この作品はCMCEWOにCIHR（MOP394808）とカナダの研究の椅子からの助成金によってサポートされていましたNSERCから大学院奨学金の受取人でした。

注：このプロトコルは、様々な単層メッキ細胞/組織培養モデル、薬物治療計画、およびラベリングの対象と広く互換性があります。したがって、実際の使用では、多くの特定のパラメータは、実験計画に基づいて変化します。ここでは、これらのユーザ定義パラメータへの参照は、一般的なものです。代表的な結果を得るために使用される例示的条件は、イタリック体に含まれています。 1.ソリューション<ol><li> 0.1Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水および0.05％ポリソルベート20を混合することにより、洗浄用緩衝液を調製します。 RTでpHを7.4。 </li><li>ブロッキングバッファーを準備します。 0.05 Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水、0.05％ポリソルベート20、3％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.1％冷魚皮ゼラチンを追加し、室温でpHを7.4に調整します。 </li><li> 0.05 Mトリス緩衝高張（300 mM）の生理食塩水に0.05％ポリソルベート20、1％BSA、0.1％冷魚皮ゼラチンを添加することにより、抗体希釈液を調製し、4 O℃でpHを7.4に調整 注：トリス緩衝液のpHは温度依存性です。つまり、温度変化は、溶液のpHが変化し、あります。一貫性を保つため、これらのバッファは常に、それらが使用される温度でpH調整すべきです。 </li></ol> 2.細胞培養注：適切な細胞培養プロトコルが使用される細胞型（単数または複数）に基づいて変化します。これらの手順は、個別に最適化する必要があります。詳細な細胞培養方法は、16を含め、容易に入手可能です。同様の手順は、顕著な違いで、代表的な結果を得るために使用しました。 <ol><li>成体動物由来の培養後根神経節ニューロン12を説明したように。細胞を培養するために、成体ニューロンの増殖培地を使用してください。むしろグルタミン酸よりも、プレプレーティングによってグリア細胞密度を減らします。これは、少なくとも30〜60プレートあたりのニューロンとapproximatに成長に伴うグリア細胞と12ラウンドのガラスカバースリップ上で増殖させた混合ニューロン - グリア培養をもたらしますエリー40％の密集度。これは、初代培養神経細胞は複製されないことに留意すべきであるとグリアを過剰増殖させる場合、共培養グリアによってプレートから離れてプッシュされます。ニューロンへの影響を回避するために、グリア数の物理的減少は、化学的/薬理学的方法に好適です。 注：このプロトコルの目的のために、私たちは目的の細胞は、それらの実験的に所望の状態と単層メッキに成長していることを前提としています。我々は、24ウェルプレートに12ラウンドのガラスカバースリップ上にプレーティングすることは最も便利であることがわかります。記載されているすべてのボリュームおよび手順は、24ウェルプレートの1つのウェル内の1つのカバーガラスに適しています。 </li></ol>培養細胞の3薬物治療注：複数の連続、または重複は、薬物治療が可能です。薬、用量/濃度、および使用される露光の持続時間は、特定の実験に依存することになります。 <ol><li>元の成長培地16を削除</SUP&gt;と選択された濃度（s）で、目的の薬剤（複数可）を含む培地に交換してください。この場合には、モルヒネの10μMの生理食塩水に可溶化またはコントロールとして生理食塩水を使用してください。 注：これは、それぞれ独立して複製（一般に、単一の24ウェルプレート培養）は、同じ共通の制御条件が含まれていることが重要です。これは、試行間の変動を補正する、反復間でのデータの正規化を可能にします。 </li><li> 48時間16元の成長条件で細胞をインキュベートします。 </li><li>その後の薬物治療のために、繰り返しがデルトルフィン1μM、SNC80 1μM、または車両と3.1と3.2のステップと60分12インキュベートします。水にデルトルフィンIIを可溶化し、40μMのHClおよび超音波処理中に10mMでSNC80を可溶化、水中で1 mMのに希​​釈しました。 注意：このプロトコルは、それらが選択された増殖培地中で所望の濃度（複数可）に溶解させてもよいことは、薬剤（単数または複数）は、可溶化されているのを前提としています。のための適切な手順このような可溶化は問題の薬物に依存して変化し、個別に最適化する必要があります。 </li><li> 1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、静かに3回細胞を洗浄します。 （洗浄緩衝液で、この場合には）必要に応じて、静かに、新鮮な溶液とよく補充、ウェルから液体を吸引し、その後速やかに、そして静かにして、各洗浄を行います。 </li></ol> 4.固定および免疫細胞化学注：特定の標識ターゲットは実験により異なります。説明したように私たちの使用時には、我々は、デルタオピオイド受容体（DOR）とRab5の、ラブ11、およびランプ1のラベル。使用される特定の抗体は特定の実験に依存することになります。最適な標識条件は、（IES）が使用される特定の抗体に依存しています。このトピックの多くのより完全な議論は以下の通りです。 <ol><li> 37ºCで10分間〜0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水で300μlの4％パラホルムアルデヒドを浸漬することによって細胞を固定。 注：これは、4％のパラことが重要ですホルムアルデヒドを新たに起因以前に凍結パラホルムアルデヒドの使用によって引き起こされる自家蛍光に調製すること。 </li><li> 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。 </li><li> RTで2時間ブロッキング緩衝液300μlの細胞をインキュベートします。 </li><li> 4ºCで48時間、抗体希釈液300μlの中で一次抗体で細胞をインキュベートします。私達の使用において、一次DORに対する抗体（ウサギ抗DOR）との1：Rab5の（マウス抗Rab5の）、ラブ11（マウス抗Rab11が）、およびLAMP1（ヤギ抗LAMP1）。 </li><li> 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。 </li><li>異なる蛍光体にコンジュゲート二次抗体を用いて細胞をインキュベートし、室温で1時間、抗体希釈液300μlの中（下の説明を参照）。この、およびその後のすべての段階では、光から細胞を保護します。代表的な結果を得るためには、緑色発光蛍光団結合抗ウサギとeithを使用ER赤色発光蛍光団結合抗マウスまたは赤色発光蛍光団結合抗ヤギ。 </li><li> 3.3で説明したように、1回の洗浄あたりの洗浄バッファー〜1mlで、穏やかに3回細胞を洗浄します。 </li><li> 〜45°でプレートを保持し、各ウェル中の洗浄バッファー〜1ミリリットルを残して24ウェルプレートから12ラウンドのカバーガラスを外し、細かい鉗子を使用して、井戸床から離れカバースリップをレバー。カバーガラスは、それが簡単に鉗子を使用して除去することができる場所から、ウェル壁に対して休むようになってきます。 </li><li>退色防止封入剤でスライドする顕微鏡に、カバーガラス、細胞側を下にしてマウントします。 </li></ol> 5.顕微鏡の設定<ol><li>高倍率の対物レンズ（100X）を使用して、最初のエピ蛍光を用いて画像化される代表的なセルを探します。 </li><li> 例えば使用した各蛍光体の検出、488 nmおよび59（ラベル付けされた各チャネルの8ビット非圧縮のTIFF画像を記録する画像キャプチャの設定を行います4 nm）は、各チャンネルを順次画像に（いずれかの行またはフレーム）によって、最終的な画像の平均4〜6スキャンします。最適な画像の解像度は、顕微鏡に固有になりますが、1024×1024は、一般的に良好な結果が得られます。 </li><li>共焦点イメージング経路に切り替えて、セルの中心を通ってz平面に焦点を当てています。 </li><li>ピンホール（典型的には1エアリー単位）、レーザパワー、および光電子増倍管電圧（ゲイン）を最適化し、各チャンネルのオフセット。これらの設定を記録/保存します。同じ複製内の任意のターゲットのペアのために標識され、すべてのセルを画像化するために同じ顕微鏡の設定を使用します。 注：このプロセスは、通常、このセルは、解析のために画像化されるべきではないことに十分な光退色になります。 </li></ol> 6.イメージング<ol><li>高倍率の対物レンズ（ 例えば 、100X）を使用して、最初のエピ蛍光を用いて画像化されるべきセルを探します。 </li><li>共焦点イメージング経路に切り替えて、セルの中心を通ってz平面に焦点を当てています。私利用可能なfは、目的の細胞にスキャン範囲を制限するために、ソフトウェアのズーム/トリミングを使用しています。 </li><li>以前に確立された設定を使用して、各標識されたチャネルのための画像をキャプチャします。繰り返し、十分なサンプルを確保するために、複製ごとの条件当たり6.1から6.3イメージへの15以上の細胞を繰り返します。 </li></ol> 7.共局在解析<ol><li>一対の画像を開きます（ たとえば 、「グリーン」と「赤」）ImageJの中の細胞の。 RGB画像を生成するには、コマンド...&gt;カラー&gt;チャンネルをマージ画像を使用してください。 </li><li>目的の細胞の周囲に選択範囲を描画します。選択したセル内のターゲットの共局在を定量化するために、（https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/から入手できる11）「PSC共局在を「プラグインのImageJを使用してください。 </li><li>目的の共局在尺度（典型的には、ピアソンのR 17）を記録します。繰り返しは、各画像形成されたセルのための7.1から7.3のステップ。 </li></ol&gt; 8.データの正規化<ol><li>各標識条件の各反復の共通の制御条件の記録共局在値の平均を計算します。 注：例えば、ニューロンの共局在値の平均「48時間の車、60分車「3標識条件（受容体と3区画のそれぞれ）のそれぞれに3つの独立した反復のそれぞれにおける薬物条件。 </li><li>それぞれのオフセットを得るために（-1）を乗算する手段は、各標識状態で複製します。その複製の各共局在値に各ラベリング状態で各反復のオフセットを追加します。 注：これは一般的な制御条件の平均共局在の尺度は、各標識条件の各反復で0になるようにデータを正規化します。 </li><li>各標識条件のすべての複製からのデータをプール。 注：共局在の変化は今複製渡って分析することができます。統計肛門ysisは実験計画に依存するが、一般的に、適切な事後検査（ 例えば 、テューキー）が続く（ANOVA）分散分析を伴います。統計的リソースについては、 例えば 、18を参照してください。 </li></ol>

<ol>
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Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4.">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. 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Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

我々は、成人の後根神経節ニューロンの初代培養物（一次感覚ニューロン）の分析のためにこのプロトコルを最適化しました。また、広く、単層メッキ培養細胞について、ほとんど、またはまったく変更することなく、使用することができます。 colocalizational分析しかし、薬物治療、および組織固定/製剤成分は適切ではない、組織切片および他のそのような調製物11も可能です。 <...

受容体、特にGタンパク質共役受容体（GPCR）は、日常的に、細胞表面1から、細胞内トラフィッキングされます。これらの複雑に画策し、厳密に制御プロセスは、細胞の利用可能な受容体の相補体を決定し、受容体の時間的活動、脱感作、および再感作2調節- 4。重要なことに、これらの方法は、薬物誘発性受容体活性または非アクティブを含む細胞環境に応答します。つまり、受容体におけるリガンドのアクションは、それによって細胞の応答性を変化させること、これらの受容体の細胞内輸送を変更することができます。このように、外部のリガンドも、古典的なメッセンジャーツーエフェクターカスケード5,6超え、細胞機能にさらにより効果を発揮します。 誘導された受容体の輸送におけるこのような変化を調べることは困難です。すべての利用可能な技術には制限が伴います。ビオチン保護アッセイは、MONIするために使用されていますTOR表面受容体集団。これらの受容体は、ビオチン化され、免疫沈降の時間経過は、時間をかけて、ビオチン化受容体の減少を定量化するために行われます。この技術は、本質的に受容体7の初期、標識された、人口の緩やかな低下を監視し、このプロセスの時間のコースを構築する上で非常に有用です。残念ながら、このアッセイは、内在、リサイクル、または新規の受容体などの受容体のオリジナルプールの劣化以外のプロセスを監視することができません。また、50kDaの範囲の受容体への150kDaの範囲内の抗体の添加は、受容体のトラフィッキング8,9を変更することができ、この技術は、低発現レベルの受容体で使用することは困難です。 他の手順は、細胞内輸送区画（ 例えば、エンドソームなど）を特定し、目的の受容体との共局在を評価するために様々な方法を使用します。これは、私たちを含みます受容体および区画マーカーの蛍光タンパク質タグ付きキメラ構築物（ 例えば、ラブファミリーGTPアーゼ）を発現する異種系の電子。これは、潜在的に固定および透過処理に関連する問題を除去する、生細胞イメージングの使用を可能にします。複数の生理学的に代表的な細胞型と人身売買の動作と互換性がない上のタグおよび発現レベル効果：強力な一方で、このような戦略は、一般的には、異種システムの同じ制限を受けます。もっと一般に、染料が容易に細胞内区画を標識するために使用される（ 例えば、リソソーム、表向きは）10。染料は、しかし、（リソソームのための染料の場合には、すべての酸性オルガネラ）の特異性を欠くことができ、他の区画を通じて人身売買を評価しません。さらに、これらの技術は、システムおよび実験条件にわたってかなりの制御を可能にし、以下、本明細書に提示共局在分析方法から利益を得ることができます。 w法ここで本eは共局在によって受容体輸送の追跡を洗練します。適切なマーカーを標識するために免疫細胞化学（ICC）を使用して、複数の異なる細胞内区画を同定することが可能です。これはまた、異種システムの代わりに、生理的に関連の初代細胞培養物を使用することができます。このICCプロトコルは、標識の前に目的の細胞を固定することを含みます。これは、薬物治療（単数または複数）は、以下の特定の時点での標識を可能にします。これは、その時点でグローバル受容コンパートメントアソシエーションの「スナップショット」を作成します。複数の時点では、トラフィッキングの変化の時間経過をも構成することができます。 簡単に述べると、細胞を、受容体および興味のある細胞内区画のために標識された薬剤処理し、共焦点画像化され、そして顕微鏡写真は、数学的に、受容体コンパートメント11の共局在化を定量するために分析されています。私達の使用では、Raが、受容体の共局在を調べましたB5、Rab11が、リソソーム関連膜タンパク質1（LAMP1）。これらのマーカーは、それぞれ、初期エンドソーム、リサイクルエンドソーム、およびリソソームを識別します。これらの共局在化対策は内在、リサイクル、分解12の包括的なプロセスのためのプロキシとして機能します。 すべての技術と同様に、いくつかの制限が考慮されるべきです。によるすべての個々のニューロンが解析された画像へのニーズに、この技術は、関連する条件および時点の数に応じて、非常に労働集約的になることができます。すべての免疫標識はまた、固定および透過性13によって引き起こされる細胞の超微細構造、タンパク質の局在化、およびエピトープのアクセシビリティへの影響に対応しなければなりません。 もともと一次感覚ニューロンの初代培養物での使用に最適化しますが、この方法は、他の単層メッキ培養モデルと広く互換性があります。 数学的に定量化さmeasurの使用共局在のeは特に、はるかに方法論的に、多くの場合、視覚的に検査し、マルチチャネルのオーバーレイ14のような漠然とした、主観的な措置に依存してきた受容体輸送の変化を評価するために使用される従来の技術よりも厳格です。 この技術は、（前の初代培養の世代に）in vivoでの介入（培養増殖中）、in vitroでの介入との幅広い互換性のために特に有用であり、種々の標識は15を対象としています。このように、多くの異なった研究課題に適合させることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

この技術を使用して、長時間/慢性および急性の薬物治療の両方を、次の受容体内在化後の輸送の変化を定量化することが可能です。薬物治療、固定、および標識した後に、高解像度の2チャンネルの顕微鏡写真は、興味のある各セルの捕捉されます。代表的な画像は、説明の図（ 図1）を生成する偽色の共局在と組み合わせることができます。その後のcolocalizational分析、説明した...

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Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。

Colocalizational解析による受容体後の内在トラフィッキングにおける薬物誘発性の変更の追跡

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K ビュー.  University of California Irvine. 受容体の輸送は、リガンドへのシグナル伝達と細胞応答を調節し、リガンド誘導シグナル伝達を含む細胞条件に応じて、それ自体です。ここでは、定量的に免疫標識とcolocalizational分析を用いて薬剤誘発性受容体の輸送を評価するための強力で柔軟な技術が記載されています。 

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

生物学

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

環境的に誘導されたフラックスの変化を遺伝

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

&quot;過酸化&quot;と&quot;酸化&quot;ヒドロキシルラジカルフットプリントにより、RNAの構造における均衡の変化を監視する

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

SCAPの分析<em&gt; N</em&gt;ヒト細胞における-glycosylationと人身売買

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

共焦点顕微鏡を使用してトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞におけるアンジオテンシン受容体1a型の人身売買のライブセルイメージングと3D解析

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

共焦点顕微鏡により、リガンド活性化Gタンパク質共役型受容体内在化の検出

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...