We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC&#8217;s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children's Foundation.

1. הכנת חומרים בתנאים סטריליים (ראה חומרים וציוד טבלה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 L של חיץ PBS / EDTA בתוספת אלבומין בסרום אדם (HSA) לריכוז סופי של 0.5% (w / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תיק 1 L של נתרן כלורי פתרון קליני כיתה 0.9% (NaCl) ו -2 ליטר של מדיום תרבית תאי הכיתה GMP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 60 ננומול של קוקטייל אנטיגן פפטיד CMV הספציפי על ידי מחדש של בקבוקון אחד של pp65 CMV עם 8 מיליליטר של מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את קוקטייל פפטיד pp65 CMV לתוך שקית הקפאת 50 מיליליטר עוצמת קול באמצעות interconnector / ספייק Luer ומהדק עם נעילת מלקחיים כדי למנוע ההפצה הבאה של קוקטייל לסט צינורות. סט תא פתוח צינורות העשרה (TS 500) בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רתך צינורות סטרילי, להתחבר שקית הקפאת קוקטייל פפטיד לחיבור צינור לשסתום 2 של סט צינורות TS 500. אל תפתח את מהדק תיק קוקטייל פפטיד בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1 x 10 9 TNC ממוצר סלולארי מתחיל ולהשעות במאגר / EDTA PBS המכיל 2.5% HSA להיקף כולל של 50 מיליליטר. להזריק את המוצר הסלולרי לתוך שקית העברה 150 מיליליטר. </li></ol> 2. הכנה ומערכת העשרה סלולארי שימוש באוטומטי (ראה חומרים וציוד טבלה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת העשרת תא (איור 1) ובחר את התכנית &quot;CCS_IFN-γ ההעשרה&quot;. שים לב ממשק משתמש המציג מסכי עם הוראות ותמונות המנחות את המפעיל בהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את &quot;המפעיל&quot; פרמטר ו&quot; Tubing סט P / N לא &quot;. לאחר מכן, להתקין את צינור סט 500 להעשרת תא אוטומטית המכשיר בהתאם להוראות המוצגות על מסך הצג האינטראקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הוראות צעד אחר צעד המוצגות על המסך כדי לחבר את המדיום ומאגרים למכשיר. מספר קטלוג שיא ומספר הרבה ריאגנטים לפני connecting למכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבדיקה הסופית של סט צינורות, לפתוח את המהדק של תיק קוקטייל פפטיד. פתח את התיק הבינוני וליזום תחול אוטומטי של מערכת צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב תחול הושלם, להשלים HSA (2.5%) לחיץ NaCl בשקית המאגר (200 מיליליטר) עם העזרה של רתך צינורות סטרילית. העבר את המוצר הסלולרי מתחיל ל&quot; תיק הבקשה &quot;באמצעות רתך צינורות סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר ריאגנטים CCS (IFNγ) לתוך צינורות המתאימים באמצעות מתאמים. הזן את הזמן מועדף לאסוף חלק של חומר תאי לפני תהליך ההעשרה. סקירה ולוודא את הדיוק של כל הנתונים / פרמטרים נכנסו. התחל את התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת תהליך העשרת תא אוטומטי, להסיר את בקרת איכות התיק (QCB, חלק מקורי (אורי) מכיל כ 1.3 מיליליטר מתוך 100 מיליליטר תוכן תא בדילול עם חיץ / EDTA PBS). חותם את QCB, לשקול, וחנות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל enrichmeתהליך NT. בסופו של התהליך, תאי היעד יהיה eluted עם נפח משוער של חיץ elution משקית המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום ללא סלולארי תיק היעד (NTCB, חלק שלילי = נג) ותא המטרה התיק (TCB, שבריר = pos החיובי) ולשקול כל שקית. המשקולות תשמש מאוחר יותר לחישוב המספרים הסלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הליך ההעשרה לאסוף שני aliquots לחלק לניתוח cytometry זרימה, ולאחסן את שאר הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש aliquot מדגם אחד לקביעת ספירת התאים וaliquot המדגם האחר לניתוח ביצועי העשרה (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות להגדיר מהמכשיר להעשרת תאים. העבר את קובץ היומן לכונן USB לשימוש עתידי. הערה: צריכים להיות מוכנים כל ריאגנטים בתנאים סטריליים. השימוש במכסת מנוע הסוג II בטיחות ביולוגית מומלץ מאוד. להשתמש במוצר יציב apheresis סלולארי (לא מגויס) מבודד מבריאCMV-נגוע מחשבת התורם להעשיר תאי T ספציפיים לאנטיגן CMV. רק FDA מורשה יש להשתמש HSA. החיץ להכנת תא צריך להיות כל הזמן ב19 ° C עד +25 מעלות צלזיוס כפי שטמפרטורות סביבה נמוכות יותר או גבוהות יותר יגרמו לטוהר מופחת ותשואה מופחתת של תאי המטרה. </li></ol> קביעת רוזן 3. סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את aliquots של QCB, NTCB וTCB לספירת תאים כפי שמוצג בטבלה 1. הוספת CD45-VoBlue לכל aliquot (כייל 01:11) ודגירה בחושך במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.5 מיליליטר פתרון תמוגה תא דם אדום מוכן טרי (1x) לחלק המקורי וחלק שלילי, 450 μl פתרון תמוגה תא דם אדום מוכן טרי לחלק החיובי, ודגירה כל השברים במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני הניתוח, להוסיף יודיד propidium לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מיליליטר (1: 100 מיקרוגרם / מיליליטר 100 דילול). להשתמש דלפק תא אוטומטי כדי לקבוע ספירת תאים וצמייכולת. השתמש בתוכנה מומלצת מכשיר דלפק תא לניתוח cytometry זרימה. לקבוע את הספירה האבסולוטית של כדוריות דם לבנות לשברים מקוריים, שליליים וחיוביים. הערה: ספירת התאים של לויקוציטים קיימא לכל מיליליטר של הדגימות שנלקחו לניתוח ספירת תאים נקבעה באמצעות התוכנה מומלצת מנתח תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האזור כפי שמוצג באיור 2 (אזור 5, כדוריות דם לבנות קיימא). השתמש באסטרטגית gating הבאה כדי לקבוע ספירת תאים. יקוציט קיימא בחלק מקורי מוצג באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האזורים שצוינו (איור 2, 1-6) הם היררכי כדלקמן: 1: שער זמן → 2: תאים יחיד → 3: CD45 + תאי → 4: Leukocytes (פסולת נכללה) → 5: לויקוציטים קיימא → 6: ימפוציטים קיימא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותם השלבים כדי לקבוע ספירת תאים לשברים שליליים וחיוביים. לחשב את ספירת התאים של כל החלקעל ידי בהתחשב בגורם diluent של המדגם והנפח כולל של החלק (טבלה 2). </li></ol> 4. בחינת הפרדת הביצועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את aliquots של QCB, NTCB ותאי חלק TCB עם חיץ-מקורר מראש PBS / EDTA / 0.5% בסרום AB. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים בתערובת כתמי 100 μl נוגדן-fluorochrome מכיל: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue ואנטי-IFNγ-PE (כייל 01:11) ו דגירה בחושך במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר פתרון תמוגה תא דם אדום מוכן טרי (1x) ו דגירה במשך 15 דקות ב RT. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant. Resuspend תאי נפח מספק של PBS / EDTA הצפת / 0.5% סרום AB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף יודיד propidium לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​רק לפני הניתוח (1: 100 dilutiעל 100 מיקרוגרם / מיליליטר). לבצע ניתוח תזרים cytometry להעריך את טוהר של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באסטרטגית gating הבאה כדי לחשב את תאי CD3 + T באסטרטגית gating יקוציט קיימא לקביעת תאי CD3 + T מוצגת בחלק חיובי לאחר תהליך העשרת CCS. האזורים שצוינו (איור 3 א ו3B, 1-6) הם היררכי קשורים כדלקמן: 1: שער זמן → 2: תאים יחיד → 3: → לויקוציטים קיימא 6: CD45 + תאי → 4: תאים (פסולת נכללה) → 5 CD3 + תאי קיימא אוכלוסייה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את התדרים של CD4 +, CD8 +, מסוג CD4 + IFN-γ + CD8 + וIFN-γ + תאי T לאחר תהליך העשרת CCS (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באסטרטגית gating כדי לקבוע את התדרים של CD4 +, CD8 +, מסוג CD4 + IFN-γ + CD8 + וIFN-γ + תאי T שמוצגים להלן ואו חלק מקורי ומועשר (שנתפס) חיובי לאחר תהליך CCS. האזורים שצוינו באופן היררכי צמודים ושם כדלקמן: 1: שער זמן → 2: תאים יחיד → 3: → Leukocytes קיימא 6: CD45 + תאי → 4: תאים (פסולת נכללה) → 5 CD3 + תאי קיימא → 7: תאי CD4 + → 7 א: CD4 + IFN-γ + תאים (תיבה) → 8: CD8 + תאי → 8 א: CD8 + IFN-γ + תאים (תיבה) </li></ol> הערה: 6 האזורים שצוינו הראשונים של קישורי ההיררכיה זהים איור 3, (1-6) ואחרון 2 אזורים מוצגות באיור 4 (6-8a).

<ol>
	<li>Syed, B. A., Evans, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Analyst's+Couch+Stem+Cell+Therapy+Market.">From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).</li><li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Immunotherapy+for+Cancer+or+Viruses.">Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses.</a> Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).</li><li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+T+cells+to+target+carbohydrate+to+treat+opportunistic+fungal+infection.">Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).</li><li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).</li><li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+manufacture+of+clinically+appealing+designer+T+cells.">Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells.</a> Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).</li><li>Einsele, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+CMVpp65-peptide+loaded+DCs+to+improve+CMV-specific+T+cell+reconstitution+following+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).</li><li>Blyth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+CMV-specific+T+cells+reduce+the+requirement+for+CMV-directed+pharmacotherapy+after+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).</li><li>Gerdemann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+clinical+efficacy+of+rapidly-generated+trivirus-directed+T+cells+as+treatment+for+adenovirus,+EBV,+and+CMV+infections+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplant.">Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant.</a> Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).</li><li>Meij, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+treatment+of+refractory+CMV+reactivation+after+allogeneic+stem+cell+transplantation+with+in+vitro-generated+CMV+pp65-specific+CD8++T-cell+lines.">Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines.</a> J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).</li><li>Lee Buckler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enal+Razvi,.+Rise+of+Cell-Based+Immunotherapy+:+Personalized+Medicine+Takes+Next+Step+Forward.">Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward.</a> Genetic Engineering &amp; Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).</li><li>Apel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Clinical+Scale+Manufacturing+System+for+Cellular+Products+Derived+by+Magnetic+Cell+Separation,+Centrifugation+and+Cell+Culture.">Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture.</a> Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-Cell+Therapy+of+a+Lung+Transplanted+Patient+with+Severe+CMV+Disease+and+Resistance+to+Antiviral+Therapy.">Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy.</a> Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Feuchtinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+grade+generation+of+hexon-specific+T+cells+for+adoptive+T-cell+transfer+as+a+treatment+of+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).</li><li>Peggs, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+selected+cytomegalovirus-reactive+donor+T+cells+confer+rapid+and+safe+systemic+reconstitution+of+virus-specific+immunity+following+stem+cell+transplantation.">Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation.</a> Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).</li><li>Tischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+clinical-grade+antiviral+T+cells:+selection+of+suitable+T-cell+donors+and+GMP-compliant+manufacturing+of+antiviral+T+cells.">Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).</li><li>Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Costs+after+Allogeneic+Haematopoietic+Sct+Are+Associated+with+Major+Complications+and+Re-Transplantation.">Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).</li><li>Leen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+study+of+banked+third-party+virus-specific+T+cells+to+treat+severe+viral+infections+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).</li></ol>

לשניהם יש מרכז MD Anderson Cancer וד&quot;ר קופר אינטרס כלכלי בZIOPHARM אונקולוגיה, Inc, וחברת Intrexon. ב -7 במאי 2015, ד&quot;ר קופר מונה כמנכ&quot;ל בZIOPHARM אונקולוגיה. ד&quot;ר קופר הוא עכשיו מדען אורח בMD Anderson. ד&quot;ר קופר הקים ומחזיק InCellerate, Inc יש לו פטנטים עם BioSciences Sangamo עם nucleases המלאכותי. הוא מתייעץ עם Targazyme, Inc (תאי גזע בעבר אמריקאים, Inc), GE Healthcare, פרינג תרופות, Therapeutics הגורל, Janssen Pharmaceuticals, ובריסטול-מאיירס סקוויב. הוא במועצה המייעצת המדעית של Cellectis. הוא מקבל שכר טרחה מMiltenyi Biotec.

טיפול T-cell מאמצת התפתח כאפשרות מעשית לטיפול בגידולים ממאירים B-cell 4. הפוטנציאל הטיפולי שלה תלוי ביציקת המספר הרצוי של תאי T ספציפיים לאנטיגן היעד שחסר replicative הזדקנות 2. זו יכולה להיות מושגת על ידי מיון אוכלוסייה טהורה של תאי T ספציפיים לאנטיגן מתאי T התרחבו בע...

השתלת hematopoietic תאי גזע (HSCT) 1 יכולה להיות משולבת עם טיפול T-cell מאמץ כדי לשפר את השפעת השתל נגד גידול ולספק חסינות לזיהומים אופורטוניסטיים 2. דור של תאי T תורם נגזרות אנטיגן ספציפי לעירוי דרש היסטורי אנשים ושימוש במתקנים מיוחדים שGMP תואם מיומנים. המשלוח של תאי T כזה הביא רזולוציה של זיהומים אופורטוניסטים 3, כמו גם טיפול בממאירות בסיס 4. לאחרונה, חוקרים הראו כי העברת המאמצת של כמה אלף רק תאי T וירוס ספציפי (~ 1 x 10 4-2.5 x 10 5 תאים / משקל גוף נמען קילוגרם) יכול לטפל בהצלחה בזיהומים CMV אופורטוניסטיים לאחר אלוגנאית HSCT 5-9. מספר מוגבל של מתקני GMP עם דרישות ייצור מיומנות הקשורים והעלות הגבוהה הקשורים בייצור תאים יש, עם זאת, restrגישה סבלנית icted למבטיח T-cell טיפולים 10. גישה אחת לבידוד תאי T אנטיגן הספציפי מבוססת על CCS באמצעות מגיב דו-ספציפי להכיר CD45 וIFN-γ. כפי שמוצג, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי ליצור תאי T כיתה קלינית CMV ספציפי העסקת מכשיר CCS העשרת תא אוטומטי (איור 1). תאי T CMV ספציפי שנוצרו על ידי דוגרים פפטידים חופפים מאנטיגן pp65 CMV עם תאי leukapheresis כולל גרעיניים (TNC) מתורמים CMV-נגועים מחשבה. פפטידים אלה, מוצגים בהקשר של אנטיגן לויקוציטים האנושי (HLA), להפעיל את תאי T pp65 הספציפי CMV בתוך TNC להפריש IFN-γ. תאי T אלה לאחר מכן ניתן &quot;נתפסו&quot; ונפרדו מגנטיים. הפעולה של המכשיר להעשרת תאי הדור הראשון (איור 1 א) נדרשה כוח אדם מיומן בתרבית תאים בתנאי GMP, ותיאום של צוות לבצע את ים מרובהteps צורך ליצור מוצר &quot;נתפס&quot;. ההליך נדרש בדרך כלל 10 עד 12 שעות של פעולה רציפה, ולכן אנשים סביר צריכים לעבוד על שתי משמרות במתקן GMP. אילוצים אלה כעת בטל על ידי היישום של מכשיר דור שני (מוצג באיור 1). מכשיר זה מתחייב העשרה מגנטית, בדומה למכשיר הדור הראשון, אבל לאוטומטי היבטים אחרים של CCS בגישת unbreached. זה מפחית באופן משמעותי את העומס על צוות GMP כמו רוב השלבים יכולים להתבצע ללא השגחה על ידי צוות. יתר על כן, מאז המכשיר פועל כמערכת סגורה, יכולים להיות שנתפסו תאי T אנטיגן ספציפי ומעובד על benchtop מלבד השלבים כרוכים בבידוד leukapheresis והכנה של חומרים לפני שמתחיל את המכשיר. פרטים של המכשור והפונקציונליות של מכשיר העשרת תאי דור שני זה מלא כבר מסבאותlished 11. כאן, אנו מתארים את הצעדים להעשיר תאי T pp65 הספציפי CMV ממוצר apheresis מצב יציב באמצעות מערכת CCS העשרת תא האוטומטית. ברגע בודד, תאי T CMV ספציפי אלה עשויים להיות חדורים באופן מיידי למטופל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>700-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-097-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L waste bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>110-004-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>279-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (Human) 25%&#160;</td>
			<td>Grifols</td>
			<td>58516-5216-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer/Spike Interconnector</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-018-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl Solution (1 L)</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>170-076-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injections</td>
			<td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td>
			<td>NDC-0409-4887-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLEX GV Filter Unit 0.22 &#956;m&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TexMACS GMP Medium 2 L bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>170-076-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material)</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-018-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoMACS Freezing Bag 50</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>200-074-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Syringes, sterile</td>
			<td>BD, Laagstraat, Temse, Belgium</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV sero positive apheresis product</td>
			<td>Key Biologics, LLC, Memphis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Materials</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Serum, GemCell</td>
			<td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA</td>
			<td>100-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-080-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-APC-Vio770</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-PerCP</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20-PerCP</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-VioBlue</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aIFN-&#947;-PE, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-097-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-091-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Solution (100 &#181;g/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Prodigy Device&#160;</td>
			<td rowspan="2">Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td rowspan="2">200-075-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software V1.0.0.RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10</td>
			<td rowspan="2">Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td rowspan="2">130-096-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5415R&#160;</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer K2</td>
			<td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td>
			<td>LB-001-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubing welder SCDIIB</td>
			<td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated cell enrichment of cytomegalovirus-specific t cells for clinical applications using the cytokine-capture system

העברת המאמצת של תאי T ספציפי לפתוגן יכול לשמש כדי למנוע ולטפל בזיהומים אופורטוניסטים כגון ציטומגלווירוס (CMV) זיהום המתרחשים לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית. תאי T ויראלי הספציפיים מתורמים אלוגנאית, כוללים תורמי צד שלישיים, יכולים להיות מופצים vivo לשעבר בעמידה בפרקטיקת ייצור טובה הנוכחית (cGMP), העסקת סיבובים חוזרים ונשנים של גירוי מונע אנטיגן כדי להפיץ באופן סלקטיבי תאי T רצויים. זיהוי והבידוד של תאי T אנטיגן ספציפי יכולים גם להתבצע על בסיס מערכת לכידת ציטוקינים של תאי T שהופעל להפריש אינטרפרון גאמה (IFN-γ). עם זאת, יישום אנושי נרחב של מערכת לכידת ציטוקינים (CCS) כדי לעזור להחזיר את החסינות הוגבל כתהליך הייצור הוא זמן רב ודורש מפעיל מיומן. הפיתוח של מכשיר להעשרת תאי דור שני כגון CliniMACS Prodigy עכשיומאפשר לחוקרים ליצור תאים נגיפיים ספציפיים T באמצעות מערכת עתירת עבודה אוטומטית, פחות. מכשיר זה מפריד כותרת מגנטית תאים מהתאים ללא תווית באמצעות טכנולוגיית תא מופעלת מגנטית מיון כדי ליצור מוצרים ברמה קלינית, מתוכנן כמערכת סגורה, וניתן לגשת ומופעל על benchtop. אנו מדגימים את הפעולה של מכשיר העשרת תא האוטומטי החדש לייצור תאי T CMV pp65 הספציפי המתקבלים ממוצר apheresis מצב יציב שהתקבל מתורם נגוע מחשבת CMV. תאי T המבודדים אלה לאחר מכן ניתן חדורים ישירות לתוך מטופל תחת פיקוח רגולטורים מוסדי והפדרלי. כל שלבי העיבוד ביו כולל ההסרה של תאי דם אדומים, גירוי של תאי T, תאי הפרדת אנטיגן הספציפי T, הטיהור, והשטיפה אוטומטיים לחלוטין. התקנים כגון זה מעלים את האפשרות שתאי T ליישום אנושי יכולים להיות מיוצרים מחוץ לתרגול ייצור טוב ייעודי (GMP) מתקנים ובמקום להיות מיוצרים במתקני בנקאות דם בו צוות יכול לפקח פרוטוקולים אוטומטיים לייצר מספר רב של מוצרים.

במחקר זה, תא אוטומטי מערכת CCS העשרה שימש לייצור אוטומטי של תאי T pp65 הספציפי CMV. תאי T CMV הספציפי היו מועשרים משלושה מוצרי תא apheresis. מוצר apheresis המצב היציב שנקטף על שעה 2 מתורם CMV-נגוע מחשבה ונוצר 10 10 תאים כולל גרעיניים (TNC). 10 9 TNC אז הופעלו עם פפטידים CMV-נגזר pp65 (60 ננו?...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System at JoVE.com

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

automated-cell-enrichment-cytomegalovirus-specific-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Views.  U.T. MD Anderson Cancer Center. The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Video: Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.