وأيد هذا العمل من خلال منحة من CIHR (MOP394808) وكرسي أبحاث كندا لCMCEWO كان المستفيد من منحة الدراسات العليا من NSERC.

ملاحظة: هذا البروتوكول هو متوافق على نطاق واسع مع مختلف النماذج مطلي أحادي الطبقة خلية / زراعة الأنسجة، نظم العلاج من تعاطي المخدرات، وأهداف وصفها. وهكذا في الاستخدام الفعلي، سوف تختلف بناء العديد من المعالم المحددة على التصميم التجريبي. هنا، يشير إلى هذه المعايير المعرفة هي عامة. شروط سبيل المثال، كما تستخدم للحصول على النتائج التمثيلية، وترد بخط مائل. 1. حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد غسل العازلة عن طريق خلط 0.1M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) المالحة و 0.05٪ بوليسوربات 20؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عازلة تمنع. إلى 0.05 M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) المالحة إضافة 0.05٪ بوليسوربات 20، 3٪ مصل بقري الزلال (BSA) و 0.1٪ الأسماك الباردة الجيلاتين الجلد وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة مخفف بإضافة 0.05٪ بوليسوربات 20، 1٪ BSA، 0.1٪ الأسماك الباردة الجيلاتين الجلد إلى 0.05 M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) الملحية وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 في 4 درجة مئوية. ملاحظة: الرقم الهيدروجيني للمخازن تريس هي التي تعتمد على درجة الحرارة. هذا هو، وتغير في درجة الحرارة تغيير الرقم الهيدروجيني للمحلول. من أجل التناسق، وينبغي أن تكون هذه المخازن دائما تعديل درجة الحموضة، في درجة الحرارة التي سيتم استخدامها. </li></ol> 2. خلية ثقافة ملاحظة: تختلف البروتوكولات ثقافة الخلية المناسبة استنادا إلى نوع من الخلايا (ق) المستخدمة. يجب أن يكون الأمثل هذه الإجراءات بشكل منفصل. ومنهجيات زراعة الخلايا مفصلة متاحة بسهولة، بما في ذلك 16. تم استخدام إجراء مماثل للحصول على النتائج التمثيلية، مع اختلافات ملحوظة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الظهرية الخلايا العصبية العقد الجذرية من الحيوانات الكبار كما وصفها 12. استخدام الكبار الخلايا العصبية المتوسطة النمو للثقافة الخلايا. تقليل كثافة الخلايا الدبقية التي كتبها preplating، بدلا من الغلوتامات. هذه النتائج في ثقافة العصبية الدبقية مختلطة نمت على coverslips الزجاج 12 جولة مع لا يقل عن 30-60 الخلايا العصبية في لوحة والمرافق الخلايا الدبقية نمت لapproximatاعل 40٪ confluency. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية في ثقافة الأولية لن تكرر وسيتم دفع الخروج من لوحة كل مثقف شارك الدبقية إذا سمح الدبقية أن تنمو بشكل مفرط. من أجل تجنب التأثير على الخلايا العصبية، والحد المادي للأرقام الدبقية أفضل من الطرق الدوائية الكيميائية /. ملاحظة: لأغراض هذا البروتوكول، ونحن نفترض أن خلايا الفائدة تزرع لالمرجوة منها تجريبيا للدولة ومطلي أحادي الطبقة. نجد أن الطلاء على coverslips الزجاج 12 جولة في 24 لوحات جيدا ليكون الأكثر ملاءمة. كافة وحدات التخزين والإجراءات الموضحة مناسبة للساترة واحد في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا. </li></ol> 3. العلاج من تعاطي المخدرات من الخلايا المستزرعة ملاحظة: متتابعة متعددة، أو تداخل، العلاج بالعقاقير ممكنة. العقاقير، جرعات / تركيزات، وفترات التعرض المستخدمة سيعتمد على تجربة محددة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة النمو الأصلي 16 </سوب&gt; واستبدالها المتوسط ​​تحتوي على المخدرات (ق) من الفائدة في تركيز المختار (ق). في هذه الحالة، استخدم 10 ميكرومتر من المورفين solubilized في المياه المالحة أو استخدام المياه المالحة عن السيطرة. ملاحظة: من المهم أن كل تكرار المستقلة (عموما ثقافة وحة 24 بئر واحدة) تحتوي على نفس حالة سيطرة مشتركة. هذا سوف يسمح تطبيع البيانات عبر مكررات، الذي يصحح للتقلب بين المحاكمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في ظروف النمو الأصلية 16 لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعلاج المخدرات اللاحقة، كرر الخطوات من 3.1 و 3.2 مع Deltorphin 1 ميكرومتر، SNC80 1 ميكرومتر، أو مركبة واحتضان لمدة 60 دقيقة 12. إذابة deltorphin II في الماء وإذابة SNC80 في 10 ملي في 40 ميكرومتر حمض الهيدروكلوريك ويصوتن، المخفف إلى 1 مم في الماء. ملاحظة: هذا البروتوكول يفترض المخدرات (ق) قد تم solubilized بحيث أنها يمكن حله في تركيز المطلوب (ق) في وسط النمو الذي تم اختياره. الإجراءات المناسبة لوتختلف هذه الإذابة اعتمادا على المخدرات في مسألة ويجب أن يكون الأمثل على حدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بلطف، ثلاث مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل. تنفيذ كل غسل بلطف بواسطة الشفط السائل من البئر، ثم على الفور، وبلطف، وإعادة تعبئة بشكل جيد مع حل جديد، كما هو مطلوب (في هذه الحالة مع غسل العازلة). </li></ol> 4. التثبيت وسيتولوجية مناعية ملاحظة: سوف يستهدف وضع العلامات المحددة تختلف من التجربة. في الاستخدام لدينا، وصفت دلتا مستقبلات المواد الأفيونية (DOR) وRab5، راب 11، وLAMP1، كما تمت مناقشته. الأجسام المضادة المحددة المستخدمة سيعتمد على تجربة محددة. شروط وضع العلامات المثلى تعتمد على الأجسام المضادة المحددة (المنشأ) المستخدمة. مناقشة أشمل بكثير من هذا الموضوع أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق الغمر في ~ 300 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: من المهم أن الفقرة 4٪الفورمالديهايد أن طازجة نظرا لتألق ذاتي الناجمة عن استخدام امتصاص العرق سابقا المجمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا برفق، 3 مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في 300 ميكرولتر العازلة حظر لمدة 2 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية في 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة مخفف لمدة 48 ساعة على 4 درجات مئوية. في استخدامنا، الأجسام المضادة الأولية ضد DOR (أرنب مكافحة DOR) واحدة من: Rab5 (الماوس مكافحة Rab5)، راب 11 (الماوس مكافحة Rab11)، وLAMP1 (الماعز المضادة للLAMP1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بلطف، ثلاث مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق fluorophores مختلفة (انظر المناقشة أدناه) في 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة مخفف لمدة 1 ساعة على RT. في هذا، وجميع الخطوات اللاحقة، وحماية الخلايا من الضوء. للحصول على نتائج ممثلة، استخدم الخضراء التي ينبعث منها fluorophore مترافق المضادة للأرنب وإييثإيه انبعاث الأحمر-fluorophore مترافق المضادة للماوس أو انبعاث الأحمر-fluorophore مترافق مكافحة الماعز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا برفق، 3 مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لل coverslips 12 جولة من 24 لوحات جيدة من خلال ترك ~ 1 مل من غسل العازلة في كل بئر، وعقد لوحة في ~ 45º، ورافعة ساترة من خارج الأرض جيدا باستخدام ملقط غرامة. وساترة يأتي للراحة ضد الجدار جيدا، من حيث أنه يمكن بسهولة إزالة باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل لل coverslips، خلية جنبا إلى أسفل، على المجهر الشرائح مع anti-يتلاشى تصاعد المتوسط. </li></ol> 5. إعدادات المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف تضخم عالية (100X)، حدد موقع أول خلية التمثيلية للتصوير باستخدام epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكوين إعدادات التقاط صورة لتسجيل 8 بت صور TIFF مضغوط من كل قناة المسمى (للكشف عن كل fluorophore المستخدمة على سبيل المثال، 488 نانومتر و 594 نانومتر)، لصورة كل بالتتابع قناة (إما عن طريق الإنترنت أو الإطار)، ومتوسط ​​4-6 مسح للصورة النهائية. ودقة وضوح الصورة الأمثل هو المجهر محددة، ولكن 1024 x 1024 عادة ما تعطي نتائج جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى طريق التصوير متحد البؤر والتركيز على ض الطائرة من خلال مركز الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين الثقب (عادة 1 وحدة إيري)، قوة الليزر، وأنبوب مضخم الجهد (ربح) وتعويض لكل قناة. حفظ / تسجيل هذه الإعدادات. استخدام الإعدادات المجهر نفسها لتصوير كل الخلايا المسمى لأي زوج هدف معين في نفس تكرار. ملاحظة: هذه العملية سوف تؤدي عادة في photobleaching من كافية على أن هذه الخلية لا ينبغي أن تصوير لتحليلها. </li></ol> 6. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف تضخم عالية (على سبيل المثال، 100X)، حدد موقع أول خلية للتصوير باستخدام epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى طريق التصوير متحد البؤر والتركيز على ض الطائرة من خلال مركز الخلية. أناو متاح، واستخدام البرامج التكبير / المحاصيل لتقييد منطقة المسح الضوئي إلى الخلية من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور لكل قناة المسمى باستخدام إعدادات إنشاء سابقا. كرر الخطوات من 6،1-6،3 لصورة 15 أو أكثر من الخلايا في حالة تكرار لكل لضمان عينة كافية. </li></ol> 7. تحليل Colocalization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح زوج من الصور (على سبيل المثال، &quot;الأخضر&quot; و &quot;الأحمر&quot;) من خلية في يماغيج. استخدام صورة&gt; اللون&gt; القنوات دمج ... الأمر لتوليد صورة RGB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم التحديد حول خلية من الفائدة. استخدام يماغيج المساعد &quot;PSC Colocalization&quot; (11؛ متاح من https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) لتحديد colocalization من الأهداف في الخلية المحددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل التدبير colocalization المطلوب (عادة ص بيرسون 17). كرر الخطوات من 7،1-7،3 لكل خلية المصورة. </li></ol&gt; 8. بيانات التطبيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب متوسط ​​القيم colocalization المسجلة للظروف سيطرة مشتركة من كل تكرار لكل حالة وصفها. ملاحظة: على سبيل المثال، متوسط ​​القيم colocalization من الخلايا العصبية في &quot;السيارة لمدة 48 ساعة، 60-مين مركبة&quot; حالة المخدرات في كل من 3 مكررات مستقلة في كل من 3 شروط وضع العلامات (مستقبلات وكل من 3 حجرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضاعفة الوسائل التي كتبها (-1) لانتاج الإزاحة لكل تكرار في كل حالة وصفها. إضافة الإزاحة لكل تكرار في كل حالة وضع العلامات على كل قيمة colocalization في ذلك تكرار. ملاحظة: هذا تطبيع البيانات مثل أن متوسط ​​قياس colocalization لحالة سيطرة مشتركة هو 0 في كل تكرار لكل حالة وصفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع البيانات من جميع مكررات لكل حالة وصفها. ملاحظة: يمكن الآن تحليل التغييرات في colocalization عبر مكررات. الشرج الإحصائيسوف يسيس تعتمد على التصميم التجريبي ولكن عادة ما تتضمن تحليل-التباين (ANOVA)، يليه الاختبارات المناسبة بعد خاصة (على سبيل المثال، توكي). على الموارد الإحصائية، انظر على سبيل المثال، 18. </li></ol>

<ol>
	<li>Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+G+protein-coupled+receptors.">Trafficking of G protein-coupled receptors.</a> Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).</li><li>Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+GPCRs+by+endocytic+membrane+trafficking+and+its+potential+implications.">Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).</li><li>Hislop, J. N., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+endocytic+trafficking+of+G-protein-coupled+receptors.">Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors.</a> Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).</li><li>Nagi, K., Pi&#241;eyro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptor+signalling:+implications+for+the+development+of+analgesic+tolerance.">Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance.</a> Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).</li><li>Whistler, J. L., Enquist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+postendocytic+sorting+of+G+protein-coupled+receptors.">Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors.</a> Science. 297 (5581), 615-620 (2002).</li><li>Von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+opioid+receptors+by+endocytic+membrane+traffic:+mechanisms+and+translational+implications.">Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications.</a> Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).</li><li>Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteromerization+of+the+&#181;-+and+&#948;-opioid+receptors+produces+ligand-biased+antagonism+and+alters+&#181;-receptor+trafficking.">Heteromerization of the &#181;- and &#948;-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters &#181;-receptor trafficking.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).</li><li>Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subcellular+distribution+of+delta-opioid+receptor+fused+with+various+tags+in+PC12+cells.">Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells.</a> Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).</li><li>Scherrer, G., Tryoen-T&#243;th, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockin+mice+expressing+fluorescent+delta-opioid+receptors+uncover+G+protein-coupled+receptor+dynamics+in+vivo.">Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).</li><li>He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+&#181;-opioid+receptor+activity+by+preventing+&#948;-opioid+receptor-mediated+codegradation.">Facilitation of &#181;-opioid receptor activity by preventing &#948;-opioid receptor-mediated codegradation.</a> Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).</li><li>French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+fluorescent+markers+in+confocal+microscope+images+of+plant+cells.">Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).</li><li>Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+morphine+treatment+alters+&#948;+opioid+receptor+post-internalization+trafficking.">Prolonged morphine treatment alters &#948; opioid receptor post-internalization trafficking.</a> Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+targeting+of+mu-delta+opioid+receptor+heterodimers+by+RTP4.">Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).</li><li>Gupta, A., Mulder, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+abundance+of+opioid+receptor+heteromers+after+chronic+morphine+administration.">Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration.</a> Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).</li><li>Bolte, S., Cordeli&#232;res, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li><li>Field, A., Miles, J., Field, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2012).</li><li>Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-low+dose+naltrexone+attenuates+chronic+morphine-induced+gliosis+in+rats.">Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats.</a> Mol. Pain. 6, 22 (2010).</li><li>Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+among+various+proteins+as+blocking+agents+for+ELISA+microtiter+plates.">Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates.</a> J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).</li><li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook. , (2010).</li><li>Morris, T. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+immunocytochemical+staining+with+multiple+rabbit+polyclonal+antibodies.">A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies.</a> J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners&#8217;+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners&#8217; guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

لقد الأمثل هذا البروتوكول لتحليل الثقافات الأولية من الكبار الخلايا العصبية عقدة الجذر الظهري (الخلايا العصبية الحسية الأولية). ويمكن أيضا أن تستخدم، مع تعديل طفيف أو لا، لالخلايا المستزرعة مطلي أحادي الطبقة على نطاق واسع. تحليل colocalizational من الممكن أيضا في شرائح الأ?...

المستقبلات، خصوصا G البروتين إلى جانب مستقبلات (GPCRs)، يتم تهريب روتينية داخل الخلية، من وإلى سطح الخلية 1. هذه العمليات المدبرة التعقيد وتفرض رقابة مشددة يكمل مستقبلات المتاحة الخلايا وتنظيم النشاط مستقبلات الزمني، الحساسية، وresensitization 2-4. الأهم من ذلك، هذه العمليات التي تستجيب لبيئات الخلوية بما في ذلك نشاط مستقبلات المخدرات التي يسببها أو الخمول. وهذا هو، لا يمكن للأعمال بروابط في مستقبلات يغير الاتجار داخل الخلايا من تلك المستقبلات، وبالتالي تغيير استجابة الخلية. على هذا النحو، تمارس بروابط خارجية حتى الآن أكثر الآثار على وظيفة الخلية، وحتى أبعد الكلاسيكية رسول إلى المستجيب شلالات 5،6. دراسة مثل هذه التغييرات في الاتجار مستقبلات يسببها أمر صعب. تتضمن كل التقنيات المتاحة القيود. وقد استخدمت المقايسات حماية البيوتين إلى مونيتور مستقبلات سطح السكان. والبيروكسيديز هذه المستقبلات ويتم تنفيذ timecourse من immunoprecipitations لقياس انخفاض مستقبلات المعقدة البيروكسيديز مع مرور الوقت. هذه التقنية ترصد أساسا تدهور تدريجي من الأولي، وصفت والسكان مستقبلات 7، ومفيد جدا في بناء دورات الزمني لهذه العملية. للأسف، هذا الاختبار غير قادر على رصد أي عملية أخرى من تدهور تجمع الأصلي من المستقبلات، مثل استيعاب وإعادة التدوير، أو مستقبلات جديدة. أيضا، إضافة إلى الأجسام المضادة في نطاق 150kDa إلى مستقبلات في نطاق 50kDa يمكن أن يغير الاتجار مستقبلات في 8،9، ويمكن أن يكون من الصعب استخدام مع مستقبلات منخفضة على مستوى التعبير هذه التقنية. استخدام الإجراءات غيرها من وسائل مختلفة لتحديد الأجزاء الاتجار داخل الخلايا (على سبيل المثال، الإندوسومات، الخ)، وتقييم colocalization مع مستقبلات الفائدة. وهذا يشمل الولايات المتحدة(ه) من أنظمة مغاير معربا عن الفلورسنت البروتين الموسومة يبني خيالية من المستقبلات وعلامات مقصورة (GTPases على سبيل المثال، رب الأسرة). هذا يحتمل أن يتيح استخدام التصوير الخلية الحية، وإزالة القضايا المتعلقة تثبيت وpermeabilization. في حين قوية، تعاني هذه الاستراتيجية من نفس القيود المفروضة على أنظمة مغاير بشكل عام: العلامة ومستوى التعبير الآثار المترتبة على الاتجار السلوك وعدم التوافق مع أنواع الخلايا أكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية. أكثر شعبيا، وتستخدم الأصباغ لتسمية بسهولة حجرات داخل الخلايا (مثل الجسيمات الحالة، ظاهريا) 10. الأصباغ، ومع ذلك، يمكن تفتقر إلى الدقة (جميع العضيات الحمضية في حالة من الأصباغ لالجسيمات الحالة) وليس لتقييم الاتجار بالبشر من خلال المقصورات الأخرى. ومع ذلك، هذه التقنيات تتيح سيطرة كبيرة على النظام والظروف التجريبية، ويمكن الاستفادة من طرق التحليل colocalization المقدمة هنا أدناه. طريقة ثالبريد الحاضرين هنا تهذب تتبع الاتجار مستقبلات التي كتبها colocalization. باستخدام مناعية (ICC) لتسمية علامات المناسبة، فمن الممكن تحديد عدة حجرات داخل الخلايا متميزة. هذا أيضا يسمح باستخدام زراعة الخلايا الأولية من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة في مكان نظم مغاير. ويشمل هذا البروتوكول ICC تحديد خلايا الفائدة قبل وضع العلامات. هذا يسمح وضع العلامات في timepoint المحددة التالية العلاج من تعاطي المخدرات (ق). وهذا ينتج عنه &#39;لقطة&#39; من الجمعيات مستقبلات مقصورة العالمية في ذلك timepoint. مع timepoints متعددة، timecourse التغيرات الاتجار يمكن أيضا أن يتم بناؤها. لفترة وجيزة، والخلايا هي المخدرات المعالجة، وصفت لمستقبلات وحجرة داخل الخلايا من الفائدة، تصوير confocally، ويتم تحليل photomicrographs لتحديد رياضيا colocalization من مستقبلات والمقصورة 11. في استخدامنا، درسنا colocalization من مستقبلات مع رعB5، Rab11، والليزوزومية المرتبطة بروتين الغشاء 1 (LAMP1). هذه علامات تحديد الإندوسومات في وقت مبكر، الإندوسومات إعادة التدوير، والجسيمات الحالة، على التوالي. تعمل هذه التدابير colocalization كوكلاء للعمليات الشاملة للاستيعاب، وإعادة التدوير، وتدهور 12. كما هو الحال مع جميع التقنيات، وينبغي النظر في بعض القيود. نظرا للحاجة إلى صورة حللت كل الخلايا العصبية الفردية، ويمكن هذا الأسلوب أصبح جدا كثيفة العمالة وفقا لعدد من الشروط وtimepoints المعنية. يجب على جميع immunolabeling أيضا يتعامل مع الآثار المترتبة على التركيب الدقيق الخلوية، وبروتين التعريب، وحاتمة الوصول الناجمة عن التثبيت وpermeabilization 13. على الرغم الأمثل أصلا للاستخدام مع الثقافات الأولية من الخلايا العصبية الحسية الأولية، وهذا الأسلوب هو متوافق على نطاق واسع مع غيرها من نماذج الثقافة مطلي أحادي الطبقة. استخدام قياس آثافة كميا رياضيا(ه) من colocalization هو، ولا سيما، أكثر بكثير منهجيا دقيقا من التقنيات السابقة المستخدمة لتقييم التغيرات الاتجار مستقبلات، والتي غالبا ما تعتمد على وتدابير غامضة غير موضوعية مثل تفقد البصر تراكب متعدد القنوات (14). هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتوافق واسع مع التدخلات في الجسم الحي (قبل جيل ثقافة الأساسي)، في المختبر التدخلات (خلال نمو ثقافة)، ومختلف العلامات تستهدف 15. على هذا النحو، فإنه يمكن تكييفها للعديد من الأسئلة البحثية المختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7041-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">720084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 circle Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td align="right">1254580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua/Poly-Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00380-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-DOR antibody</td>
			<td>MyBioSource</td>
			<td>MBS316175</td>
			<td>Used at 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab5 antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7904</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Rab11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-853</td>
			<td>Used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-LAMP1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC8098</td>
			<td>Used at 1:750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21206</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11058</td>
			<td>Used at 1:200 to 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drug-induced changes in receptor post-internalization trafficking by colocalizational analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

باستخدام هذه التقنية، فمن الممكن لقياس التغيرات في مستقبلات الاتجار بعد استيعاب التالية كلا المزمنة / لفترات طويلة وحادة العلاج بالعقاقير. بعد العلاج بالعقاقير، التثبيت، ووضع العلامات، ويتم التقاط عالية الدقة photomicrographs ثنائي القناة من كل خلية من الفائدة. ويمكن الجم...

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis at JoVE.com

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

الاتجار مستقبلات الإشارات وينظم الخلايا على الاستجابة للجين وهو، في حد ذاته، استجابة لظروف الخلية، بما في ذلك الناجم عن يجند الإشارات. هنا، نحن تصف تقنية قوية ومرنة لتقييم كمي الاتجار مستقبلات المخدرات التي يسببها استخدام immunolabeling وتحليل colocalizational.

تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

tracking-drug-induced-changes-receptor-post-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  University of California Irvine.  الاتجار مستقبلات الإشارات وينظم الخلايا على الاستجابة للجين وهو، في حد ذاته، استجابة لظروف الخلية، بما في ذلك الناجم عن يجند الإشارات. هنا، نحن تصف تقنية قوية ومرنة لتقييم كمي الاتجار مستقبلات المخدرات التي يسببها استخدام immunolabeling وتحليل ...

Video: Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

تتبع المسار Engraftment العضلات في الحيوانات الصغيرة من قبل في فيفو نيون التصوير

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also associated with these genomic changes are heritable phenotypic variations 1,2. The flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain inducible (under the control conditions), or become stably modified to either the large or small genotroph by growth under high or low nutrient conditions respectively. The lines resulting from the initial growth under each of these conditions appear to grow better when grown under the same conditions in subsequent generations, notably the Pl line grows best under the control treatment indicating that the plants growing under both the high and low nutrients are under stress. One of the genomic changes that are associated with the induction of heritable changes is the appearance of an insertion element (LIS-1) 3, 4 while the plants are growing under the nutrient stress. With respect to this insertion event, the flax variety Stormont Cirrus (Pl) when grown under three different nutrient conditions can either remain unchanged (under the control conditions), have the insertion appear in all the plants (under low nutrients) and have this transmitted to the next generation, or have the insertion (or parts of it) appear but not be transmitted through generations (under high nutrients) 4. The frequency of the appearance of this insertion indicates that it is under positive selection, which is also consistent with the growth response in subsequent generations. Leaves or meristems harvested at various stages of growth are used for DNA and RNA isolation. The RNA is used to identify variation in expression associated with the various growth environments and/or t he presence/absence of LIS-1. The isolated DNA is used to identify those plants in which the insertion has occurred.

Growing some flax varieties under nutrient stress results in genomic variation within a subset of the genome and phenotypic variation. A complex insertion at a specific site is associated with growth under various nutrient regimes and with changes in gene expression around this site.

المستحثة بيئيا توريثه التغييرات في كتان

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

التغييرات في هيكل رصد التوازن الحمض النووي الريبي ل &#39;Peroxidative&#39; و &#39;مؤكسد&#39; Footprinting الهيدروكسيل

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

تحليل سكاب<em&gt; N</em&gt; -glycosylation والاتجار في الخلايا البشرية

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

يعيش التصوير خلية وتحليل 3D من أنجيوتنسين مستقبلات نوع 1A الاتجار في خلايا الكلى Transfected الجنينية البشرية عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.

This protocol describes confocal microscopy detection of G protein-coupled receptor (GPCR) internalization in mammalian cells. It includes the basic cell culture, transfection, and confocal microscopy procedure and provides an efficient and easily interpretable method to detect the subcellular localization and internalization of fusion-expressed GPCR.

الكشف عن تنشيط يجند G-إلى جانب البروتين مستقبلات التطبع التي كتبها متحد البؤر المجهري

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

في الوقت الحقيقي في فيفو تتبع الثيموسيه في الغرفة الأمامية للعين بالليزر الفحص المجهري

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...