μm의 챔버 (도 3 참조)이 카메라의 각 프레임에 맞게 할 수있다. 원칙적으로, 줌 아웃 및 주사는 동물의 더 큰 수를 획득하기 위해 결합 될 수있다. 하나의 초점 평면 이미지를 만들 필요가 있도록 대부분의 뉴런은 초점이 꽤 잘있어. 뉴런 피에조 드라이브를 사용하여 검사를 AZ, 초점이 이동하는 경우에 발견되는 각각의 시간 (P)에 취해질 수OINT. 다른 동작에 적응 이 프로토콜은 긴 시간 규모에서 행동의 좋은 아이디어를 제공합니다. 물론, 버스트의 타이밍은 다른 동작과 생활 단계에 적응 될 필요가있다. 기술의 한계 여러 가지 요인이 영상의 지속 시간을 제한 할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 음식의 양이다. 음식이 소비되면, 유충 개발 중지합니다. 따라서, 작은 실에서 (190 X 190 μm의) 웜은 L3 단계까지 개발 한 후 체포. 이상 촬상 시간이 필요하다면, 더 큰 챔버가 사용될 수있다. 3 일 - 장기 영상의 최대 길이는 2.5의 범위이다. 이상 촬상이 필요한 경우, 웜을 회수하고 새로운 챔버에 배치 될 필요가있다. 성인 벌레를 이미징 할 때, 다른 제한은 이러한 웜의 자손에 의해 발생합니다. 성인 벌레는 유충 부화에서 알을 낳는다. 이 유충은 챔버 내부에 남아있을 것입니다식품을 소비하고, 이미지 분석을 방해 할 수있다. 자손이 문제가 될 경우에는, 멸균 성인 용액을 사용하거나 또는 신선한 챔버로 벌레를 반복적으로 배치하는 것이다. 벌레를 복구하기 위해, 챔버를 포함하는 아가로 슬래브 메스 자유로운 절단은, 커버 슬립을 뽑아되며 웜을 회수 할 수있는 NGM 플레이트 상에 배치된다. 또 다른 한계는 상대적으로 작은 지역에 벌레의 제한 사항입니다. 장거리 이동 분석되어야 할 경우 문제가 될 수있다. 챔버에 동물을 기계적 optogenetically 21,27,34,35 자극 될 수 있으나, 챔버의 밀봉 특성 어려운 가용성 또는 휘발성 자극을 적용 할 것이다. 산소 또는 이산화탄소와 같은 생물학적으로 중요한 가스 한천에서 자유롭게 확산 할 수있다. 접시에 큰 공기 탱크는 실험에 필요한 시간에 걸쳐 일정 챔버의 가스 농도를 유지해야합니다. 그러나, 마음 로컬 산소 concentratio에 보관해야N 실에서 더 많은 접시에 문화보다 액체 문화에서 발견되는 조건과 유사 할 수 있습니다. 기존의 방법에 대한 의미 미세 유체 장치는 크게 C에서 공부 행동 및 발달 고급 엘레. 종종, 미세 유체 구조는 PDMS (12)로 만들어진다. 여기서 우리는 아가로 만든 미세 배양 챔버를 생성하는 프로토콜을 기술한다. 이 기술의 장점은 높은 품질 영상화, 생리적 측정 장기 이미징 및 합리적으로 높은 처리량과 행동의 상관의 조합이다. 고화질 높은 NA를 사용하여 목표 유리 커버 슬립으로 촬상함으로써 달성된다. 그 결과, 칼슘 이미징 및 세포 내 구조물의 촛점 이미징 형광 촬상을 행할 수있다. 동물이 다른 시스템들에서와 같이 고정되지 않기 때문에, 그 생리 학적 측정과 행동의 상관을 허용한다. 벡ause 동물이 충분한 음식을 가지고, 이들은 장기간 촬상있게 계속 개발. 이 시스템은 동물 정의 된 챔버에 하나 실행에 이미지 많은 벌레 제한 할 수 있기 때문이다. 따라서,이 방법은 쉽게 9,27,34-36을 확장 할 수 있습니다. 미래의 응용 프로그램 지금까지,이 시스템은 C. 수면 행동을 연구하기 위해 주로 사용되어왔다 엘레 L1 유충. 그러나, 모든 단계에 대한 적응이 가능 또한 dauers 및 성인에서 행동의 넓은 범위를 공부하게됩니다. 행동의 광범위한는 짝짓기에서 달걀 누워에 이르기까지이 방법으로 공부하실 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table><tbody><tr><td>High melting point agarose</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP(E)164-1000</td><td></td></tr><tr><td>Top Vision low melting point agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>LED system</td><td>CoolLED</td><td>pE-2</td><td></td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>now sold as iXon Ultra 897</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick</td><td>PDC-23G2</td><td></td></tr><tr><td>Lid heater</td><td>MPI workshop</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Falcon</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Z-stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Nano Scan Z</td><td></td></tr><tr><td>X-Y stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Proscan III</td><td></td></tr><tr><td>PDMS stamp</td><td>Abbott Laboratories</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Red light filter</td><td>Chroma</td><td>ET660/50m</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>Falcon</td><td>Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td><td></td></tr><tr><td>Double sided sticky tape</td><td>Sellotape/Henkel</td><td>double sided 25 mm x 33 m</td><td>alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td></tr></tbody></table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

동작은 신경계에 의해 조절된다. 칼슘 이미징 Caenorhabditis 엘레 다양한 동작 중에 뉴런의 활성을 측정하기 위해 투명 간스 선충에 간단한 방법이다. 행동 신경 활동의 상관 관계, 동물 고정화되지 않아야하지만 이동할 수 있어야한다. 많은 행동 변화는 긴 시간 규모 동안 발생과 행동의 많은 시간 동안 기록이 필요합니다. 이것은 또한 배양하는 데 필요한 식품의 존재에 웜을 만든다. 어떻게 웜 배양과 신경 활동은 긴 시간 규모에 걸쳐 영상화 할 수 있습니까? 아가로 오스 Microchamber 이미지 (AMI)는 이전에 문화를 개발하고 작은 유충을 관찰하고 지금 C의 성인 무대까지 초기 (L1)의 모든 삶의 단계를 연구하도록되어 있었다 엘레. AMI는 C의 다양한 삶의 단계에서 수행 할 수 있습니다 엘레. 장기 칼슘 이미징 COM 짧은 노출 외부 트리거를 사용하여 동물을 고정하지 않고 달성된다전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라 녹화 전자 증배 bined. 축소 또는 스캔은 병렬로 40 벌레까지 이미지에이 방법을 확장 할 수 있습니다. 따라서, 방법은 C의 모든 삶의 단계에 긴 시간 규모에 걸쳐 이미지의 행동과 신경 활동에 설명 엘레.

아가로 오스는 microchambers C. 임의 생활 단계에 적용될 수있다 엘레. 도 1a에서 알 수있는 바와 같이, L1에 lethargus 동안 유생 수면 행동이 관찰 될 수있다. 깊은 190 X 190 μm의, 10 μm의 아르 챔버 크기는있는 바와 같다. 장시간 스케일이 필요한 경우,보다 큰 챔버가 사용될 수있다. 더 큰 크기 (370 X 370 ㎛ 인, 25 ㎛의 깊이)와 챔버를 사용하여,도 1b에서 알 수있는 바와 같이, C.의 개발을 허용 엘레 계란에서 성인까지. 그림 1C 성인까지 알에서 챔버에서 자란 벌레의 프레임 빼기를 사용하여 동작의 장기적인 변화의 분석을 보여줍니다. 웨이크 및 lethargus 중 선택 버스트 프레임 공제 후 평균 강도가 표시됩니다. 웜의 이동성 낮은 프레임 빼기 값 이후의 평균 강도가 낮을​​. 표시 한 웨이크 상태와 애벌레 단계 당 하나의 lethargus 조건에서 버스트 흔적을 선택한다.개발하는 동안 평균 강도의 관찰 증가는 동물의 증가 대비 및 크기에 주로 기인한다. 그림 1D는 영속 유충, 불리한 환경 조건 33시에 종사하는 다른 삶의 단계를 보여줍니다. 챔버 크기는 370 X 370 μm의, 15 μm의 깊이. 영속 유충 단계에서 종료를 야기하는, 영속 유충이 박테리아 음식없이 챔버에 넣고 있습니다. 그림 1E는 이미 챔버로 많은 계란을 누워있다 성인 벌레를 보여줍니다. 성인에 사용되는 챔버 크기는 깊이 700 X 700 μm의, 45 μm의했다. 마지막으로, 그림 1 층은 성인 자웅 동체 및 성인 챔버 내부의 남성 짝짓기를 보여줍니다. 운동성이 웜에 칼슘 이미징. GCaMP 칼슘 센서 가능합니다 2A, L1 유충 (27)에 대한 명령 interneuron AVA의 B 쇼 칼슘 이미징 피규어. 2c는 SA를위한 칼슘 활성을 나타내는 D,도성인 동물에서 신경 세포의 날 유형. 장기 영상을 스케일링 주사함으로써 확대 및 축소가 가능하다.도 3a는 5 메가 픽셀 카메라로 하나의 카메라 칩 (30)의 웜 동시 촬상의 화질을 도시한다.도 3b는 동시에 묘화 4 웜 칼슘의 이미지 품질을 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> C의 모든 삶의 단계에 AMI 1. 적응 그림 190 X 190 μm의 챔버에서 초기의 L2 단계까지 이른 (L1)에서 몇 군데 간스. (A) 유충. 370 X 370 μm의 챔버에서 성인까지 달걀에서 (B)를 개발. 웜의 (C) 이동성 프레임 빼기를 사용하여 평가 하였다. 각 유생 역에 대해 하나의 선택 버스트 영화 프레임 공제 후 이미지의 모든 사진의 평균 강도는 표시합니다웨이크 및 lethargus 행동 GE. 370 X 370 μm의 챔버에서 음식의 부재 (D)의 영속 유충. 700 X 700 μm의 챔버에 배치 많은 계란 (E) 성인 자웅 동체. (F) 남성의 결합 및 700 X 700 μm의 챔버 내부의 자웅 동체. 나중에 젊은 성인을 의미한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> AMI 그림 2. 칼슘 이미징. AVA NMR-1 프로모터를 사용하여 L1 유충의 명령 interneuron에 GCaMP3와 () 칼슘 이미징. 두 거짓 컬러 이미지를 나타낸다. 왼쪽 이미지에서 AVA의 활성이 낮고, 웜은 역방향 운동을하지 않는다. 오른쪽 그림에서 아바의 활동이다<html> 높은 및 웜은 뒤로 이동합니다. (L1) 웜 시간 이상 (B) 칼슘 과도. (C, D) 성인 동물의 칼슘 과도를. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> 축소에 의해 병렬로 그림 3. 이미징 여러 웜. (A) 동시 190 X 190 μm의 챔버를 사용하여 프레임 당 30의 L1 웜의 이미징 및 100X 배율 (10 배 목표를 사용) 및 16.6 X 14mm 카메라 칩. (B) 370 X 370 μm의 챔버 및 100X 배율과 16.6 X 14mm 카메라 칩의 관심 영역을 사용하여 프레임 당 사 (L3) 웜의 동시 영상.등 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.5K 조회수.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

연구

생화학

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

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The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

신경과학

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

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Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

행동분석학

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

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In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

생체공학

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

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Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

발생학

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

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It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Calcium Imaging: A Method to Visualize Neural Activity in Live C. elegans

Source: Turek, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52742/agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis">Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video introduces the concepts behind calcium imaging and includes an example protocol for time-lapse imaging of worms contained in molded agarose wells.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

Source: Turek, M. et al. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video ...

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers

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