עבודה זו נתמכה על ידי מענק מCIHR (MOP394808) וקנדה מחקר קתדרה לCMCEWO היה הנמען של מלגת פוסט-בוגר מNSERC.

הערה: פרוטוקול זה הוא רחב תואם עם מודלים שונים מצופה monolayer תא / רקמת תרבות, משטרי טיפול תרופתי, ומטרות תיוג. כך בשימוש בפועל, פרמטרים ספציפיים רבים ישתנו בהתאם לעיצוב ניסיוני. כאן, אזכור של הפרמטרים המוגדרים על ידי משתמש אלה הם גנרי. תנאי דוגמא, כפי שכדי להשיג את תוצאות הנציג, כלולים בכתב נטוי. 1. פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ כביסה ידי ערבוב 0.1M טריס שנאגרו hypertonic (300 מ&quot;מ) ותמיסת מלח 0.05% Polysorbate 20; pH 7.4 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ חסימה. ל0.05 M טריס שנאגרו hypertonic (300 מ&quot;מ) מלוח להוסיף 0.05% Polysorbate 20, 3% הסרום אלבומין שור (BSA) ושל 0.1% ג&#39;לטין עור דג קר ולהתאים את ה- pH 7.4 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן diluent נוגדן ידי הוספת 0.05% Polysorbate 20, BSA 1%, 0.1% ג&#39;לטין עור דג קר ל0.05 M טריס שנאגרו hypertonic (300 מ&quot;מ) מלוח ולהתאים את ה- pH 7.4 ב 4 o C. הערה: pH של מאגרי טריס הוא טמפרטורה תלויה. כלומר, שינוי בטמפרטורה ישנה את ה- pH של התמיסה. לעקביות, מאגרים אלה תמיד צריכים להיות מותאמים pH בטמפרטורה שבה הם ישמשו. </li></ol> תרבות 2. תא הערה: פרוטוקולי תרבות התא מתאימים ישתנו בהתאם לסוג תא (ים) המשמש. נהלים אלה חייבים להיות מותאמים בנפרד. מתודולוגיות תרבית תאים מפורטות זמינות, כולל 16. הליך דומה שימש כדי להשיג את תוצאות הנציג, עם ההבדלים הראויים לציון: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים גרעיני שורש הגבי תרבות מבעלי החיים מבוגרים כפי שתוארו 12. השתמש מדיום גידול המבוגר-נוירון לתרבות התאים. להפחית את צפיפות תאי גלייה ידי preplating, ולא גלוטמט. התוצאה היא תרבות נוירון גליה מעורבת גדלה על coverslips זכוכית 12 העגול עם לפחות 30-60 נוירונים לכל צלחת ותאי גלייה הנלווית גדלה approximatconfluency 40% איליי. יש לציין כי תאי עצב בתרבות עיקרי לא לשכפל ויהיה דחפו את הצלחת על ידי גליה תרבותית משותפת אם גליה מותרת לגדול יתר על המידה. על מנת להימנע המשפיע על תאי העצב, הפחתה פיזית של מספרי גליה עדיפה על שיטות תרופתיות כימיות /. הערה: למטרות פרוטוקול זה, אנו מניחים כי התאים של ריבית גדלו בניסוי-רצוי מדינה ומצופית שכבה. אנו מוצאים כי ציפוי על coverslips זכוכית 12-סיבוב ב 24 צלחות גם להיות נוח ביותר. כל הכרכים והנהלים שתוארו מתאימים לcoverslip אחד ובאחד מצלחת גם 24. </li></ol> 3. טיפול התרופתי של תאים בתרבית הערה: רציף מרובה, או חופף, טיפולים תרופתיים אפשריות. התרופות, מינונים / ריכוזים, ומשכי חשיפת שימוש יהיה תלוי בניסוי הספציפי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום גידול המקורי 16 </sup&gt; ולהחליף אותו עם מדיום המכיל את התרופה (ים) של עניין בריכוז (ים) שנבחר. במקרה זה, להשתמש 10 מיקרומטר של מורפיום solubilized מלוחים או להשתמש מלוח בקרה. הערה: חשוב שכל אחד לשכפל עצמאי (בדרך כלל תרבות צלחת 24 גם יחידה) מכילים את אותו מצב שליטה משותף. זה יאפשר נורמליזציה של נתונים במשכפל, אשר מתקנת לשונות הבין-משפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בתנאי גידול המקורי 16 ל- 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפולים תרופתיים שלאחר מכן, חזור על שלבים 3.1 ו -3.2 עם 1 Deltorphin מיקרומטר, 1 SNC80 מיקרומטר, או רכב ודגירה של 60 דקות 12. Solubilize deltorphin השני במים וsolubilize SNC80 ב 10 מ&quot;מ ב -40 מיקרומטר HCl וsonicate, בדילול מלא עד 1 מ&quot;מ במים. הערה: פרוטוקול זה מניח את התרופה (ים) כבר solubilized כזה שהם יכולים להיות מומסים בריכוז הרצוי (ים) במדיום הגידול שנבחר. נהלים מתאימים לsolubilization כזה ישתנה בהתאם לסמים בשאלה וחייב להיות מותאם בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות, שלוש פעמים, עם ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה לכביסה. לבצע כל לשטוף בעדינות על ידי aspirating הנוזל מהבאר, ואז מייד, ובעדינות, מילוי היטב עם פתרון טרי, כרצוי (במקרה זה עם חיץ כביסה). </li></ol> 4. קיבוע וImmunocytochemistry הערה: מטרות התיוג הספציפיות תשתנה על ידי ניסוי. בשימוש שלנו, אנחנו כותרת קולטנים דלתא אופיואידים (דור) וRab5, 11 ראב, וLAMP1, כפי שנדון. הנוגדנים הספציפיים המשמשים יהיו תלויים בניסוי הספציפי. תנאי תיוג אופטימליים תלויים בנוגדן הספציפי (ies) משמש. דיון מלא יותר של נושא זה הוא בהמשך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי טבילה ב~ 300 paraformaldehyde μl 4% בנאגרו מלוח 0.1 M פוספט במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: חשוב שסעיף 4%פורמלדהיד להיות מוכן טרי בגלל autofluorescence שנגרם על ידי השימוש בparaformaldehyde בעבר-הקפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות, 3 פעמים, עם ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה לכביסה, כפי שתואר ב3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב300 μl חיץ חסימה לשעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם נוגדנים עיקריים ב300 μl של diluent נוגדנים במשך 48 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. בשימוש שלנו, נוגדנים עיקריים נגד דור (ארנב נגד דור) ואחד: Rab5 (עכבר אנטי-Rab5), ראב 11 (עכבר אנטי-Rab11), וLAMP1 (עז נגד LAMP1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות, שלוש פעמים, עם ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה לכביסה, כפי שתואר ב3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם נוגדנים משני מצומדת לfluorophores שונה (ראה דיון בהמשך) ב300 μl של diluent נוגדן עבור שעה 1 ב RT. בזה, וכל השלבים הבאים, להגן על התאים מפני אור. כדי להשיג את תוצאות הנציג, להשתמש ירוק פולטות נגד ארנב fluorophore מצומדות וeithאה אנטי עכבר fluorophore מצומדות פולטות אדום או אנטי-עז fluorophore מצומדות פולטות אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות, 3 פעמים, עם ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה לכביסה, כפי שתואר ב3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslips 12 העגול מ -24 צלחות גם על ידי השארה ~ 1 מיליליטר של חיץ כביסה בכל טוב, מחזיקה את הצלחת ב ~ 45 מעלות, ולמנף את coverslip מעל הרצפה גם באמצעות מלקחיים בסדר. Coverslip יבוא לנוח על הקיר גם, מהמקום שבו יכול בקלות להסיר באמצעות המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips, תא בצד למטה, על שקופיות מיקרוסקופ עם אנטי דהייה הרכבה בינונית. </li></ol> 5. הגדרות מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטרת הגדלה גבוהה (100X), אתר ראשון תא נציג להיות צילם באמצעות epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ההגדרות לכידת תמונה כדי להקליט 8 ביט תמונות TIFF דחוסות של כל ערוץ שכותרתו (לצורך זיהוי של כל fluorophore משמש דוגמא, 488 ננומטר ו -594 ננומטר), לתמונה כל רצף ערוץ (או על ידי קו או מסגרת), ו4-6 סריקות ממוצעת לתמונה הסופית. רזולוציית תמונה אופטימלית תהיה מיקרוסקופ ספציפי, אבל 1024 x 1024 בדרך כלל מניבה תוצאות טובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לנתיב ההדמיה confocal ולהתמקד לZ-מטוס דרך מרכז התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל (בדרך כלל יחידת 1 אוורירי) חריר, כוח הלייזר, ומתח צינור מכפיל (רווח) וקוזז לכל ערוץ. לשמור / להקליט את ההגדרות האלה. השתמש באותן הגדרות מיקרוסקופ הדמיה כל התאים שכותרתו לכל זוג יעד נתון באותו לשכפל. הערה: תהליך זה בדרך כלל יגרום photobleaching די בכך שתא זה לא צריך להיות צילם לניתוח. </li></ol> 6. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטרת הגדלה גבוהה (למשל, 100X), אתר ראשון תא להיות צילם באמצעות epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לנתיב ההדמיה confocal ולהתמקד לZ-מטוס דרך מרכז התא. אניו זמין, זום תוכנת שימוש / יבול כדי להגביל את אזור הסריקה לתא של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות בכל ערוץ שכותרתו באמצעות ההגדרות שנקבעו בעבר. חזור על שלבים 6.1-6.3 לתמונה 15 או יותר תאים לכל מצב ללשכפל כדי להבטיח מדגם מספיק. </li></ol> 7. colocalization ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הזוג של תמונות (לדוגמא, &#39;ירוק&#39; ו &#39;אדום&#39;) של תא בImageJ. השתמש בתמונה&gt; צבע&gt; מיזוג ערוצים ... הפקודה כדי ליצור תמונת RGB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר בחירה סביב התא של עניין. השתמש בתוסף ImageJ &quot;PSC colocalization&quot; (11; זמין מhttps://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) לכמת colocalization של המטרות בתא שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המידה הרצויה colocalization (בדרך כלל r של פירסון 17). חזור על שלבים 7.1-7.3 לכל תא הדמיה. </li></ol&gt; 8. נתונים נורמליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הממוצע של ערכי colocalization המוקלטים של תנאי שליטה המשותפים של כל לשכפל של כל מצב תיוג. הערה: לדוגמא, הממוצע של ערכי colocalization של נוירונים ב&quot; רכב 48 שעות, רכב 60-דק &quot;מצב סמים בכל אחד מ3 משכפל עצמאי בכל אחד מתנאי 3 תיוג (קולטן וכל אחד מתאים 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את האמצעים (-1) להניב לקזז עבור כל לשכפל בכל מצב תיוג. הוסף את הקיזוז לכל לשכפל בכל מצב תיוג לכל ערך colocalization בלשכפל את זה. הערה: זה לנרמל את הנתונים כך שמדד colocalization ממוצע למצב שליטה המשותף הוא 0 בכל אחד לשכפל של כל מצב תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה את הנתונים מכל משכפל של כל תנאי תיוג. הערה: שינויים בcolocalization כעת ניתן לנתח על פני משכפל. אנאלי סטטיסטייסיס יהיה תלוי עיצוב ניסיוני, אבל יהיה בדרך כלל כרוך בניתוח-של-שונות (ANOVA) ואחרי בדיקות מתאימות פוסט הוק (למשל, Tukey). למשאבים סטטיסטיים, ראה, למשל, 18. </li></ol>

<ol>
	<li>Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+G+protein-coupled+receptors.">Trafficking of G protein-coupled receptors.</a> Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).</li><li>Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+GPCRs+by+endocytic+membrane+trafficking+and+its+potential+implications.">Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).</li><li>Hislop, J. N., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+endocytic+trafficking+of+G-protein-coupled+receptors.">Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors.</a> Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).</li><li>Nagi, K., Pi&#241;eyro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptor+signalling:+implications+for+the+development+of+analgesic+tolerance.">Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance.</a> Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).</li><li>Whistler, J. L., Enquist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+postendocytic+sorting+of+G+protein-coupled+receptors.">Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors.</a> Science. 297 (5581), 615-620 (2002).</li><li>Von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptors+by+endocytic+membrane+traffic:+mechanisms+and+translational+implications.">Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications.</a> Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).</li><li>Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromerization+of+the+&#181;-+and+&#948;-opioid+receptors+produces+ligand-biased+antagonism+and+alters+&#181;-receptor+trafficking.">Heteromerization of the &#181;- and &#948;-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters &#181;-receptor trafficking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).</li><li>Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+distribution+of+delta-opioid+receptor+fused+with+various+tags+in+PC12+cells.">Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells.</a> Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).</li><li>Scherrer, G., Tryoen-T&#243;th, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockin+mice+expressing+fluorescent+delta-opioid+receptors+uncover+G+protein-coupled+receptor+dynamics+in+vivo.">Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).</li><li>He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+&#181;-opioid+receptor+activity+by+preventing+&#948;-opioid+receptor-mediated+codegradation.">Facilitation of &#181;-opioid receptor activity by preventing &#948;-opioid receptor-mediated codegradation.</a> Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).</li><li>French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+fluorescent+markers+in+confocal+microscope+images+of+plant+cells.">Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).</li><li>Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+morphine+treatment+alters+&#948;+opioid+receptor+post-internalization+trafficking.">Prolonged morphine treatment alters &#948; opioid receptor post-internalization trafficking.</a> Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4.">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).</li><li>Gupta, A., Mulder, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+abundance+of+opioid+receptor+heteromers+after+chronic+morphine+administration.">Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration.</a> Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Field, A., Miles, J., Field, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2012).</li><li>Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-low+dose+naltrexone+attenuates+chronic+morphine-induced+gliosis+in+rats.">Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats.</a> Mol. Pain. 6, 22 (2010).</li><li>Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+among+various+proteins+as+blocking+agents+for+ELISA+microtiter+plates.">Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates.</a> J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook. , (2010).</li><li>Morris, T. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+immunocytochemical+staining+with+multiple+rabbit+polyclonal+antibodies.">A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies.</a> J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners&#8217;+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners&#8217; guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

יש לנו מותאם פרוטוקול זה לניתוח תרבויות העיקריות של נוירונים גנגליון שורש הגבי בוגרים (תאי עצב תחושתיים ראשוניים). גם זה יכול לשמש, עם שינוי קטן או לא, לתאים בתרבית מצופה monolayer רחב. ניתוח colocalizational ניתן גם בחתכי רקמה והכנות אחרות כגון 11, לעומת זאת רכיבי הטיפול התרופתי וקיבוע רקמה / הכנה לא יהיו מתאימים. של עניין, יכולות לשמש גם שיטות ICC הציגו כאן, עם קיבוע מתאים והכנת רקמה, לבצע אימונוהיסטוכימיה כותרת כפולה בחתכי רקמה, ללא קשר לניתוח שלאחר מכן (למשל, 19). פרוטוקול זה הוא רחב תואם מטרות תיוג שונות. כל coverslip של תאים מצופים יהיה כותרת כפולה. בדרך כלל, זה יהיה לקולטן של ריבית וסמן של אחד מהתאים של עניין. ישיהיו בדרך כלל תנאי תיוג מרובים על מנת לבחון colocalization קולט עם תאים שונים מרובים. נוגדנים הם מטבעו משתנים. פרוטוקולי תיוג מתאימים ישתנו בין נוגדנים שונים. זה כולל ריכוזים מתאימים נוגדן, מתכוני חיץ, ונקודתי זמן. צריך גם לציין שהרבה שונה של אותו הנוגדן נחשבים הטוב ביותר להיות נוגדנים שונים. ככזה, שיטות תיוג וספציפיות נוגדנים צריכים להיות מאומתות, ובמידת הצורך מותאמת, לכל צירוף של רקמת נוגדן והיעד. השיטות המשמשות כאן הן נקודת התחלה שימושית. כאשר אימות תיוג, חשוב לבצע בקרה נאותה: זה כולל דוגמאות מעובד ללא תוספת של נוגדנים משני (לשליטה לautofluorescence) וללא נוגדנים ראשוניים (כדי לשלוט על תיוג המשני שאינו ספציפי). ישנם גורמים רבים המשפיעים עלעיצוב של שיטות תיוג. שיקולי חלק מפתק המשפיע על השיטות שהוצגו כאן כוללים השימוש במאגרי טריס, מלוח hypertonic, Polysorbate, BSA, וג&#39;לטין עור דג הקר. מאגרי פוספט יכולים לגרום לתיוג שאינו ספציפי גבוה יותר ועלולים ליצור אינטראקציה עם כמה conjugates נוגדנים המשמש פחותה. עם זאת, מאגרי טריס הם, כאמור, הטמפרטורה רגישה. ריכוזי מלח hypertonic להפחית תיוג שאינו ספציפי ע&quot;י שיבוש אינטראקציות יוניות. ניתן להגביר עוד יותר את ריכוז מלח מעבר למה שצוין בפרוטוקול זה, אם תרצה בכך. Polysorbate 20 משמש כחומרים פעילי שטח / חומר ניקוי עדין יחסית. זה עדיף על פני Triton X-100, אשר כבר דיווח לשבש באופן משמעותי, או אפילו לפזר, קרומים ובכך לעוות את מבנה subcellular. ההכללה של ריכוז נמוך Polysorbate 20 בכל המאגרים שימושית בהפחתת תיוג שאינו ספציפי, כפי שהוא משפר את היסודיות של שוטף. BSA הוא סוכן חסימה נפוץ מיועדלכבוש אתרי חלבון מחייב שאינם ספציפיים ברקמות היעד. חלקם דיווחו כי BSA יכול לצבור ולהוביל לתיוג punctate שאינה ספציפי. אם בעיה זו מתעוררת, אפשר להחליף BSA עם חלב יבש ללא שומן או ג&#39;לטין עור דג קר נוסף. ג&#39;לטין עור דג הקר הוא מקור חלבון שאינו יונקים גם נועד לכבוש אתרי חלבון שאינו ספציפי מחייב תוך הצגת תגובתיות נמוכה לנוגדנים המכוונים נגד חלבונים יונקים 20. למרות שלא צוין בפרוטוקול זה, זה אופייני להוספה, למאגר החסימה, סרום נורמלי מהמינים שבנוגדנים משני הועלה. ריכוזים אופייניים הם 1-3%. כפי שנראה להלן, טיפול בבחירת מין חייב להיות מופעל כדי למנוע reactivities הצולב. כאשר גילוי שתיים או יותר מטרות fluorescently שכותרתו, הבחירה של שילובי fluorophore המתאימים היא חשובה במיוחד. זה חיוני שיהיה לי SEPA רפאים טובמנה על מנת למנוע crosstalk. יתר על כן, הבחירה של fluorophores תהיה תלויה בתצורה של מיקרוסקופ כדי לשמש (מסננים זמינים, קווי לייזר, וכו &#39;). ספקי נוגדן fluorophore מצומדות יציעו ייעוץ על השילובים הטובים ביותר של המוצרים שלהם (למשל, 21). אנו מוצאים 488 nm- וfluorophores 594 ננומטר-נרגש להיות הזוג הטוב ביותר עבור כפול תיוג וניתוח colocalizational. נוגדנים משני הם בדרך כלל מינים-reactive. כלומר, הם יהיו תווית כל נוגדנים המיוצרים על ידי מיני היעד. ICC פעמיים תיוג לכן דורש שטיפול יש לנקוט בבחירת מין המארח של הנוגדנים הראשוניים ומשניים על מנת להימנע מתגובה צולבת. לדוגמא, אם הפריימריס גדלים בארנב ועז, זה לא יהיה מתאים לשימוש משני-העלה עז. אם זמינות נוגדן אינו מאפשר הפרדת מינים כאלה, יש פרוטוקולים זמינים להשיג תיוג עם multipנוגדנים ראשוניים אותו מארח le (למשל, 22), אם כי יש לצפות באופן משמעותי יותר אופטימיזציה ואימות. כשיטת זו מכמתת colocalization בphotomicrographs, זה הוא ביסוד הכרחי שכל מיקרוסקופיה להיות עקבית, באיכות גבוהה, ובאופן מדויק נציג של הדגימות צילמו. זה כולל גם את החומרה המשמשת (איכות אופטית, וכו &#39;) ונהלים מסוימים ופרמטרים שנבחרו. יש משאבים מעולים זמינים להדרכה במיקרוסקופ המתאים 23,24, כוללים מיקרוסקופיה במיוחד עבור ניתוח colocalizational 11,17,25. למרות עליונות מתודולוגיים רבה לשיטות כיסוי חזותיות, מדדי כמותיים של colocalization לא כמו יפה להשאיל את עצמם לדור של דמויות המחשה לפרסום. דמויות המחשה כאלה הן לעתים קרובות מועילות לקוראים והיעדרם עשוי להיות ביקורת על ידי revieweRS. מצאנו כי הכללת colocalization &#39;heatmaps&#39; חזותי שווא הצבע להיות מועילה בבניית דמויות. תוסף ImageJ &quot;colocalization מפת הצבעים&quot; (זמינים מhttps://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) שימושי ביצירת דימויים אלה. חשוב לציין, עם זאת, כי תמונות אלה יהיו המחשה אך ורק בהקשר של הטכניקה המתוארת כאן.

קולטנים, במיוחד קולטני חלבון G בשילוב (GPCRs), באופן שיגרתי נסחרים intracellularly, ומתא השטח 1. תהליכי complexly מתוזמרים ופיקוח הדוק אלה מכתיבים משלים קולט זמין של התאים ולהסדיר את פעילות קולטן זמנית, הפחתת רגישות, וresensitization 2-4. חשוב לציין, תהליכים אלה מגיבים לסביבות סלולריות כוללים פעילות קולט תוצאת משימוש בסמים או חוסר פעילות. כלומר, הפעולות של ligands בקולטנים יכולות לשנות סחר תאיים של קולטנים אלה, ובכך לשנות את היענות תא. באופן זה, ligands החיצוני להפעיל עוד יותר השפעות על תפקוד תא, אפילו מעבר למפלי שליח למפעיל קלאסיים 5,6. בחינת שינויים בסחר קולט מושרה היא קשה. כל הטכניקות הזמינות כרוכות מגבלות. מבחני הגנת ביוטין שימשו למוניםאוכלוסיות קולטנים משטח טור. קולטנים אלה biotinylated וtimecourse של immunoprecipitations מתבצע לכמת את הירידה בקולטנים biotinylated לאורך זמן. טכניקה זו בעצם עוקבת אחר השפלה ההדרגתית של ראשונית, שכותרתו, אוכלוסייה של קולטנים 7, והוא מאוד שימושי בבניית קורסים של תהליך זה זמן. למרבה הצער, assay זה אינו יכול לפקח על כל תהליך אחר מאשר השפלה של הבריכה המקורית של קולטנים, כגון הפנמה, מחזור, או קולטנים חדשים. כמו כן, התוספת של נוגדנים בטווח 150kDa לקולטן בטווח 50kDa יכולה לשנות הסחר של קולט 8,9, וטכניקה זו עלולה להיות קשה לשימוש עם קולטנים נמוכים ברמת ביטוי. נהלים אחרים להשתמש בשיטות שונות כדי לזהות תאי סחר תאיים (למשל, endosomes, וכו &#39;) ולהעריך colocalization עם קולטנים של עניין. זה כולל אותנודואר של מערכות Heterologous להביע ניאון חלבון מתויג מבני chimeric של קולטנים וסמני תא (GTPases למשל, ראב-המשפחתי). זה פוטנציאל מאפשר שימוש בLive- תא הדמיה, הסרת נושאים הקשורים לקיבעון וpermeabilization. בעוד רב עוצמה, אסטרטגיה כזו סובלת מאותן המגבלות של מערכות Heterologous באופן כללי: השפעות תג ורמת ביטוי בסחר בהתנהגות וחוסר תאימות עם סוגים יותר מבחינה פיזיולוגית נציג תא. יותר עממי, צבעים משמשים לתייג תאים תאיים בקלות (למשל, lysosomes, לכאורה) 10. צבעים, לעומת זאת, יכולים חסרי ייחוד (כל האברונים חומצי במקרה של צבעים לlysosomes) ולא להעריך סחר באמצעות תאים אחרים. ובכל זאת, טכניקות אלו מאפשרות שליטה רבה יותר במערכת ותנאי ניסוי ועשויות להפיק תועלת משיטות ניתוח colocalization שהוצגו כאן, למטה. שיטת wדואר נוכח כאן מזקק את המעקב של סחר קולט ידי colocalization. באמצעות immunocytochemistry (ICC) לתייג סמנים מתאימים, ניתן לזהות תאים תאיים שונים מרובים. זה גם מאפשר השימוש בתרביות תאים ראשוניים מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיות במקום של מערכות Heterologous. פרוטוקול ICC זה כרוך תיקון התאים של עניין לפני התיוג; זה מאפשר תיוג בנקודת זמן ספציפי הבאים טיפול תרופתי (ים). זה מייצר &quot;תמונת מצב&quot; של עמותות קולט-תא העולמיים בנקודת הזמן ש. עם נקודתי זמן מרובים, timecourse של שינויי סחר יכול גם להיות בנוי. בקצרה, התאים שטופל בתרופה, שכותרתו לקולט והתא תאית של עניין, confocally צילם, וphotomicrographs מנותחים לכמת colocalization של קולט ותא 11 מתמטי. בשימוש שלנו, בדקנו את colocalization של קולט עם ראB5, Rab11, וlysosomal הקשורים חלבון הקרום 1 (LAMP1). סמנים אלה לזהות endosomes המוקדם, endosomes מחזור, וlysosomes, בהתאמה. צעדי colocalization אלה פועלים כשליחים לתהליכי העל של הפנמה, מחזור, והשפלה 12. כמו בכל הטכניקות, כמה מגבלות יש לשקול. בשל הצורך לתמונה כל נוירון הבודד ניתח, טכניקה זו יכולה להיות די עתירת עבודה בהתאם למספר התנאים ונקודתי הזמן המעורב. גם כל immunolabeling חייב להתמודד עם ההשפעות על ultrastructure הסלולרי, לוקליזציה חלבון, ונגישות epitope נגרמות על ידי קיבוע וpermeabilization 13. למרות מותאם במקור לשימוש עם תרבויות עיקריות של נוירונים חושיים ראשוניים, שיטה זו היא רחב תואמת עם מודלים תרבות מצופה monolayer אחרים. השימוש בmeasur לכמת באופן מתמטידואר של colocalization הוא, בעיקר, הרבה יותר מאשר מתודולוגית קפדני טכניקות קודמות שימשו להערכת שינויים בסחר בקולט, שלעתים קרובות יש לסמוך על אמצעים מעורפלים, סובייקטיבי כגון שכבות רב-ערוצים חזותי-בדקו 14. טכניקה זו שימושית במיוחד עבור תאימות רחבה עם in vivo התערבויות (לפני דור התרבות העיקרי), במבחנה התערבויות (בצמיחת התרבות), ותיוג שונים מטרות 15. ככזה, הוא יכול להיות מותאם לשאלות מחקר רבות ושונות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

שימוש בטכניקה זו, ניתן לכמת שינויים בסחר בהודעת הפנמת קולטן הבאים שני טיפולים תרופתיים כרוניים / ממושכים וחריפים. לאחר טיפולים תרופתיים, קיבעון, ותיוג, photomicrographs שני ערוצים ברזולוציה גבוהה נלכדים של כל תא של עניין. נציג תמונות עשויות להיות משולבות עם colocalization כוזב בצבע כדי ליצור דמויות המחשה (איור 1). ניתוח colocalizational שלאחר מכן, כפי שתואר, תניב תוצאות כמותיות של colocalization יעד היעד (למשל סמן קולט-תא,). נתונים אלה עשויים לשמש כדי להשוות שינויים ב, במקרה זה, סחר קולט הנגרם על ידי הטיפול התרופתי (ים) (איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52824/52824fig1.jpg" /> איור 1. photomicrographs נציג של תיוג הקולטן ותא-מרקר עם FALמפות colocalization SE-צבע. תרבויות עיקריות של נוירונים חושיים גרעיני שורש הגבי נחשפו לממושך (48 שעות) וטיפולים אקוטיים (שעה 1) סמים (תוויות ציר שמאלית). רק מצב אחד ממושך מוצג תוצאות נציג. התאים אז היו immunolabeled לקולטנים אופיואידים דלתא (דור) וסמן של endosomes המיחזור (ראב 11) עם מובחן עיקרי-תיכוני (fluorophore מצומדות) זוגות נוגדן (תוויות ציר עליונה). התאים היו צילמו על ידי מיקרוסקופ שני ערוצים רציף confocal (עמודה שמאלית, עמודה במרכז). נציג תמונות להראות שתי מטרות שכותרתו בשני תאי עצב. טופל נוירון אחד עם מורפיום הממושך ואחריו רכב חריף (למעלה). טופל נוירון האחר עם מורפיום הממושך אחריו deltorphin החריף השני (delt, אגוניסט דור; תחתון). בנוסף לניתוח הכמותי colocalizational לאחר מכן, תמונות נציג אלה עובדו ליצירת מפות בצבעים המלאכותיים colocalization (עמודה ימנית). sho ברים סולםw 10 מיקרומטר. מעובד מתוך 12 לפי הוראות CC BY-NC 3.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52824/52824fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52824/52824fig2.jpg" /> 2. ציוני colocalization כמותי איור ניתן להשתמש כדי להשוות שינויים בסחר קולט הודעה הפנמה. תרבויות עיקריות של נוירונים חושיים גרעיני שורש הגבי נחשפו לממושך (48 שעות) וטיפולים אקוטיים (שעה 1) סמים (תוויות ציר x). רק מצב אחד ממושך מוצג תוצאות נציג. התאים אז היו immunolabelled לדור וסמנים של endosomes המוקדם, endosomes מחזור, וlysosomes. לאחר עשרות colocalization הדמיה נקבעו, מנורמל, ונקווה על פני 3-4 חזרות עצמאיות. הנתונים נותחו לאחר מכן על ידי ניתוח דו-כיוונית של שונות (ANOVA) עם פוסט הוק-HSD של Tukey. הנתונים מוצגים כמרווח ביטחון +/- 95% ממוצעים. * מציין p &lt;0.05. כפי שניתן לראות, טכניקה זו אפשרה זיהוי של שינויים בסחר בהודעת הפנמה-דור הנגרמים על ידי טיפול אקוטי עם deltorphin השני, אבל לא SNC80 (שני אגוניסטים דור שונים). מעובד מתוך 12 לפי הוראות CC BY-NC 3.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52824/52824fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis at JoVE.com

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational.

מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Google

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  University of California Irvine.  סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational. 

Video: Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

שיווי משקל ניטור שינויים ב-RNA על ידי מבנה &#39;Peroxidative&#39; ו &#39;חמצוני &quot;footprinting רדיקלי הידרוקסיל

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

ניתוח של SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation וסחר בבני אדם תאים

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...