Name: agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2015-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Die Max-Planck-Gesellschaft und eine Göttinger Graduiertenschule Junior Gruppe Stipendium für HB finanziert diese Arbeit.

1. Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Verwenden Sie ein Mikroskop, das in der Lage, halten die Probe im Mittelpunkt steht und der mit einem automatischen Bühne ausgestattet. Erstellen Sie eine maßgeschneiderte Deckelheizung oder Kommerzielle Lösung. Einrichtung eines LED-EMCCD-Kamera-System, in dem die Belichtung der Kamera löst durch ein TTL-Signal LED-Beleuchtung mit den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Lesen Sie Diskussionen für Details. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) Briefmarken: <ol><li> Herstellung PDMS-Stempel in einem Mikrofluidik-Anlage oder die von einem kommerziellen Gießerei produziert PDMS-Stempel. Um Kommerzielle Gießerei nutzen, senden Sie eine AutoCAD-Datei an das Unternehmen und geben Sie die Tiefe (15 &amp; mgr; m, zum Beispiel) des Gerätes. Nach der Lieferung aus der Gießerei, schneiden Sie die PDMS-Chips in ihre 16 Marken mit einem Skalpell. </li><li> Binden jeden einzelnen Stempel auf einem Glasobjektträger mit Luftplasma. Zum Kleben, aussetzen sowohl die PDMS-Stempel und die Objektträger an der Luft-Plasma für einRunde 1 min (mit den höchsten Plasma Einstellungen bei 0,5 mbar). Stellen Sie sicher, dass die Oberflächen für die Verklebung nach oben zeigen während der Plasmabehandlung. Dann legen Sie die PDMS-Stempel auf den Objektträger. </li></ol></li><li> Werfen Sie einen 3,5 cm Bodenschale und schneiden Sie eine quadratische Fläche von 18 x 18 mm von der Mitte der Boden der Schale mit einem Vertikal-Fräsmaschine und scharfe Schneidrollen. Verwenden niedrige Drehgeschwindigkeit des Schneiders und langsamen Vorschub um den Kunststoff vor dem Schmelzen aufgrund der Wärme durch Reibung erzeugt verhindern. Bereiten Sie verschiedene Gerichte auf einmal. Hinweis: Die Bodenschale kann viele Male nach dem Experiment wiederverwendet werden, wenn sie nach dem Einweichen in reinem Ethanol O / N wird gereinigt. </li><li> Agarose: <ol><li> Man löst 3 g hochschmelzender Agarose in 100 ml S-Basal (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml Cholesterin (5 mg / ml in Ethanol), H 2 O auf 1 L, durch Autoklavieren sterilisieren) durch Kochen. Machen Sie Teilmengen der gelösten Agarose in 2 ml Eppendorf-Röhrchen und store. Auch bereiten eine Charge von niedrig schmelzender Agarose genau der gleichen Weise wie die hochschmelzender Agarose. </li><li> Vor der Verwendung legen 3 Teilmengen von hochschmelzenden Agarose auf einen Heizblock bei 95 bis 98 ° C. Vor der Verwendung legen Sie eine aliquote Menge von niedrig schmelzender Agarose auf einem Heizblock bei 95 - 35 ° C - 98 ° C, bis es bei 30 auf einen Thermoblock geschmolzen und dann. </li></ol></li></ol> 2. Auswahl der Tiere <ol><li> Würmer wachsen auf einem niedrigen Dichte auf NGM-Platten ausgesät, um saubere Tiere zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass es reichlich zu essen und nur wenige Tiere auf dem Teller. </li><li> Für die Bildgebung L1-Larven, Transfer ca. 30 Eier enthält Embryonen im Stadium Brezel auf eine frische ausgesät NGM Platte. Für die Übertragung von späteren Larvenstadien oder Erwachsener C. elegans, Transfer ca. 30 Würmern auf eine frische ausgesät NGM Platte. </li></ol> 3. Herstellung von Agarose Mikrokammern <ol><li> Vorbereitung der Schale: <ol><li>Nehmen Sie eine Plastikschale mit einer quadratischen Öffnung von 18 x 18 mm am Boden und legen Sie sie auf den Kopf mit der Öffnung nach oben. Schließen Sie die Öffnung, indem Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband von 20 x 20 mm auf die Öffnung. Drehen Sie den Teller um, so dass das Klebeband auf der Unterseite und die Schale auf eine harte Oberfläche. Schneiden Sie die Öffnung frei mit einem Skalpell. </li><li> Unter Verwendung einer Pipette P1000, füllen 2 ml 3% hochschmelzender Agarose in S-Basal in die Schüssel. Legen Sie die Agarose auf den Bereich, der die Öffnung umgibt, und lassen Sie festigen. Warten Sie, bis die Agarose fest. </li><li> Drehen Sie sich um die Schüssel und ziehen Sie die Schutzfolie, die die doppelseitige Klebeband umfasst, so dass die Klebeseite wird auf dem Teller bleiben und ausgesetzt werden. Hinweis: Dadurch wird ein feiner Ring aus Klebeband der Außenseite der Öffnung zu umgeben. Die Agarose dient als Feuchtigkeitsspeicher, der später zu umgeben die Probe. </li></ol></li><li> Casting von Mikrokammern: <ol><li> Expose the PDMS Oberfläche zum Formen mit Luft-Plasma für 20-60 sec. Hinweis: Diese Plasmabehandlung macht die PDMS Oberfläche hydrophil, was das Einfangen von Luftblasen verhindert und schärfere Ausdrucke. </li><li> Konstruieren Sie zwei Abstandshalter von gleicher Höhe durch Stapeln 5-9 Objektträger aus Glas. Findet, die parallel zu ihren Längsseiten, die erste Abstandsstapel hat, kann eine Glasplatte, dann wieder einen Spacer Stack. Setzen Sie den Glasobjektträger, die die PDMS-Stempel orthogonal über den Abstandshaltern enthält. Einstellen der Höhe der Abstandshalter, so dass es einen Abstand von ungefähr 1,5 mm zwischen der Formoberfläche der PDMS-Stempel und dem einzigen Glasträger. </li><li> Geben Sie einen Tropfen heißen Flüssigkeit mit hohem Schmelzpunkt Agarose auf die einzelnen Objektträger in der Nähe der PDMS-Stempel und schnell schieben Sie die PDMS-Stempel vertikal in die Flüssigkeit Agarose. Lassen Sie die Agarose fest werden. Überprüfen Sie, ob es ein opakes Aussehen, die in der Regel dauert ca. 2 min bekommt. Ziehen Sie den Stempel vertikal mit einem Zug. Hinweis: Es ist bequem, glue der Abstandshalter gleitet zusammen mit doppelseitigen Klebeband. Die Vertikalbewegung des Stempels verhindert Luftblasen am Anfang in der Agarose gefangen. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Eier oder Würmer zusammen mit OP50 Bakterien auf der Agarose mit einem feinen Platindraht Pick. Verteilen Sie ein Ei oder ein Wurm pro Kammer zusammen mit Lebensmitteln mit der Wimper. Füllen Sie etwa 30 Eier auf einem Agarose-Pad. </li><li> Schneiden Sie die Agarose-Platte, die die gefüllten Mikrokammern in ein Quadrat von etwa 15 x 15 mm, so dass es schön in die Öffnung der Schale passt. Nehmen Sie den Platz Agarose-Platte mit einer Pinzette und legen Sie sie auf den Kopf auf einem Deckglas von 20 x 20 mm. Einmal fiel, nicht heben Sie sie wieder oder schieben Sie es um, da dies kann dazu führen, die Bakterien und Würmer aus ihren Kammern geschoben werden. </li><li> Montage der Schale: <ol><li> Legen Sie das Deckglas auf die Öffnung des Kunststoffschale. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas auf den Ring von doppelseitigen Klebeband hergestellt.Achten Sie darauf, das Glas zu brechen. </li><li> Drehen Sie die Schüssel auf den Kopf und verwenden Sie eine P1000 Pipette, die Lücke zwischen dem Agar Platte mit den Mikrokammern und der Agarose Reservoir mit Flüssigkeit mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose auf etwa 30 ° C gekühlt zu füllen. Warten Sie, bis die Agarose erstarrt ist. </li><li> Verschließen Sie die Schüssel mit Deckel. Für inverse Mikroskope mit einem beheizten Deckel. Für aufrechte Mikroskope mit einem normalen Deckel und verschließen Sie die Schale mit Parafilm. </li></ol></li><li> Nach Beendigung der Herstellung von Mikrokammern, überprüfen Sie sie unter einem Stereomikroskop. Die richtige Füllung ist von entscheidender Bedeutung. Siehe die Diskussion für Details. </li></ol> 4. Calcium Imaging <ol><li> Verwenden transgenen Stämmen, genetisch kodierte Calciumsensoren wie HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)]) 27. </li><li> Verwenden Sie einen zusammengesetzten Mikroskop für Weitfeld-Epifluoreszenz ausgestattet. Schließen Sie die TTL Ausgang des EMCCD KameraDie TTL-Eingang des LED, so dass jedes Mal, wenn die Kamera ein Rahmen die Probe beleuchtet wird. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von etwa 5 ms. Verwenden Sie EM Gewinn im Bereich von 50 bis 300. </li><li> Geben Sie eine Burst-Film läuft 24 Stunden lang mit jeder Wurm ist alle 15 abgebildet - 30 min ersten 20 Sekunden mit DIC, dann für 20 Sekunden mit einem GFP-Fluoreszenz zu erfassen GCaMP, und dann eine endgültige Bild des mKate2 Signal wird aufgenommen Steuerung für Expressionsniveaus. Verwenden Sie eine Bildrate von 2 / sec bei jedem Burst. </li><li> Für die visuelle Datenprüfung, verwenden Sie ein Falschfarbenkarte, die Sichtbarkeit von kleinen Änderungen der Fluoreszenzintensität zu erhöhen. Plot Fluoreszenzdaten &amp; Delta; F / F, wobei F die durchschnittliche Ausgangswert der Fluoreszenz. Eine detaillierte Beschreibung der Calciumdatenanalyse sind in der Literatur 20 gefunden werden. </li></ol> 5. Parallel AMI von Multiple Worms <ol><li> Die Schale mit den Mikrokammern auf das Mikroskop, den Schwerpunkt auf die Probe und die Fest autofocus. Einrichten eines Software-Protokoll, so dass die Kamera nimmt einen Ausbruch von 40 Bildrahmen in 20 sec jede halbe Stunde für 24 Stunden, die in 1.920 Bildern pro Wurm, eine angemessene Menge von Daten führt. Einrichten der Scan, so dass es besucht jeden Wurm mit der Bühne. Ziel ist es, etwa 30 Würmer Film in einem Durchlauf. </li><li> Bild mehrere Würmer durch Verkleinern, dh mit einer niedrigeren Vergrößerung. Verwenden Sie eine niedrigere Vergrößerung auf mehrere Mikrokammern mit dem Kamerachip zu decken und zu filmen mehrere benachbarte Mikrokammern gleichzeitig. Nach dem Ende der Bildaufnahme, trennen die Daten für jede einzelne Kammer, die durch Zuschneiden eines Bereichs von Interesse abdeckt einem Tier. </li><li> Um die Mobilität Daten schnell zu beurteilen, verwenden Rahmen Subtraktion 28-32. </li></ol> 6. Imaging verschiedenen Lebensphasen von C. elegans <ol><li> Verwenden Agarose Mikrokammern für alle Lebensphasen von C. elegans von L1 zu Erwachsenen und einschließlich dauers. Verwenden Sie die entsprechenden Kammer Abmessungen für difschiedlichen Lebensphasen, die in Tabelle 1 gezeigt werden. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Lebensstadium </td><td> Kammergröße </td><td> Kammertiefe </td><td> Normaler Aufnahme </td><td> Vergrößerung </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 um </td><td> 10-15 &amp; mgr; m </td><td> Ei - Mitte L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 &amp; mgr; m </td><td> 15 &amp; mgr; </td><td> Ei - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer-Larve </td><td> 370 x 370 &amp; mgr; m </td><td> 25 um </td><td> 4 Tage </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td><td> junge L4 - junge Erwachsene </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Junge Erwachsene </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td&gt; <td> 12-24 h </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Chamber Größen für unterschiedliche Lebensphasen. Es zeigen Kammerabmessungen und Vergrößerungen, die für verschiedene Stufen für einen 8 x 8 mm-Kamerachip optimiert sind.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2012).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10, 877-879 (2013).</li><li>Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+tracking+and+behavioral+measurement.">C. elegans tracking and behavioral measurement.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).</li><li>Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+movement+behavior+of+multiple+worms+on+food.">Tracking movement behavior of multiple worms on food.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in.">High-throughput behavioral analysis in.</a> C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3, e2208 (2008).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).</li><li>Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+hydrogel+microcompartments+for+imaging+sleep-+and+wake-like+behavior+and+nervous+system+development+in+Caenorhabditis+elegans+larvae.">Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).</li><li>Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-microfluidic+methods+for+imaging+live.">Non-microfluidic methods for imaging live.</a> C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , 1-19 (2013).</li><li>Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+microfluidic+system+for+individual+Caenorhabditis+elegans+assay.">Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay.</a> Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).</li><li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies.">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of.</a> C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+mechanosensory+neurons+demonstrates+a+specific+role+for+the+MEC-4+channel+in+the+process+of+gentle+touch+sensation.">In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation.</a> Neuron. 39, 1005-1017 (2003).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage-gated+calcium+channel+subunit+genes+on+calcium+influx+in+cultured+C.+elegans+mechanosensory+neurons.">Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons.</a> Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).</li><li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , 1-13 (2006).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, e198 (2008).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li><li>Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP2+transcription+factor+is+required+for+a+sleep-active+neuron+to+induce+sleep-like+quiescence+in.">An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in.</a> C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Notch+Signaling+Regulates+Adult+Chemosensory+Response+and+Larval+Molting+Quiescence.">C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence.</a> Current Biology. 21, 825-834 (2011).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451, 569-572 (2008).</li><li>Iwanir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+C.+elegans+behavior+during+lethargus:+homeostatic+bout+dynamics,+a+typical+body+posture,+and+regulation+by+a+central+neuron.">The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron.</a> Sleep. 36, 385-395 (2013).</li><li>Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+behavioral+quiescence+in+Caenorhabditis+elegans.">Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. , (2014).</li><li>Nagy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+Caenorhabditis+elegans+larvae+reveals+a+novel+locomotion+switch,+regulated+by+Galphas+signaling.">A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling.</a> eLife. 2, e00782 (2013).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).</li><li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hardware Der Fokus des Mikroskops wird typischerweise während einer Langzeitbildaufnahme driften. Für Durchlichtmikroskope, konzentrieren Buchführung Systeme können von den großen Mikroskophersteller erworben werden. Im Falle einer Verbindung, Mikroskop mit Fokussteuerung ist zu teuer, wäre eine einfache Alternative zu einem Stereomikroskop zu verwenden. Durchlichtmikroskope ermöglichen die Verwendung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur (NA) und kann leicht automatisiert werden. 40X Öl Ziele sind gut geeignet. Wasserimmersionslinsen sind nicht ideal, da der Verdampfung während der Langzeit-Bildgebung. Differentialinterferenzkontrast (DIC) erzeugt einen schönen Kontrast, die morphologische und Verhaltensänderungen zu folgen hilft, aber einfache Hellfeldabbildung kann auch verwendet werden. Für DIC oder Hellfeldabbildung, benutzen rotes Licht, indem Sie einen Rotlichtfilter in die dia-Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops. Für das Scannen von mehreren Mikrokammern ist ein automatisiertes Stufe erforderlich. Die beste Leistung ist achieved, wenn eine Stufe verwendet wird, das nicht-lineare Beschleunigung und Verzögerung hat und kann zu geringen Scan-Geschwindigkeit eingestellt, die Tiere während des Scannens zu stören, um zu verhindern. Wir haben beobachtet, Verhaltensreaktionen oder Calcium Erhöhung mechanosensitive Neuronen (ALM und PLM) während der Abtastung, was darauf hindeutet, dass eine langsame Abtastung in der Tat nicht die mechanosensitive System der Schnecke aktiviert (Daten nicht gezeigt). Kommerzielle LED-Systemen verwendet werden. Mehrere Firmen bieten ready-to-use-Lösungen, die die LEDs mit unterschiedlichen Wellenlängen enthalten. Die LED sollte die Möglichkeit haben, von außen die Auslösung der LED mit einem TTL-Signal. Eine hochempfindliche Kamera ist für Calcium Imaging von bewegten Tieren notwendig. EMCCD- Kameras sind die empfindlichsten Kameras auf dem Markt. Die Kamera braucht, um eine TTL-Ausgang während der Exposition (auch als &quot;Feuer&quot; output) haben. Ein Deckelheizung erforderlich ist, um eine Kondensation auf dem Deckel zu verhindern, wenn unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Auf einem aufrechten Mikroskop, wird die Schale gelegt werden, so dass der Deckel will am Boden und somit Kondensation verhindert und kein Deckel Heizung benötigt wird. Der Deckel muss fest schließen Sie das Gericht um die Verdampfung von Wasser während der langfristige Bildgebung zu verhindern. PDMS-Stempel Die Oberfläche des PDMS-Stempels, der die Struktur zum Formen der Agarose enthält, wird von der Glasplatte, die die PDMS-Stempel unterstützt konfrontiert. Eine Liste mit Unternehmen, die kundenspezifische Mikrofluidik-Chips bieten auf Wikipedia gefunden werden ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Füllen der Nematoden in ihre Kammern Dies ist der wichtigste Schritt im Protokoll und die folgenden Punkte zu beachten: a) Die Feuchtigkeit der Agarose ist von entscheidender Bedeutung für die Übertragung der Würmer und für die Bildgebung. Wenn die Agarose zu feucht ist, dh es ist eine Flüssigkeit covERING eine Fläche von mehreren Mikrokammern, wird es nicht möglich sein, bakterielle Lebens und Würmer in einer gesteuerten Weise zu verteilen, weil die Flüssigkeit macht die Bakterien wegfließen. Wenn die Agarose zu trocken ist, dann die Bakterien und Würmer nicht bekommen können aus dem Pick einfach was bedeutet, dass erhöhter Kraft muss verwendet werden, um die Würmer und Bakterien, die leicht verursacht Schäden an der Agarose fallen werden. Beim Füllen in eine Menge von Würmern die Agarose kann austrocknen. Im schlimmsten Fall wird die Agarose so trocken in dem Ende, das die Kammern zusammenbrechen können. Wenn die Agarose zu trocken ist, kann es durch Anordnen eines kleinen Tropfen (etwa 2 &amp; mgr; l) des S-Basal auf die Seite des Chips, wo es keine Würmer rehydratisiert werden. Dann tauchen Sie den Platindraht holen in die Flüssigkeit zu ziehen und sogar ein Teil der Flüssigkeit in den Bereich, in dem die Kammern mit Würmern gefüllt. B) Die Menge der Nahrung ist entscheidend für die erfolgreiche langfristige Bildgebung. Wenn es nicht genügend Nahrung, können die Würmer aus der sie auszuführen. Bei übermäßigem Essen der Hohlraum der Kammernicht wie eine Flüssigkeit, sondern wie eine feste verhalten und ermöglicht Würmer aus der Kammer, indem die Bakterien zu entkommen. Ziel ist es, eine Bakteriensuspension, die die gesamte Kammer ausfüllt erhalten. Die Würmer sind während des Experiments konstant physischen Kontakt mit dem Agar und Glasoberfläche über den größten Teil ihrer Länge und der kriechenden Verhalten scheint ähnlich wie die Bewegung auf einen Teller und unähnlich in flüssiger Prügel zu sein. C) Mechanische Beschädigung der Agarose kann das Experiment ruinieren. Eine feine Wahl ist wichtig. Es sollte keine scharfen Kanten. Ein weiches Augenwimper an einem Pipettenspitze befestigt werden verwendet, um Bakterien oder Würmer in die Kammern anstelle der Verwendung eines Platin-Pick bewegen. In den meisten Fällen ist jedoch übertrocknete Agarose der Grund für Beschädigungen. Die Pick oder Wimpern sollte im Idealfall nur kaum berühren Sie die Agarose selbst und den Wasserfilm auf der Agarose-Oberfläche sollte Würmer und Bakterien abziehen. Beim Abdichten der Kammern, ist wieder die Feuchtigkeit der Agarose wesentlich. Es sollte nichtwerden jegliche freie Flüssigkeit auf der Agarose-Oberfläche, da dies Bakterien und Würmer während der Versiegelung abzuwaschen. Große Blasen können durch leichtes Anheben an einer Ecke des Agar-Platte entfernt werden. Kleine Blasen, die kleiner als die Kammer erhalten häufig innerhalb der Kammern eingeschlossen sind. Diese Blasen sind kein Problem und wird durch Absorption verschwinden. Nach der Montage der Schale, klicken Sie hier, dass die Agarose ist nicht zu trocken oder zu nass. Die Kammern sollten gut verschlossen sein und es sollte keine Strömung der Flüssigkeit zwischen den Kammern sein. Wenn die Agarose zu nass ist, werden die Kammern nicht richtig abdichten. Worms kann fliehen oder ihre Nahrung weg gewaschen werden. Wenn die Probe zu feucht, einfach öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Agarose trocken für eine Minute oder zwei. Wenn die Agarose zu trocken ist, können die Kammern zusammenbrechen und die Würmer zu entkommen. Aufstockung durch Verkleinern Für Fluoreszenz-Bildgebung, Verkleinern wird durch die geringe Lichtmenge bei niedrigeren Vergrößerungen erhalten begrenzt. Auch EMCCD Kameras sind für die Empfindlichkeit optimiert und haben oft eine relativ geringe Auflösung. , Die Aufstockung der bildgebenden Vierfache ist jedoch ebenfalls möglich. Beispielsweise können vier Kammern von 190 um x 190 um auf einem Frame bei der Verwendung von 140X Vergrößerung (unter Verwendung eines 20x-Objektiv und eine 0,7X Kamerahalterung erreicht) und einem 512 x 512 Pixel, 8 x 8 mm Kamera passen. Eine hochauflösende Kamera mit einem großen Chip (wie sCMOS Kameras, 16,6 mm x 14 mm-Chip, 2560 x 2560 Punkte = 5,5 Megapixel) optimiert die Aufstockung von DIC und Hellfeldabbildung. Zum Beispiel bis zu 30 L1 Würmer in 190 um x 190 um Kammern auf jeder Rahmen dieser Kamera zu passen, wenn unter Verwendung eines 100-facher Vergrößerung (siehe Abbildung 3). Im Prinzip herauszoomen und Scannen kann auch kombiniert werden, um noch größere Zahl von Tieren zu erhalten. Die meisten Neuronen bleiben ganz gut im Fokus, so dass nur eine Brennebene muss abgebildet werden. Wenn Nervenzellen gefunden werden, um aus dem Fokus zu bewegen, AZ-Scan mit einem Piezoantrieb kann zu jedem Zeitpunkt p genommen werdenoint. Anpassung an unterschiedliche Verhaltensweisen Dieses Protokoll gibt eine gute Vorstellung über das Verhalten auf langen Zeitskalen. Offensichtlich ist das Timing der Bursts muss auf unterschiedliche Verhaltensweisen und Lebensabschnitte angepasst werden. EINSCHRÄNKUNGEN DER TECHNIK Verschiedene Faktoren beschränken die Dauer der Bildgebung. Die wichtigste ist die Menge der Nahrung. Sobald die Nahrung konsumiert wird, zu stoppen Larven entwickeln. So wird in kleinen Kammern (190 x 190 um) Würmer zu entwickeln, bis die Phase L3 und dann verhaften. Wenn längere Belichtungszeit erforderlich ist, grßere Kammern verwendet werden. Die maximale Laufzeit der langfristigen Bildgebung ist in dem Bereich von 2,5 - 3 Werktagen. Wenn mehr Bildgebung erforderlich ist, müssen die Würmer zurückgewonnen und in neue Kammern platziert werden. Bei der Abbildung erwachsenen Würmer, wird eine weitere Begrenzung durch die Nachkommen dieser Würmer verursacht. Erwachsenen Würmer legen Eier, aus denen Larven schlüpfen. Diese Larven werden auch in der Kammer bleibenVerbrauchen Nahrung, und kann die Bildanalyse zu stören. Wenn Nachwuchs ein Problem ist, ist eine Lösung, um entweder sterile Erwachsene oder wiederholt setzen die Würmer an die frische Kammern. Würmer zu erholen, wird die Agarose-Platte in die Kammer, das freie mit einem Skalpell geschnitten wird, wird das Deckglas gezogen wird, und wird auf einer NGM Platte, aus der die Schnecken gewonnen werden können platziert. Eine weitere Beschränkung ist die Beschränkung der Schnecken auf relativ kleine Bereiche. Dies kann ein Problem sein, wenn Langstreckenbewegung muss analysiert werden. Während die Tiere in den Kammern mechanisch und optogenetically 21,27,34,35 stimuliert werden, wird die Art des abgedichteten Kammer machen es schwierig, lösliche oder flüchtige Stimulanzien anzuwenden. Biologisch wichtige Gase wie Sauerstoff oder Kohlendioxid, kann frei in den Agar diffundieren. Die große Luftbehälter in die Schale sollte die Gaskonzentrationen in den Kammern im Laufe der Zeit für Experimente benötigt konstant zu halten. Es ist jedoch zu beachten, dass der lokale Sauerstoff concentratio gehalten werdenn in der Kammer kann mehr ähneln die Bedingungen in flüssiger Kultur als Kultur auf der Platte gefunden. Bedeutung in Bezug auf bestehenden Verfahren Mikrofluidischen Bauteilen haben stark fortgeschritten Verhaltens- und Entwicklungs studierte in C. elegans. Oft werden mikrofluidischen Strukturen aus PDMS 12 hergestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung von mikrofluidischen Kulturkammern aus Agarose hergestellt. Die Stärke dieser Technik ist die Kombination von hoher Bildqualität, Korrelation Verhalten physiologische Messungen, Langzeit-Bildgebung und einer angemessen hohen Durchsatz. Hohe Bildqualität wird durch die Abbildung durch das Deckglas mit hoher NA Ziele erreicht. Als Ergebnis kann Fluoreszenzabbildung, wie Calcium-Bildgebung und die konfokale Abbildung subzellulären Strukturen durchgeführt werden. Da die Tiere nicht wie bei anderen Systemen immobilisiert, erlaubt es eine Korrelation Verhalten physiologische Messungen. Because die Tiere haben genügend Nahrung, sie weiter zu entwickeln ermöglicht langfristige Bildgebung. Dieses System kann Bild viele Würmer in einem Durchgang, weil die Tiere, ihre definierte Kammern beschränkt. Somit kann dieses Verfahren leicht bis 9,27,34-36 skaliert werden. Zukünftige Anwendungen Bisher hat dieses System wurde hauptsächlich verwendet, um das Schlafverhalten in C. studieren elegans L1-Larven. Allerdings wird die Anpassung an alle Stufen es ermöglichen, eine Vielzahl von Verhaltensweisen auch dauers und Erwachsene zu studieren. Eine breite Palette von Verhaltensweisen können mit dieser Technik von Paarung Eiablage untersucht werden.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table><tbody><tr><td>High melting point agarose</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP(E)164-1000</td><td></td></tr><tr><td>Top Vision low melting point agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>LED system</td><td>CoolLED</td><td>pE-2</td><td></td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>now sold as iXon Ultra 897</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick</td><td>PDC-23G2</td><td></td></tr><tr><td>Lid heater</td><td>MPI workshop</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Falcon</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Z-stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Nano Scan Z</td><td></td></tr><tr><td>X-Y stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Proscan III</td><td></td></tr><tr><td>PDMS stamp</td><td>Abbott Laboratories</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Red light filter</td><td>Chroma</td><td>ET660/50m</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>Falcon</td><td>Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td><td></td></tr><tr><td>Double sided sticky tape</td><td>Sellotape/Henkel</td><td>double sided 25 mm x 33 m</td><td>alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td></tr></tbody></table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

Verhalten wird durch das Nervensystem gesteuert. Calcium-Bildgebung ist ein einfaches Verfahren, bei dem transparenten Nematode Caenorhabditis elegans, die Aktivität von Neuronen bei verschiedenen Verhaltensweisen zu messen. Mit Verhalten korrelieren neuronale Aktivität, sollte das Tier nicht immobilisiert werden, sondern sollte in der Lage, sich zu bewegen. Viele Verhaltensänderungen während des langen Zeitskalen auftreten und erfordern über viele Stunden des Verhaltens der Aufnahme. Dies macht es auch notwendig, um die Würmer Kultur in Gegenwart von Nahrung. Wie kann Würmer gezüchtet werden und ihre neuronale Aktivität über lange Zeitskalen abgebildet? Agarose Mikrokammer Imaging (AMI) wurde zuvor die Kultur entwickelt und beobachten kleinen Larven und ist jetzt angepasst worden, um alle Lebensphasen von der frühen L1 bis zum Erwachsenenstadium C. studieren elegans. AMI kann auf verschiedenen Lebensphasen einer C durchgeführt werden elegans. Langfristige Kalzium-Imaging ohne Immobilisierung der Tiere durch kurze extern getriggert Belichtungen com erreichtmit einem Elektronenvervielfachungs charge-coupled device (EMCCD) Kameraaufnahme kombiniert. Verkleinern oder Scannen, um die Bild bis zu 40 Würmer in parallel skalieren diese Methode. Somit wird ein Verfahren zur Bildverhalten und die neuronale Aktivität über lange Zeiträume in allen Lebensstadien von C. beschrieben elegans.

Agarose Mikrokammern können zu jeder Lebensphase von C angewendet werden elegans. Wie in 1A zu sehen ist, können Larvenentwicklung und Schlafverhalten während L1 lethargus beachten. Dargestellt sind die Kammergrößen 190 x 190 um, 10 um tief sind. Wenn längeren Zeitskalen erforderlich sind, können größere Kammern verwendet werden. Wie in Figur 1B zu sehen ist, mit einer Kammer mit größeren Abmessungen (370 x 370 um, 25 um tief) erlaubt die Entwicklung von C. elegans vom Ei bis zum erwachsenen. 1C zeigt eine Analyse des Langzeitverhaltensänderungen in Frame Subtraktion einer Schnecke vom Ei bis zum erwachsenen in einer Kammer aufgewachsen. Dargestellt sind mittleren Intensitäten nach Subtraktion Rahmen für ausgewählte Bursts während Gefolge und lethargus. Desto geringer ist die Durchschnittsintensität nach Rahmen Subtraktionswerte ist, desto niedriger die Mobilität des Wurms. Gezeigt, werden von einem Gefolge Zustand und einem Zustand lethargus pro Larvenstadium ausgewählt Burst-Spuren. Diebeobachteten Anstieg der Durchschnittsintensität während der Entwicklung ist vor allem auf einen erhöhten Kontrast und Größe des Tieres. 1D zeigt eine dauer Larve, eine alternative Lebensphase, die bei widrigen Umgebungsbedingungen 33 tätig ist. Kammergröße ist 370 x 370 &amp; mgr; m, 15 &amp; mgr; m tief. Beachten Sie, dass die dauer Larve wurde ohne bakterielle Nahrung in die Kammer eingebracht, die Ausfahrt von der dauer Larvenstadium verursachen würde. 1E zeigt einen erwachsenen Wurm, der bereits viele Eier gelegt hat, in die Kammer. Kammer Abmessungen für den Erwachsenen verwendet wurden, waren 700 x 700 um, 45 um tief. Schließlich zeigt 1F einen erwachsenen Hermaphroditen und ein männliches Gegen Inneren eines Erwachsenen Kammer. Kalzium-Imaging in motile Würmer ist mit GCaMP Calcium-Sensoren möglich. 2A, B zeigen Kalzium-Imaging des Befehls Intern AVA für einen L1-Larve 27. 2C, D Calcium-Aktivität für die sa zeigenme Art von Neuron in einem erwachsenen Tier. Aufstockung der langfristige Bildgebung ist durch Abtasten und durch Zoomen out möglich. 3A zeigt die Bildqualität der gleichzeitigen Darstellung von 30 Würmer auf einem Kamera-Chip mit einer 5-Megapixel-Kamera. 3B zeigt die Bildqualität von 4 Würmer Calcium gleichzeitig abgebildet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Abbildung 1. Die Anpassung der AMI auf alle Lebensphasen von C. elegans. (A) Larve von früh bis früh L1 L2 Phase in 190 x 190 um Kammern abgebildet. (B) Entwicklung vom Ei bis zum erwachsenen in einem 370 x 370 um Kammer. (C) Mobility eines Schnecken bewertet mit Rahmen Subtraktion. Dargestellt ist die mittlere Intensität aller Bilder von der Bildrahmen nach Subtraktion für eine ausgewählte Burst-Film für jeden Larven stage zur Folge und lethargus Verhalten. (D) A dauer Larve in der Abwesenheit von Nahrung in einem 370 x 370 um Kammer. (E) Erwachsene Zwitter mit vielen Eier in eine 700 x 700 um Kammer gelegt. (F) Mating eines Mannes und ein Zwitter in einem 700 x 700 um Kammer. YA bedeutet, jungen Erwachsenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Abbildung 2. Calcium-Bildgebung mit AMI. (A) Calcium-Bildgebung mit GCaMP3 in der Befehlsintern AVA von L1-Larven mit Hilfe der NMR-1-Promotor. Dargestellt sind zwei Falschfarbenbilder. Im linken Bild ist die Aktivität der AVA niedrig und der Wurm nicht einen Rückwärtsbewegung. Im rechten Bild die Aktivität der AVA ist<html> hoch ist, und die Schnecke rückwärts bewegt. (B) Calcium-Transienten über die Zeit für einen L1-Wurm. (C, D) Calcium Transienten bei einem erwachsenen Tier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3. Imaging mehrere Würmer parallel durch Verkleinern. (A) Einzigartige Bilder aus 30 L1 Würmer pro Bild mit 190 x 190 um Kammern und ein 100-facher Vergrößerung (unter Verwendung eines 10X-Objektiv) und eine 16,6 x 14 mm Kamerachip. (B) Gleichzeitiges Abbilden vier L3 Würmer pro Rahmen mit 370 x 370 um Kammern und 100-facher Vergrößerung und einem interessierenden Bereich eines 16,6 x 14 mm Kamera-Chip.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.5K Aufrufe.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

Serie: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Forschung

Biochemie

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurowissenschaften

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Verhalten

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Biotechnik

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Entwicklungsbiologie

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Calcium Imaging: A Method to Visualize Neural Activity in Live C. elegans

Source: Turek, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52742/agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis">Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video introduces the concepts behind calcium imaging and includes an example protocol for time-lapse imaging of worms contained in molded agarose wells.

Calcium Imaging: Eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Aktivität in lebenden C. elegans

Source: Turek, M. et al. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video ...

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video