We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC&#8217;s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children's Foundation.

1. إعداد المواد تحت العقيمة شروط (انظر المواد والمعدات الجدول) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3 L من PBS / EDTA العازلة تستكمل مع ألبومين المصل البشري (HSA) إلى تركيز النهائي من 0.5٪ (ث / ت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 L كيس من السريري الصف 0.9٪ كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) حل و2 L من GMP الصف خلية ثقافة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 60 نانومول من CMV محددة الببتيد مستضد كوكتيل خلال إعادة تأسيس قنينة واحدة من CMV pp65 مع 8 مل من الماء المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل CMV pp65 الببتيد الكوكتيل الى تجميد كيس 50 حجم مل باستخدام لور / سبايك interconnector والمشبك مع قفل ملقط لتجنب التوزيع لاحق من الكوكتيل في مجموعة الأنابيب. خلية مفتوحة مجموعة أنابيب التخصيب (TS 500) تحت ظروف معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معقم أنابيب لحام، وربط الببتيد كوكتيل كيس تجميد في اتصال أنبوب صمام 2 من مجموعة أنابيب TS 500. لا تفتح الحقيبة الببتيد كوكتيل المشبك في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1 × 10 9 TNC بدءا من المنتجات الخلوية وتعليق في برنامج تلفزيوني / EDTA العازلة التي تحتوي على 2.5٪ HSA إلى إجمالي حجم 50 مل. حقن المنتج الخلوي في كيس نقل 150 مل. </li></ol> استخدام الآلي نظام خلية إثراء 2. إعداد و(انظر المواد والمعدات الجدول) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل نظام تخصيب الخلية (الشكل 1B) وحدد البرنامج &quot;CCS_IFN-γ التخصيب&quot;. مراقبة واجهة المستخدم تظهر الشاشات مع التعليمات والصور الإرشادية المشغل من خلال هذا الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل المعلمة &quot;المشغل&quot; و &quot;أنابيب مجموعة P / N لا&quot;. المقبل، تثبيت الجهاز الأنابيب مجموعة 500 لتخصيب الخلية الآلي حسب التعليمات التي تظهر على الشاشة التفاعلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع التعليمات خطوة بخطوة المعروضة على الشاشة لربط المتوسطة ومخازن للجهاز. سجل رقم الكتالوج والكثير عدد من الكواشف التي تربط قبلز في الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الاختيار النهائي للمجموعة الأنابيب، وفتح المشبك من كيس الببتيد كوكتيل. فتح الحقيبة المتوسطة والشروع فتيلة التلقائي للمجموعة الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من الخطوة فتيلة، تكملة HSA (2.5٪) إلى كلوريد الصوديوم عازلة في حقيبة الخزان (200 مل) مع مساعدة من أنابيب لحام العقيمة. نقل المنتج الخلوي بدءا في &quot;حقيبة تطبيق&quot; باستخدام أنابيب لحام العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط CCS (IFNγ) الكواشف في أنابيب منها عن طريق المحولات. دخول الوقت المفضل لجمع جزء من المواد الخلوية قبل عملية التخصيب. مراجعة والتحقق من صحة جميع البيانات / دخلت المعلمات. بدء العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بدء عملية تخصيب الخلية الآلي، وإزالة كيس مراقبة الجودة (مصرف قطر المركزي، جزء الأصلي (أوري) يحتوي على حوالي 1.3 مل من أصل 100 المحتوى مل غرفة المخفف مع PBS عازلة / EDTA). ختم مصرف قطر المركزي، وزن، وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء enrichmeعملية الإقليم الشمالي. في نهاية هذه العملية، سيتم مزال الخلايا المستهدفة مع حجم تقريبي من شطف العازلة من الكيس الخزان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم غير المستهدفة خلية حقيبة (NTCB، جزء سلبي = NEG) وحقيبة الخلية المستهدفة (ادارة التعاون الفني، سواء كان إيجابيا جزء = نقاط البيع) وتزن كل كيس. سيتم استخدام الأوزان في وقت لاحق لحساب أعداد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد إجراء تخصيب جمع اثنين قسامات في جزء لتحليل التدفق الخلوي، وتخزين بقية العينات عند 4 درجات مئوية. استخدام أحد قسامة عينة لتحديد عدد الخلايا وغيرها من قسامة عينة لتحليل أداء تخصيب (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنابيب مجموعة من الصك تخصيب الخلية. نقل ملف السجل إلى محرك أقراص USB لاستخدامها في المستقبل. ملاحظة: يجب أن تكون على استعداد جميع الكواشف تحت ظروف معقمة. ينصح بشدة استخدام السلامة الأحيائية نوع II غطاء محرك السيارة. استخدام الحالة المستقرة فصادة المنتجات الخلوية (غير المعبأة) معزولة عن صحيةCMV-مصليا المانحة لإثراء خلايا T معينة CMV المستضد. فقط مرخص FDA HSA ينبغي استخدامها. يجب أن تبقى المخزن المؤقت لإعداد الخلية في +19 درجة مئوية إلى +25 درجة مئوية عن انخفاض أو ارتفاع درجات الحرارة المحيطة سيؤدي إلى خفض النقاء والعائد المخفض للخلايا المستهدفة. </li></ol> 3. خلية عدد تقرير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ aliquots من مصرف قطر المركزي، NTCB وادارة التعاون الفني لعدد الخلايا كما هو مبين في الجدول 1. إضافة CD45-VoBlue لكل قسامة (عيار 01:11)، واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل الطازجة حل الخلية تحلل الدم الحمراء (1X) إلى جزء الأصلي وجزء سلبي، 450 ميكرولتر الطازجة الدم الحمراء حل تحلل الخلية إلى جزء إيجابي، واحتضان جميع الكسور لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل التحليل، إضافة يوديد propidium إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل (1: 100 التخفيف من 100 ميكروغرام / مل). استخدام العداد الخلية التلقائي لتحديد عدد الخلايا والسادسالقدرة. استخدام خلية جهاز مكافحة البرامج الموصى بها لتحليل التدفق الخلوي. تحديد التهم المطلقة من الكريات البيض لكسور الأصلية، السلبية والإيجابية. ملاحظة: يتم تحديد عدد خلايا الكريات البيض قادرة على البقاء في مل من العينات المأخوذة للتحليل عدد خلايا باستخدام محلل خلية البرامج الموصى بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المنطقة كما هو مبين في الشكل 2 (المنطقة 5، الكريات البيض قادرة على البقاء). استخدام استراتيجية النابضة التالية لتحديد عدد الخلايا. ويرد الكريات البيض قادرة على البقاء في جزء الأصلي في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناطق المشار إليها (الشكل 2، 1-6) هي هرميا على النحو التالي: 1: دوام بوابة → 2: خلايا مفردة → 3: CD45 + الخلايا → 4: الكريات البيضاء (الحطام مستبعد) → 5: الكريات البيضاء قابلة للحياة → 6: الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار نفس الخطوات لتحديد عدد الخلايا لكسور السلبية والإيجابية. حساب عدد خلايا الكسر كلهمن خلال النظر في عامل مخفف من العينة والحجم الكلي للجزء (الجدول 2). </li></ol> 4. فحص الأداء الفصل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل aliquots من مصرف قطر المركزي، NTCB وخلايا جزء ادارة التعاون الفني مع برود قبل PBS / EDTA العازلة / 0.5٪ AB المصل. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر الضد تألقي خليط تلطيخ تحتوي CD3-FITC، CD4-APC، CD8-APC-Vio770، CD14-PerCP، CD20-PerCP، CD45-VioBlue ومكافحة IFNγ-PE (عيار 01:11) و احتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل الطازجة حل الخلية تحلل الدم الحمراء (1X)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح طاف. resuspend الخلايا في حجم كاف من PBS / EDTA العازلة / 0.5٪ AB المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة يوديد propidium إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل فقط قبل التحليل (1: 100 dilutiعلى 100 ميكروغرام / مل). أداء التدفق الخلوي تحليل لتقييم نقاء العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام استراتيجية النابضة التالية لحساب الخلايا CD3 + T في استراتيجية قابلة للحياة المحاصرة الكريات البيض لتحديد الخلايا CD3 + T يظهر في جزء إيجابية بعد عملية تخصيب CCS. المناطق المشار إليها (الشكل 3A و 3B، 1-6) ترتبط بشكل هرمي على النحو التالي: 1: دوام بوابة → 2: خلايا مفردة → 3: CD45 + الخلايا → 4: خلايا (الحطام مستبعد) → 5: الكريات البيضاء قابلة للحياة → 6: قابلة للحياة CD3 + الخلايا السكان </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ترددات CD4 +، CD8 +، CD4 + IFN-γ + CD8 + وIFN-γ + خلايا T بعد عملية تخصيب CCS (الجدول 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام استراتيجية النابضة لتحديد ترددات CD4 +، CD8 +، CD4 + IFN-γ + CD8 + وIFN-γ + خلايا T و هو مبين أدناهأو (القبض) جزء إيجابي الأصلي والمخصب بعد عملية CCS. ترتبط هيكليا المناطق المشار إليها واسمه على النحو التالي: 1: دوام بوابة → 2: خلايا مفردة → 3: CD45 + الخلايا → 4: خلايا (الحطام مستبعد) → 5: الكريات البيضاء قابلة للحياة → 6: قابلة للحياة CD3 + الخلايا → 7: CD4 + الخلايا → 7A: CD4 + IFN-γ + الخلايا (مربع) → 8: CD8 + خلايا → 8A: CD8 + IFN-γ + الخلايا (مربع) </li></ol> وتظهر أول 6 المناطق المشار إليها من الروابط التسلسل الهرمي هي نفس الشكل (3)، (1-6) وأخيرا 2 المناطق في الشكل 4 (6-8a): ملاحظة.

<ol>
	<li>Syed, B. A., Evans, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Analyst's+Couch+Stem+Cell+Therapy+Market.">From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).</li><li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Immunotherapy+for+Cancer+or+Viruses.">Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses.</a> Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).</li><li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+T+cells+to+target+carbohydrate+to+treat+opportunistic+fungal+infection.">Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).</li><li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system.">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).</li><li>Kumaresan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+manufacture+of+clinically+appealing+designer+T+cells.">Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells.</a> Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).</li><li>Einsele, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+CMVpp65-peptide+loaded+DCs+to+improve+CMV-specific+T+cell+reconstitution+following+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).</li><li>Blyth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+CMV-specific+T+cells+reduce+the+requirement+for+CMV-directed+pharmacotherapy+after+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).</li><li>Gerdemann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+clinical+efficacy+of+rapidly-generated+trivirus-directed+T+cells+as+treatment+for+adenovirus,+EBV,+and+CMV+infections+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplant.">Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant.</a> Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).</li><li>Meij, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+treatment+of+refractory+CMV+reactivation+after+allogeneic+stem+cell+transplantation+with+in+vitro-generated+CMV+pp65-specific+CD8++T-cell+lines.">Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines.</a> J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).</li><li>Lee Buckler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enal+Razvi,.+Rise+of+Cell-Based+Immunotherapy+:+Personalized+Medicine+Takes+Next+Step+Forward.">Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward.</a> Genetic Engineering &amp; Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).</li><li>Apel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Clinical+Scale+Manufacturing+System+for+Cellular+Products+Derived+by+Magnetic+Cell+Separation,+Centrifugation+and+Cell+Culture.">Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture.</a> Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).</li><li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+T-Cell+Therapy+of+a+Lung+Transplanted+Patient+with+Severe+CMV+Disease+and+Resistance+to+Antiviral+Therapy.">Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy.</a> Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li><li>Feuchtinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+grade+generation+of+hexon-specific+T+cells+for+adoptive+T-cell+transfer+as+a+treatment+of+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).</li><li>Peggs, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+selected+cytomegalovirus-reactive+donor+T+cells+confer+rapid+and+safe+systemic+reconstitution+of+virus-specific+immunity+following+stem+cell+transplantation.">Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation.</a> Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).</li><li>Tischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+clinical-grade+antiviral+T+cells:+selection+of+suitable+T-cell+donors+and+GMP-compliant+manufacturing+of+antiviral+T+cells.">Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).</li><li>Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Costs+after+Allogeneic+Haematopoietic+Sct+Are+Associated+with+Major+Complications+and+Re-Transplantation.">Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).</li><li>Leen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+study+of+banked+third-party+virus-specific+T+cells+to+treat+severe+viral+infections+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).</li></ol>

كل من مركز أندرسون للسرطان، والدكتور كوبر لديهم مصلحة مالية في ZIOPHARM الأورام، وشركة، وشركة Intrexon. في 7 مايو 2015، تم تعيين الدكتور كوبر في منصب الرئيس التنفيذي في ZIOPHARM الأورام. الدكتور كوبر وهو الآن عالم زائر في MD أندرسون. الدكتور كوبر أسس وتمتلك InCellerate، وشركة لديه براءات الاختراع مع Sangamo العلوم البيولوجية مع nucleases الاصطناعية. وقال انه يتشاور مع Targazyme، وشركة (الخلايا الجذعية الأمريكية سابقا، وشركة)، جنرال إلكتريك للرعاية الصحية، فيرينغ Ferring الصيدلة، مصير التداوي، يانسن الصيدلة، وبريستول مايرز سكويب. وهو عضو في المجلس الاستشاري العلمي لCellectis. وقال انه يتلقى الأتعاب من ميلتيني بيوتيك.

وقد برز العلاج T-خلية بالتبني كخيار قابل للتطبيق لعلاج الأورام الخبيثة B-الخلية 4. إمكانات علاجية تعتمد على غرس العدد المطلوب من الخلايا T محددة المستضد الهدف التي تفتقر تنسخي الشيخوخة 2. ويمكن تحقيق ذلك من خلال الفصل بين السكان نقية من خلايا T معينة مستضد من...

للدم زرع الخلايا الجذعية (HSCT) 1 يمكن الجمع بين العلاج T-خلية بالتبني لتحسين الطعم ضد الورم تأثير وتوفير الحصانة للعدوى الانتهازية 2. جيل من الخلايا T-المستمدة المانحة مستضد معين للتسريب قد تطلبت من الناحية التاريخية الموظفين المهرة واستخدام المرافق المتخصصة التي GMP المتوافقة. وقد نتج عن تسليم مثل هذه الخلايا T في القرار من العدوى الانتهازية 3 وكذلك علاج الورم الخبيث الكامن 4. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت المحققين أن نقل بالتبني من بضعة آلاف فقط خلايا T الفيروس محددة (~ 1 × 10 4-2،5 × 10 5 خلايا / كغم من وزن الجسم المتلقي) يمكن علاج الالتهابات الانتهازية CMV بعد خيفي HSCT 5-9 بنجاح. وهناك عدد محدود من مرافق GMP بما يرتبط بها من متطلبات التصنيع الماهرة والتكلفة العالية المرتبطة بإنتاج الخلايا ومع ذلك، فقد restricted وصول المريض إلى اعدا العلاجات T-10 خلية. ويستند نهج واحد لعزل خلايا T مستضد معين على CCS باستخدام كاشف ثنائية محددة للاعتراف CD45 وIFN-γ. كما هو مبين، هذه المنهجية يمكن استخدامها لتوليد السريرية الصف CMV محددة خلايا T توظيف مؤتمت الجهاز CCS تخصيب الخلية (الشكل 1B). يتم إنشاء خلايا T CMV الخاصة التي يحتضنها الببتيدات متداخلة من CMV pp65 المستضد مع مجموع الخلايا فصادة الكريات البيض النووية (TNC) من المانحين CMV-مصليا. هذه الببتيدات، المعروضة في سياق الكريات البيض مستضد البشرية (HLA)، وتفعيل خلايا T CMV pp65 محددة داخل المجلس الوطني الانتقالي لإفراز الإنترفيرون γ. هذه الخلايا T ويمكن بعد ذلك أن &quot;القبض&quot; وفصل مغناطيسيا. تشغيل الجهاز من الجيل الأول لتخصيب الخلية (الشكل 1A) المطلوبة الموظفين المهرة في زراعة الخلايا في ظل ظروف GMP، والتنسيق من الموظفين للقيام ليالي متعددةteps اللازمة لتوليد منتج &quot;القبض&quot;. الإجراء المطلوب عادة 10-12 ساعة من العمل المتواصل، وبالتالي من المرجح الموظفين بحاجة إلى العمل على فترتين في منشأة GMP. ويتجنب هذه القيود الآن من تنفيذ جهاز الجيل الثاني (هو مبين في الشكل 1B). يتعهد هذا الجهاز تخصيب المغناطيسي، مماثل لجهاز الجيل الأول، ولكن بأتمتة جوانب أخرى من قانون الأحوال المدنية في نهج unbreached. هذا يخفف كثيرا من عبء على الفريق GMP لأن معظم الخطوات التي يمكن أن يتحقق دون مراقبة من قبل الموظفين. وعلاوة على ذلك، لأن الجهاز يعمل كنظام مغلق، وخلايا T مستضد معين يمكن الحصول عليها ومعالجتها على الفوق باستثناء الخطوات المتبعة في عزلة فصادة الكريات البيض وإعداد المواد قبل البدء في الصك. وقد حانة تفاصيل الأجهزة كاملة وظيفة هذا الجهاز تخصيب الخلية الجيل الثانيأسسنا 11. هنا، نحن تصف الخطوات لإثراء CMV خلايا T pp65 محددة من منتج فصادة الحالة المستقرة باستخدام نظام CCS تخصيب الخلية الآلي. معزولة مرة واحدة، وهذه الخلايا T-CMV محدد قد غرست مباشرة إلى المريض.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>700-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-097-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 L waste bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>110-004-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma)</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>279-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (Human) 25%&#160;</td>
			<td>Grifols</td>
			<td>58516-5216-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer/Spike Interconnector</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-018-701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 % NaCl Solution (1 L)</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>170-076-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injections</td>
			<td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td>
			<td>NDC-0409-4887-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLEX GV Filter Unit 0.22 &#956;m&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TexMACS GMP Medium 2 L bag</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>170-076-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material)</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-018-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoMACS Freezing Bag 50</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>200-074-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL Syringes, sterile</td>
			<td>BD, Laagstraat, Temse, Belgium</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV sero positive apheresis product</td>
			<td>Key Biologics, LLC, Memphis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Materials</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Serum, GemCell</td>
			<td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA</td>
			<td>100-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-080-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-APC-Vio770</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14-PerCP</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20-PerCP</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-VioBlue</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-098-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aIFN-&#947;-PE, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-097-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-091-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Solution (100 &#181;g/mL)</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td>130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CliniMACS Prodigy Device&#160;</td>
			<td rowspan="2">Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td rowspan="2">200-075-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software V1.0.0.RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer 10</td>
			<td rowspan="2">Miltenyi Biotec GmbH</td>
			<td rowspan="2">130-096-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software 2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5415R&#160;</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellometer K2</td>
			<td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td>
			<td>LB-001-0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tubing welder SCDIIB</td>
			<td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated cell enrichment of cytomegalovirus-specific t cells for clinical applications using the cytokine-capture system

نقل بالتبني من الخلايا T الممرض محددة يمكن استخدامها لمنع وعلاج الأمراض الانتهازية مثل الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى التي تحدث بعد خيفي المكونة للدم زرع الخلايا الجذعية. خلايا T الفيروسية محددة من الجهات المانحة خيفي، بما في ذلك الجهات المانحة طرف ثالث، يمكن نشر السابقين الجسم الحي في الامتثال مع الممارسة الحالية التصنيع الجيدة (المركب)، وتوظيف الجولات المتكررة من التحفيز يحركها مستضد لنشر انتقائي خلايا T المطلوب. ويمكن أيضا أن تضطلع تحديد وعزل الخلايا T مستضد معين بناء على نظام التقاط خلوى الخلايا T التي تم تفعيلها لإفراز الإنترفيرون جاما (IFN-γ). ومع ذلك، التطبيق البشري على نطاق واسع للنظام التقاط خلوى (CCS) للمساعدة في استعادة الحصانة كانت محدودة لأن عملية إنتاج تستغرق وقتا طويلا وتتطلب مشغل المهرة. تطوير جهاز لتخصيب الخلية الجيل الثاني مثل CliniMACS معجزة الآنتمكن المحققون على توليد خلايا T الفيروسية محددة باستخدام، أقل النظام كثيفة العمالة الآلي. هذا الجهاز يفصل صفت مغناطيسيا الخلايا من الخلايا غير المسماة باستخدام المغناطيسية تنشيط الخلايا التكنولوجيا الفرز لتوليد المنتجات السريرية الصف، كما تم تصميم نظام مغلق ويمكن الوصول إليها وتعمل على الفوق. ونحن لشرح تشغيل هذا الجهاز الجديد لتخصيب الخلية الآلي لتصنيع خلايا T pp65 محددة CMV تم الحصول عليها من المنتج فصادة الحالة المستقرة التي تم الحصول عليها من متبرع مصاب بالفيروس المضخم للخلايا. ويمكن بعد ذلك هذه الخلايا T معزولة أن غرست مباشرة إلى المريض تحت الإشراف التنظيمي المؤسسي والاتحادي. كل الخطوات لمعالجة الحيوية بما في ذلك إزالة خلايا الدم الحمراء، ومؤتمتة بالكامل تحفيز خلايا T، وفصل الخلايا مستضد معين T، وتنقية، والغسيل. الأجهزة مثل هذه تثير احتمال أن خلايا T للتطبيق البشري يمكن تصنيعها خارج مخصصة الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) أن تنتج المرافق وبدلا من ذلك في التسهيلات المصرفية الدم حيث يمكن للموظفين الإشراف بروتوكولات الآلي لإنتاج منتجات متعددة.

في هذه الدراسة، تم استخدام خلية الآلي التخصيب نظام CCS لإنتاج الآلي من CMV خلايا T pp65 محددة. تم تخصيب خلايا T CMV محددة من ثلاثة منتجات خلية فصل مكونات الدم. كان حصادها المنتج فصادة الحالة المستقرة أكثر من 2 ساعة من المانحين CMV مصليا ولدت 10 10 مجموع الخلايا النووية (TNC). 10 ...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System at JoVE.com

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

الآلي إثراء خلية من الفيروس المضخم للخلايا محددة خلايا T للتطبيقات السريرية باستخدام نظام خلوى التقاط

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

automated-cell-enrichment-cytomegalovirus-specific-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Views.  U.T. MD Anderson Cancer Center. The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Video: Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.